Nghiên cứu áp dụng phương pháp anthrone để xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN MAI LINH NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ANTHRONE ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOGEN TRONG GAN CHUỘT (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHÓA 2001-2006) Người hướng dẫn: Ths.Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện: Thời gian: Bộ môn Hóa sinh Trường Đại Học Dược Hà Nội Tháng 05/2005 đến 05/2006 Hà Nội, tháng 05 năm 2006. _ _ LỜI CẢM ƠN Tôi xỉn bày tỏ lời cảm ơn chân thành tói Thạc sĩ Phùng Thanh Hương - Giảng viên bộ môn Hóa sinh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận. Tôi xỉn gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô đã cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tâp tại trường. Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi của các thầy cô và các kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Dược Hà Nội dành cho tôi trong qúa trình học tập và thực hiện khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân và bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôỉ trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Hà nội, tháng 5 năm 2006 Sinh viên: Nguyễn Mai Lỉnh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦNI TỔNG QUAN 3 1.1 GLYCOGEN 3 1.1.1 Cấu trúc 4 1.1.2 Chức năng 4 1.1.3 Tính chất 4 1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật 5 1.2 NHỮNG BÁT THƯỜNG TRONG CHỮYEN HÓA GLYCOGEN 10 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCOGEN 15 1.3.1 Phương pháp tách glycogen ra khỏi mô để định lượng 15 1.3.2 Định lượng trực tiếp glycogen trong mô 17 PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Hóachất7 T 20 2.1.3 Máy móc thí nghiệm 21 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 24 2.2.1 Xây dựng đường chuẩn giữa nồng độ glucose và mật độ quang24 2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng glycogen trong mô gan chuột 25 2.2.3 So sánh với phương pháp chiết tách glycogen bằng kiềm : 29 2.2.4 Xác định tính lặp lại của phương pháp 30 2.2.5 Xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột bình thường 32 2.2.6 Xem xét mức độ tổng họp glycogen từ glucose ngoại sinh 32 2.3 BÀN LUẬN . 7. .7. 34 PHẦN III KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 DANH SÁCH NHỮNG CHỮ VIÉT TẮT GIP Glucose - 1 - phosphat G6P Glucose - 6 - phosphat TCA Acid tricloacetic TPNH Dạng khử của triphosphopyridin nucleotid TPN^ Dạng oxy hóa của triphosphopyridin nucleotid UDPG Uridine diphosphate glucose ƯTP Uridine triphosphate ĐẶT VẤN ĐÈ • Hiện nay bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid ngày càng phát triển, trong đó bệnh đái tháo đường đang ở giai đoạn bùng nổ dịch tễ trên phạm vi toàn cầu. Để chẩn đoán và đánh giá hiệu quả điều trị của những bệnh này, cần phải phân tích được các chỉ số hóa sinh liên quan. Glycogen là dạng dự trữ chính của glucid ở hầu hết mọi tế bào. ở gan, sự thoái hóa glycogen không chỉ để cung cấp glucose cho bản thân tổ chức này mà còn tạo một lượng lớn glucose cung cấp cho máu ngoại biên đi nuôi các tổ chức khác. Vì vậy, ngoài vai trò dự trữ, glycogen ở gan còn có ý nghĩa quan trọng trong điều hòa đường huyết, ở tổ chức cơ, khi tế bào phải hoạt động mạnh và kéo dài, sự tiêu hao năng lượng đòi hỏi phải được cung cấp một lượng lớn glucose. Ngoài nguồn glucose do máu mang đến, glycogen dự trữ ở cơ phải được thoái hoá rất mạnh để tạo thành glucose cho quá trình đốt cháy ở cơ [2,5]. Do đó glycogen là một chỉ số hóa sinh quan trọng, đánh giá được hàm lượng glycogen là một chỉ tiêu trong quá trình chẩn đoán những bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid, đặc biệt là những bệnh rối loạn dự trữ glycogen. Mặt khác việc nghiên cứu các thuốc điều trị ngày càng trở nên cấp thiết. Muốn đánh giá hiệu quả, tìm hiểu tác dụng cũng như cơ chế của những thuốc đã, đang và sẽ sử dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hóa glucid, việc xác định các chỉ số hóa sinh liên quan là rất cần thiết. Trong đó glycogen là một chỉ số hóa sinh thể hiện mức độ dự trữ glucid ở các tổ chức trong cơ thể. Thực tế cho thấy rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới về cơ chế và tác dụng của những thuốc tác động trên chuyển hóa glucid như : đái tháo đường, bệnh dự trữ glycogen đã tập trung tìm hiểu tác động lên mức độ dự trữ, tổng hợp và thoái hóa glycogen[37,38]. Hiện tại ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến vấn đề này . Với mong muốn tìm được một phương pháp định lượng glycogen trong mô gan dễ thực hiện, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nước ta để làm cơ sở cho những nghiên cứu và chẩn đoán, chúng tôi tiến hành đề tài với những mục tiêu sau : 1. Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình định lượng glycogen theo phương pháp Anthrone. 2. Lựa chọn được một quy trình định lượng glycogen hợp lý. 3. Ảp dụng quy trình đã lựa chọn để xác định hàm lượng glycogen ở gan của chuột bình thường khi đỏi và sau khi uống glucose. PHẦN I: TỔNG QUAN 1.1 GLYCOGEN. Glycogen là một polysaccharid, dạng dự trữ cơ bản của glucose trong tế bào động vật. Glycogen được tìm thấy dưới dạng các hạt nhỏ, phân bố khắp nơi trong nguyên sinh chất của tế bào động vật. xế bào gan chứa hàm lượng glycogen cao nhất ( 6-8% khối lượng tươi), ở cơ, glycogen có hàm lượng thấp hơn ( 1% khối lượng cơ), nhưng tổng lượng glycogen trong cơ cao hơn ở gan do khối lưọng cơ chiếm một phần đáng kể trong cơ thể. Một lượng nhỏ glycogen được tìm thấy ở thận, và lượng nhỏ hơn nữa được tìm thấy ở tế bào thần kinh não và bạch cầu. Ngoài ra glycogen còn được tìm thấy trong thực vật, nấm mốc và nấm men bia. [32,1,2] G ỉycoge n Hình 1: Một đoạn phân tử glycogen 1.1.1 cấu trúc Mỗi phân tử glycogen là một polymer gồm khoảng 10000 tới 120000 gốc a - glucose liên kết với nhau. Phân tử glycogen có nhiều mạch nhánh, mỗi nhánh gồm khoảng 1 đến 12 đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết a (1-^4) glycosid trong mạch và các liên kết a (1—>6) glycosid ở điểm nhánh. Trọng lượng phân tử từ 2,7.10^ - 3,5.10^ dalton. [32,1] c HsO« CHjOM H J - 0. H H ,.ị 0, H H ổH H 0H I OH CHjCtH éẻ» glycogen CHjCtH i CHj CH^DH CHjOH ị 0 H H 4|— '0 H H J— o H M J— 0 H 8h ^ 0^ N OH ả" OH M OH H OH 4^o„ ŨH Hình 2: cấu trúc phân tử glycogen 1.1.2 Chức năng Glycogen là dạng dự trữ để sẵn sàng biến đổi thành glucose, nguồn năng lượng cơ bản cung cấp cho mọi hoạt động của tế bào khi cần thiết. Glycogen có nhiều ở gan và cơ, với 2 chức năng cơ bản đặc trưng cho từng loại tổ chức, ở cơ, glycogen được sử dụng như một nguồn nhiên liệu ( nguồn cung cấp adenosin triphosphat ATP) cho quá trình co cơ. ở gan, glycogen giữ vai trò duy trì hằng định nồng độ glucose trong máu. Khi dư thừa năng lượng (sau bữa ăn), gan thu lượm glucose và các chất dinh dưỡng để tổng họp thành glycogen dự trữ. Ngược lại, khi đường huyết thấp, gan chuyển glycogen thành glucose. Vì vậy glucose luôn sẵn có để cung cấp cho các mô không có khả năng tổng hợp carbonhydrat như não, cơ, hồng cầu và để điều hòa glucose trong máu [2,5,17]:. 1.1.3 Tính chất - Glycogen tan trong nước, không tan trong ethanol. - Dạng bột trắng có [a] : +196° tới +197°. - Không phản ứng với dung dịch Fehling, phản ứng với lod tạo sản phẩm có mầu từ nâu đến tím. [32] 1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật. 1.1.4.1 Thoái hóa glycogen [2,5,23]. Quá trình thoái hóa glycogen bao gồm những giai đoạn như sau : *Giai đoan cắt mach thẳng: Glycogen phosphorylase xúc tác phản ứng cắt gốc glucose tận cùng ở đầu không khử của mạch thẳng glycogen: Glycogen (n mắt xích) + Pi ^ Glycogen ( n . 1 m ắ t x í c h ) + GIP Phản ứng xảy ra tương tự như phản ứng thủy phân cắt liên kết a (1-^4) glycosid với sự tham gia của phosphat vô cơ (Pi) tạo thành a-D-glucose-1- phosphat và phân tử glycogen mất một gốc glucose. Quá trình này được lặp lại nhiều lần, tách dần từng gốc glucose dưới dạng a-D-glucose-l-phosphat cho tới khi mạch đang thoái hoá còn 4 đơn vị glucose tại điểm nhánh a (1-^6) thì dừng lại. *Giai đoan cắt mach nhánh : Giai đoạn này có sự tham gia của enzym cắt nhánh (debranching enzyme) với 2 hoạt tính: • Oligo a (1—>6) -a (1—>4) glucan transferase: chức năng vận chuyển một chuỗi 3 gốc glucose từ nhánh tới một đầu không khử của một nhánh khác cạnh nó và gắn lại bằng liên kết a (1—>4) glycosid. • a (1—>6) glucosidase: (chức năng cắt nhánh) cắt gốc glucose còn lại tại điểm nhánh a (1-^6), giải phóng glucose dưới dạng tự do. Phản ứng cắt nhánh cho phép enzym glycogen phosphorylase tiếp tục hoạt động để đi đến thoái hóa hoàn toàn phân tử glycogen . 1 Ufen k é t ÍX> ịiA i a ««s * ĩ -OÍ'i<^ii iit^»i:.t: ■■ o < Oeí %ợo /n > S * • m . m < i i . € i <II> 1 ịỉiycữii^rì p#>0 Sjsỉ?i^'ytà«e Hình 3: Thoái hóa glycogen *Giai đoan biến đồi glucose-l-phosphat (GIP) thành glucose ở các tổ chức, GIP được đồng phân hóa để tạo GÓP nhờ enzym phosphoglucomutase. Đây là phản ứng thuận nghịch : Erư^me-SmOPO^ Enr^tne-S^MC^H Enrrme-Ser-OPO/“ H m glucore«! "phosphate gíuco$e-6-pỉiCỊsphate Hình 4: Phản ứng biến đổi GIP GÓP ở gan và thận có một enzym đặc biệt glucose-6-phosphatase có khả năng thủy phân gốc phosphat của GÓP tạo glucose tự do đi vào máu để tới các tế bào của tổ chức. [...]... CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCOGEN Cho đến nay các phương pháp định lượng glycogen được chia làm hai hướng chính là: tách riêng glycogen khỏi mô để định lượng hoặc định lượng glycogen trực tiếp trong mô 1.3.1 Phương pháp tách glycogen ra khỏi mô để định lượng Quy trình chung: Phá vỡ tổ chức mô (1) - ► Tách glycogen khỏi dịch chiết (2) Định lượng ’ (3 )’ (1) Phá vỡ tồ chức mô: Có 2 phương pháp. .. (3) 17 'v / Định lượng TPNH bằng phương pháp đo huỳnh quang Hàm lượng glycogen được so với chất chuẩn Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép định lượng trực tiếp được glycogen có mặt trong mô não với hàm lượng SO trong gan với hàm lượng ịLig, 0,3 ụg [24] Các phươns pháp khác: Glycogen trong mô có thể được định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [13] hoặc bằng phương pháp đo phổ... cho phép kết luận phương pháp định lượng này có tính lặp lại 2.2.5 Xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột bình thường > Sử dụng quy trình đã lựa chọn định lượng glycogen trong gan chuột cống trắng, giống đực và chuột nhắt trắng, giống đực sau khi cho chuột nhịn 12 giờ > Tiến hành trên 2 lô chuột: một lô chuột nhắt 5 con cùng khối lượng 20gam và một lô chuột cống 5 con cùng khối lượng 120 gam >... hai phương pháp > Nhận xét: Kết quả thu được ở bảng trên cho thấy: Hàm lượng glycogen đo được ở phương pháp nghiền đồng thể với TCA cho kết quả thấp hơn so với phương pháp dùng KOH Nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê tủa glycogen thu được trong phương pháp thứ nhất có màu nâu 2.2.4 Khảo sát tính lặp lại của phương pháp > Để xem xét tính lặp lại của phương pháp, tiến hành định lượng theo... hợp glycogen từ glucose ngoại sinh 2.L4.2 Phương pháp nghiên cứu: 0,05 khi so sánh thống kê giữa hai phương. .. thuốc này cần định lượng được các chỉ số hóa sinh mà thuốc gây ảnh hưởng Glycogen là dạng dự trữ của glucose Việc đánh giá hàm lượng glycogen là một khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu các thuốc tác dụng trên chuyển hóa glucid cũng như để chẩn đoán những bệnh liên quan Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu xây dựng một phương pháp định lượng glycogen trong gan chuột dựa trên các phương pháp đã công... chí phụ thuộc cả vào nguồn gốc của mẫu glycogen[ 19] 1.3.2 Định lượng trực tiếp glycogen trong mô Glycogen có thể được định lượng trực tiếp trong dịch chiết mô mà không cần tách riêng hay tinh chế, được tiến hành theo các phương pháp sau; Phươns pháp 1: - Định lượng hỗn hợp glycogen và glucose tự do trong dịch chiết mô bằng cách thủy phân glycogen thành glucose trong acid sulfuric đậm đặc Glucose phản... lOOml dịch trong Ly tâm 5000rpm 20 phút ^ 2ml Ethanol Lấy Iml ủ 37°c/ 3giờ '' 2ml nước cất Đun sôi Kết tủa ^ cách thủy 15 phút 10 ml thuốc thử Anthrone Để nguội Đo quang 620nm > So sánh kết quả định lượng glycogen theo hai phương pháp, tiến hành trên 5 chuột nhắt trắng Mô gan của mỗi chuột được chia thành 2 mẫu để tiến hành 2 phương pháp Kết quả thu được tại bảng 6: 29 Bảng 6: Hàm lượng glycogen. .. triệt để và nhanh hơn nhiều tác giả đề xuất sử dụng thêm NaCl hoặc LiCl [25], - Để tinh chế glycogen thu được, có thể dùng nước cất hoà tan glycogen và cho kết tủa lại bằng ethanol, lặp lại nhiều lần Good và cộng sự trong nghiên cứu năm 1932 đã sử dụng than hoạt để tinh chế glycogen[ 10] (3) Định lương glycogen sau khi đươc tách ra: Glycogen thu được có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác . trình định lượng glycogen theo phương pháp Anthrone. 2. Lựa chọn được một quy trình định lượng glycogen hợp lý. 3. Ảp dụng quy trình đã lựa chọn để xác định hàm lượng glycogen ở gan của chuột. trong mô gan chuột 25 2.2.3 So sánh với phương pháp chiết tách glycogen bằng kiềm : 29 2.2.4 Xác định tính lặp lại của phương pháp 30 2.2.5 Xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột bình thường. BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN MAI LINH NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ANTHRONE ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOGEN TRONG GAN CHUỘT (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ược SỸ KHÓA 2001-2006) Người