Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của bacillus clausii

Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis……….23 3.2.1.. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

giáo DS Lê Ng ọc Khánh, người đã luôn động viên, hướng dẫn tôi trong thời

tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, dìu dắt tôi trong suốt

luôn động viên và giúp đỡ tôi trong cuộc sống và học tập

Hà N ội, ngày 21 tháng 05 năm 2013

Sinh viên

MAM CHANDARA

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH M ỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 6

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 7

1.1.Vi khuẩn Bacillus……… 7

1.1.1 Giới thiệu về chi Bacillus ………7

1.1.2 Vị trí phân loại……….7

1.1.3 Đặc điểm vi khuản Bacillus………7

1.1.4 Bào tử và khả năng hình thành bào tử……… 8

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus……… 10

1.2 Giới thiệu về Bacillus clausii……….11

1.2.1 Đặc điểm sinh thái sinh lý của Bacillus clausii………11

1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii………14

1.3 Các phương pháp nuôi cấy………16

CHƯƠNG 2: : NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị……….…… ………17

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất……… 17

2.1.2 Máy móc, thiết bị………….………….……….… ……… 17

2.1.3 Môi trường sử dụng……… 17

2.2 Nội dung nghiên cứu……… …….18

2.2.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii………18

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí để thu sinh khối………….18

2.3 Phương pháp nghiên cứu……… 18

2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina………18

2.3.2 Giữ giống trên thạch nghiêng……… 18

2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống……….19

2.3.4 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác nhau … … … 1 9 2.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả năng tăng sinh khối ………19

2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối ……….20

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 21

3.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii………21

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis……….23

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh v ới Bacillus subtilis……… 23

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của Bacillus clausii ……….28

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… ……….32

DANH M ỤC BẢNG

điểm khác nhau

Bacillus clausii ở nhiệt độ 370

C

Bacillus subtilis ở nhiệt độ 370

DANH M ỤC HÌNH

clausii theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 370

C

subtilis theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 370

C

subtilis ở các tốc độ lắc khác nhau tại 370

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong đường ruột của con người có sự hiện diện rất lớn của hệ vi sinh

tác động xấu cho cơ thể như hình thành các chất gây hoại tử ruột, các chất gây

clausii kháng đa kháng sinh, và do sử dụng dạng bào tử nên vi khuẩn qua dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả Tuy

khối dưới dạng bào tử của vi khuẩn Bacillus clausii” được thực hiện nhằm

dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus

1.1.1 Giới thiệu về chi Bacillus

được gọi là trực khuẩn Chi Bacillus gồm rất nhiều loài đã được biết đến như:

Bacillus subtilis, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus globigii, Bacillus natto, Bacillus clausii [15]

được phân lập trong các môi trường khác nhau, từ đất, nước, không khí, côn trùng và con người

1.1.2 V ị trí phân loại

edition,

Bacillales, l ớp Bacilli, ngành Firmicutes trong giới vi khuẩn

Bacillus có mối quan hệ họ hàng với một số loại vi khuẩn không hình thành

1.1.3 Đặc điểm vi khuẩn Bacillus

động, hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, hầu hết có phản ứng catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron trong quá trình trao đổi

 Về dinh dưỡng và sinh trưởng, Bacillus có thể sử dụng các hợp chất

nhau, dao động từ 2-11

1.1.4 Bào tử và khả năng hình thành bào tử

Hình 1.1 Bào tử Bacillus subtilis Hình 1.2 Bào tử Bacillus anthracis

- ADN được bao bọc hoàn toàn bằng màng tế bào chất, thành bào tử (nha bào) được hình thành và một phần vỏ cũng được hoàn thành

Hình 1.3 Quá trình hình thành bào tử của Bacillus clausii

Hình 1.4 C ấu tạo bào tử

Tế bào sinh dưỡng

Sự phát triển của áo bào

Áo bào tử Bào tử tự do

Tế bào mẹ

Áo trong bào tử

Vỏ bào tử

Màng tế bào Thành tế bào

Lõi Màng ngoài

Áo ngoài bào tử

- Vỏ bao chứa thành phần hóa học là protein, hydratcarbon, lipid, peptidoglycan và calci dipicolinat

1.1.5 Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus

con người, đó là Bacillus anthracis gây bệnh than và Bacillus cereus gây ngộ độc thực phẩm Nhưng mặt khác, vi khuẩn Bacillus có rất nhiều ứng dụng

trong đời sống

trường

megatherium, Bacillus lichenliformis (chế phẩm Biochie) ứng dụng trong xử

lý nước nuôi thủy sản, có tác dụng giảm lượng bùn hữu cơ, cải thiện môi trường nước

- Sản phẩm từ Bacillus subtilis có tác dụng hỗ trợ cây trồng, bổ sung

dinh dưỡng cho đất qua chu kỳ cacbon và chu kỳ nitơ của vi sinh vật, đồng

1.2 Giới thiệu về Bacillus clausii

1.2.1 Đặc điểm sinh thái sinh sinh lý của Bacillus clausii

Bacillus clausii chủ yếu phân bố ở nhiều nơi nhưng chủ yếu là trong đất,

- Đặc điểm hình thái

Bacillus clausii có hình que đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi, là vi

Bacillus clausii có kích thước chiều rộng 1-2µm, chiều dài 5µm [9]

đó 4096 là protein mã hóa và mã hóa cho 96 RNA

C, Bacillus

clausii ATCC 31084 có nhiệt độ tối ưu là 37o

C…[6], [11]

claussii KSM-K16 có pH tối ưu là 9,0 [11]

khác nhau như: glucose, galactose, mannose, sorbitol, 2-ketogluconat…;

Hình 1.5 Bacillus clausii trên môi trường đặc

thành nitrit

- Bào tử và khả năng tạo bào tử

Trong điều kiện không thuận lợi, Bacillus clausii hình thành nội bào tử

(endospore) theo cơ chế và cấu trúc bào tử gồm nhiều lớp vỏ bọc bền vững

kích thước 1,01±0,13 x 0,57± 0,05 μm [12]

Hình 1.6 Bào tử Bacillus clausii dưới kính hiển vi điện tử

1.2.2 Ứng dụng của Bacillus clausii

Bacillus clausii có hai ứng dụng quan trọng đó là: sản xuất enzym và sản

Bacillus clausii có khả năng sản xuất nhiều loại enzym như: xylanase,

protease Đây là nhóm enzym quan trọng, chiếm gần 60% tổng doanh số các

dưới 2 dạng: dạng huyền dịch trong ống nhựa (2 tỷ bào tử trong 5ml) và dạng

các trường hợp:

Bacillus clausii có khả năng kháng kháng sinh, do đó khi sử dụng kháng

phẩm sử dụng dạng bào tử vi khuẩn nên có nhiều ưu điểm là vi khuẩn qua dược dạ dày với tỷ lệ sống sót cao và điều trị rối loạn tiêu hóa hiệu quả

Hình 1.7 Ch ế phẩm Enterogermina

novobiocin và rifampicin, T kháng tetracycline, SIN kháng streptomycin và neomycin [17]

Enterum

Hình 1.8 Ch ế phẩm Erceflora Hình 1.9 Chế phẩm Bazivic

1.3 Các phương pháp nuôi cấy vi sinh vật

Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm Khi nuôi nấm mốc phát

đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men-misô) đã được nấu chín trộn hạt

Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia

trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu [2]

trong đa số trường hợp là tinh bột Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng

trường hợp đường hoá sơ bộ tinh bột trước khi thanh trùng Khi đó đường maltose được tạo thành là chất cảm ứng tốt, môi trường thường giảm độ nhớt

chìm đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT,

2.1 Nguyên li ệu, hóa chất, thiết bị

2.1.1 Nguyên li ệu, hóa chất

Đầu côn, cân kỹ thuật, bình nón, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, que trang,

2.1.3 Môi trường sử dụng

Môi trường canh thang Môi trường thạch thường

Hóa ch ất Kh ối lượng (g) Hóa chất Kh ối lượng (g)

2.2 N ội dung nghiên cứu

2.2.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii

2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh

khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh

khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối

Bacillus clausii và so sánh v ới Bacillus subtilis

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hoạt hóa giống từ chế phẩm Enterogermina

Pha 50 ml môi trường canh thang trong bình nón dung tích 250ml, đậy

trường

Đối với Bacillus subtilis tiến hành cấy giống từ thạch nghiêng và nuôi

2.3.2 Giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch thường, đun sôi cho đồng nhất các thành phần trong môi trường, chia ra các ống nghiệm, mỗi ống 6ml, nút kín, hấp tiệt trùng

ở 1atm trong 15 phút Để nguội bớt rồi đặt nghiêng Dùng que cấy vô trùng,

Định kỳ 2 tháng cấy truyền giống nhằm giữ hoạt tính vi khuẩn

Đối với Bacillus subtilis tiến hành tương tự với Bacillus clausii

2.3.3 Chuẩn bị dịch nhân giống

C trong 24h

Đối với Bacillus subtilis, tiến hành tương tự với Bacillus clausii.

2.3.4 Phương pháp xây dựng đường cong sinh trưởng xác định lượng sinh khối ướt trong dịch lên men của Bacillus clausii tại thời điểm khác

nhau

Bacillus clausii vào môi trường đã chuẩn bị, đem lắc ở 370

C, 150 vòng/phút

2.3.5 P hương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí lên khả năng tăng sinh khối

ở tốc độ 4000 vòng/phút trong 15 - 20 phút Xác định lượng sinh khối ướt

2.3.6 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Bacillus clausii

Bacillus clausii cho các thí nghiệm tiếp theo

điểm khác nhau (16h, 24h, 40h, 48h, 64h, 72h, 88h, 96h), ly tâm dịch lên men

Bảng 3.1 Lượng sinh khối thu được của Bacillus clausii tại các thời điểm

khác nhau

Lượng sinh khối (g) 0,84 0,98 1,10 1,09 1,02 0,97 0,92 0,92

Chênh l ệnh sinh khối

(%) so v ới thời điểm

24h

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

lượng sinh khối của B clausii tăng dần theo thời gian Lượng sinh khối thu

được lớn nhất là 1,10g tại thời điểm 40h (lớn hơn 12% so với 24h) Kể từ giờ

điểm 24 – 36h đầu Theo một công bố khác của Nguyễn Thị Hiền [4], bào tử

điểm 40h bắt đầu giảm dần so với giá trị lớn nhất cũng có thể được giải thích

Hơn nữa, cũng theo Nguyễn Thị Hiền [4], nếu có phương pháp xử lý phù

lượng bào tử lớn nhất được đưa về khảo sát điều kiện để thu được lượng sinh

88

khối lớn nhất Đối chiếu với kết quả ở bảng 3.1 cho thấy, lượng sinh khối thu được tại thời điểm 40h là nhiều nhất, sau 40h một lượng sinh khối đã chuyển

3.2 Kh ảo sát ảnh hưởng của điều kiện cấp khí và nhiệt độ để thu sinh

khối dưới dạng bào tử của Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

3.2.1 Kh ảo sát ảnh hưởng của chế độ cấp khí lên khả năng tăng sinh khối Bacillus clausii và so sánh với Bacillus subtilis

Bacillus nói riêng, lưu lượng khí cung cấp trong quá trình nuôi cấy đóng vai

thu được lượng bào tử nhiều nhất được đưa về khảo sát điều kiện tạo sinh

Bacillus subtilis (là ch ủng vi khuẩn Bacillus phổ biến) tại cùng điều kiện

24h

Ly tâm dịch sau khi lên men 24h, thu cắn (4000 vòng/phút trong 15 - 20

B ảng 3.2 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của

Bacillus clausii ở nhiệt độ 37 0

C Tốc độ lắc

- Nhận xét

Bacillus clausii cũng tăng, lượng sinh khối đạt cực đại là 0,78g ở tốc độ lắc

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên khả năng tăng sinh khối của

Bacillus subtilis ở nhiệt độ 37 0

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn biến thiên lượng sinh khối của Bacillus subtilis

theo tốc độ lắc ở nhiệt độ 37 0

C

điều kiện khí cũng tương tự với Bacillus clausii Khi tốc độ lắc tăng, sinh

Bảng 3.4 So sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis ở

Tốc độ 150 vòng/phút

Tốc độ 200 vòng/phút

Hình 3.4 Đồ thị so sánh sinh khối giữa Bacillus clausii và Bacillus subtilis

ở các tốc độ lắc khác nhau tại 37 0

C

hơn Bacillus subtilis Tuy nhiên sự chênh lệnh này là không nhiều Trong khi

đó với tốc độ lắc 200 vòng/phút, lượng sinh khối Bacillus clausii lại ít hơn

Như vậy đối với Bacillus clausii, khi độ cấp khí thay đổi từ 100 – 200

và 200 vòng/phút không đáng kể Do đó độ lắc 150 vòng/phút được chọn cho

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng tăng sinh khối của

Bacillus clausii

clausii và so sánh v ới Bacillus subtilis

khối ướt bằng cách cân cắn thu được Thí nghiệm được tiến hành 3 lần độc lập

- Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.5

Bảng 3.5 Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ

30 0 C và 37 0 C của Bacillus clausii

L ần 1 L ần 2 L ần 3 Trung Bình

Chênh l ệnh lượng sinh khối giữa 2 nhiệt độ (%) 10,5

Hình 3.5 Đồ thị biến thiên lượng sinh khối của Bacillus clausii

ở nhiệt độ 30 0

C và 37 0 C

- Nhận xét

C

C Bacillus

Lần thí nghiệm

clausii trong nghiên cứu phát triển thuận lợi Kết quả này phù hợp với nhiệt

Đối với Bacillus subtilis khi tiến hành như thí nghiệm trên, kết quả

được trình bày ở bảng 3.6 và hình 3.6

B ảng 3.6 Lượng sinh khối thu được ở nhiệt độ

30 0 C và 37 0 C của Bacillus subtilis

L ần 1 L ần 2 L ần 3 Trung Bình

Chênh l ệnh lượng sinh khối giữa 2 nhiệt độ (%) 28,3

ở nhiệt độ 30 0

C và 37 0 C Lần thí nghiệm

Kết quả ở bảng 3.6 cho thấy lượng sinh khối của Bacillus subtilis thu

C cao

clausii

Bảng 3.7 So sánh khả năng tăng sinh khối ở nhiệt độ 30 0

C và 37 0 C của Bacillus clausii và Bacillus subtilis

Bacillus clausii 0,84 0,76 Bacillus subtilis 0,95 0,74

Chênh lệnh lượng sinh khối

gi ữa 2 chủng VSV (%)

Bacillus clausii ít hơn lượng sinh khối của Bacillus subtilis 13,1% Như vậy,

K ẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1 K ết luận

đến 96h Lượng sinh khối thu được lớn nhất là 1,10g tại thời điểm 40h, tuy

dưỡng, đã lựa chọn được thời điểm để thu sinh khối cho các thí nghiệm là 24h

đến lượng sinh khối của Bacillus clausii Lựa chọn được tốc độ lắc 150

lượng sinh khối ở 200 vòng/phút và cao hơn so với khi lắc ở 100 vòng/phút

2 Kiên ngh ị:

dưỡng ảnh hưởng đến sinh khối

TÀI LI ỆU THAM KHẢO

Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 06-11

khu ẩn Bacillus clausii, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ khóa 07-12

subtilis tái t ổ hợp làm nguyên liệu thuốc chủng ngừa qua niêm mạc, Luận án

Ti ếng Anh

6 A.A Denizci, D Kazan, E.C.A Abeln, and A Erarslan Newly isolated

Bacillus clausii GMBAE 42: an alkaline protease producer capable to grow

under higly alkaline conditions Journal of Applied Microbiology 2004 Volume 96 p 320–327

7 N K Asha Devil, K Balakrishan, R Gopal and S Padmavathyl

(2008), “Bacillus clausii MB9 from the east coast regions of India: Isolation, biochemical characterization an antimicrobial potentials”, Current science,

vol 95, pp 627-635

Erarslan (2005), “Purification and characterization of a serine alkaline

protease from Bacillus clausii GMBAE 42”, Microbiol Biotechnol, vol 32,

pp 335–344