ở gan, sự thoái hóa glycogen không chỉ để cung cấp glucose cho bản thân tổ chức này mà còn tạo một lượng lớn glucose cung cấp cho máu ngoại biên đi nuôi các tổ chức khác.. Do đó glycogen
Trang 1BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
NGUYỄN MAI LINH
NGHIÊN CỨU ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP ANTHRONE ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLYCOGEN TRONG GAN CHUỘT
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP D ư ợc SỸ KHÓA 2001-2006)
Người hướng dẫn: Ths.Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện:
Thời gian:
Bộ môn Hóa sinhTrường Đại Học Dược Hà NộiTháng 05/2005 đến 05/2006
Hà Nội, tháng 05 năm 2006
_ _
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Tôi xỉn bày tỏ lời cảm ơn chân thành tói Thạc sĩ Phùng Thanh Hương - Giảng viên bộ môn Hóa sinh đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và làm khóa luận.
Tôi xỉn gửi lời cám ơn chân thành đến các thầy cô đã cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tâp tại trường Tôi cũng xin cảm ơn
sự giúp đỡ nhiệt tình và tạo mọi điều kiện thuận lợi của các thầy cô và các
kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh Trường Đại học Dược Hà Nội dành cho tôi trong qúa trình học tập và thực hiện khóa luận này.
Tôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, anh chị, những người thân và bạn bè đã khuyến khích, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôỉ trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên: Nguyễn Mai Lỉnh
Trang 3MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦNI TỔNG QUAN 3
1.1 GLYCOGEN 3
1.1.1 Cấu trúc 4
1.1.2 Chức năng 4
1.1.3 Tính chất 4
1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật 5
1.2 NHỮNG BÁT THƯỜNG TRONG CHỮYEN HÓA GLYCOGEN 10 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG GLYCOGEN 15
1.3.1 Phương pháp tách glycogen ra khỏi mô để định lượng 15
1.3.2 Định lượng trực tiếp glycogen trong mô 17
PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 20
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 20
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20
2.1.2 Hóachất7 T 20
2.1.3 Máy móc thí nghiệm 21
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 21
2.2 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 24
2.2.1 Xây dựng đường chuẩn giữa nồng độ glucose và mật độ quang24 2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng glycogen trong mô gan chuột 25
2.2.3 So sánh với phương pháp chiết tách glycogen bằng kiềm : 29
2.2.4 Xác định tính lặp lại của phương pháp 30
2.2.5 Xác định hàm lượng glycogen trong gan chuột bình thường 32
2.2.6 Xem xét mức độ tổng họp glycogen từ glucose ngoại sinh 32
2.3 BÀN LUẬN 7 7 34
PHẦN III KỂT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36
Trang 4DANH SÁCH NHỮNG CHỮ VIÉT TẮT
GIP Glucose - 1 - phosphat
G6P Glucose - 6 - phosphat
TCA Acid tricloacetic
TPNH Dạng khử của triphosphopyridin nucleotidTPN^ Dạng oxy hóa của triphosphopyridin nucleotidUDPG Uridine diphosphate glucose
ƯTP Uridine triphosphate
Trang 5ĐẶT VẤN ĐÈ •
Hiện nay bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid ngày càng phát triển, trong đó bệnh đái tháo đường đang ở giai đoạn bùng nổ dịch tễ trên phạm vi toàn cầu Để chẩn đoán và đánh giá hiệu quả điều trị của những bệnh này, cần phải phân tích được các chỉ số hóa sinh liên quan
Glycogen là dạng dự trữ chính của glucid ở hầu hết mọi tế bào ở gan, sự thoái hóa glycogen không chỉ để cung cấp glucose cho bản thân tổ chức này
mà còn tạo một lượng lớn glucose cung cấp cho máu ngoại biên đi nuôi các tổ chức khác Vì vậy, ngoài vai trò dự trữ, glycogen ở gan còn có ý nghĩa quan trọng trong điều hòa đường huyết, ở tổ chức cơ, khi tế bào phải hoạt động mạnh và kéo dài, sự tiêu hao năng lượng đòi hỏi phải được cung cấp một lượng lớn glucose Ngoài nguồn glucose do máu mang đến, glycogen dự trữ ở
cơ phải được thoái hoá rất mạnh để tạo thành glucose cho quá trình đốt cháy ở
cơ [2,5] Do đó glycogen là một chỉ số hóa sinh quan trọng, đánh giá được hàm lượng glycogen là một chỉ tiêu trong quá trình chẩn đoán những bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid, đặc biệt là những bệnh rối loạn dự trữ glycogen
Mặt khác việc nghiên cứu các thuốc điều trị ngày càng trở nên cấp thiết Muốn đánh giá hiệu quả, tìm hiểu tác dụng cũng như cơ chế của những thuốc đã, đang và sẽ sử dụng trong điều trị các bệnh liên quan đến chuyển hóa glucid, việc xác định các chỉ số hóa sinh liên quan là rất cần thiết Trong
đó glycogen là một chỉ số hóa sinh thể hiện mức độ dự trữ glucid ở các tổ chức trong cơ thể Thực tế cho thấy rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới
về cơ chế và tác dụng của những thuốc tác động trên chuyển hóa glucid như : đái tháo đường, bệnh dự trữ glycogen đã tập trung tìm hiểu tác động lên mức độ dự trữ, tổng hợp và thoái hóa glycogen[37,38]
Trang 6Hiện tại ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào đề cập đến vấn đề này Với mong muốn tìm được một phương pháp định lượng glycogen trong mô gan dễ thực hiện, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nước ta để làm cơ sở cho những nghiên cứu và chẩn đoán, chúng tôi tiến hành đề tài với những mục tiêu sau :
1 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quy trình định lượng glycogen theo phương pháp Anthrone.
2 Lựa chọn được một quy trình định lượng glycogen hợp lý.
3 Ảp dụng quy trình đã lựa chọn để xác định hàm lượng glycogen ở
gan của chuột bình thường khi đỏi và sau khi uống glucose.
Trang 7PHẦN I: TỔNG QUAN1.1 GLYCOGEN.
Glycogen là một polysaccharid, dạng dự trữ cơ bản của glucose trong tế bào động vật Glycogen được tìm thấy dưới dạng các hạt nhỏ, phân bố khắp nơi trong nguyên sinh chất của tế bào động vật xế bào gan chứa hàm lượng glycogen cao nhất ( 6-8% khối lượng tươi), ở cơ, glycogen có hàm lượng thấp hơn ( 1% khối lượng cơ), nhưng tổng lượng glycogen trong cơ cao hơn ở gan do khối lưọng cơ chiếm một phần đáng kể trong cơ thể Một lượng nhỏ glycogen được tìm thấy ở thận, và lượng nhỏ hơn nữa được tìm thấy ở tế bào thần kinh não và bạch cầu
Ngoài ra glycogen còn được tìm thấy trong thực vật, nấm mốc và nấm men bia [32,1,2]
G ỉy c o g e n
Hình 1: Một đoạn phân tử glycogen
Trang 81.1.1 cấu trúc
Mỗi phân tử glycogen là một polymer gồm khoảng 10000 tới 120000 gốc
a - glucose liên kết với nhau Phân tử glycogen có nhiều mạch nhánh, mỗi
nhánh gồm khoảng 1 đến 12 đơn vị glucose liên kết với nhau bằng liên kết a (1-^4) glycosid trong mạch và các liên kết a (1—>6) glycosid ở điểm nhánh.
Trọng lượng phân tử từ 2,7.10^ - 3,5.10^ dalton [32,1]
1.1.3 Tính chất
- Glycogen tan trong nước, không tan trong ethanol
Trang 9- Dạng bột trắng có [a] : +196° tới +197°.
- Không phản ứng với dung dịch Fehling, phản ứng với lod tạo sản phẩm có mầu từ nâu đến tím [32]
1.1.4 Chuyển hóa glycogen trong cơ thể động vật.
1.1.4.1 Thoái hóa glycogen [2,5,23].
Quá trình thoái hóa glycogen bao gồm những giai đoạn như sau :
*Giai đoan cắt mach thẳng:
Glycogen phosphorylase xúc tác phản ứng cắt gốc glucose tận cùng ở đầu không khử của mạch thẳng glycogen:
Glycogen (n mắt xích) + Pi ^ Glycogen ( n 1 m ắ t x í c h ) + GIP
Phản ứng xảy ra tương tự như phản ứng thủy phân cắt liên kết a (1-^4) glycosid với sự tham gia của phosphat vô cơ (Pi) tạo thành a-D-glucose-1- phosphat và phân tử glycogen mất một gốc glucose Quá trình này được lặp lại nhiều lần, tách dần từng gốc glucose dưới dạng a-D-glucose-l-phosphat
cho tới khi mạch đang thoái hoá còn 4 đơn vị glucose tại điểm nhánh a (1-^6)
• a (1—>6) glucosidase: (chức năng cắt nhánh) cắt gốc glucose còn lại tại
điểm nhánh a (1-^6), giải phóng glucose dưới dạng tự do.
Phản ứng cắt nhánh cho phép enzym glycogen phosphorylase tiếp tục hoạt động để đi đến thoái hóa hoàn toàn phân tử glycogen
Trang 10Hình 3: Thoái hóa glycogen
*Giai đoan biến đồi glucose-l-phosphat (GIP) thành glucose
ở các tổ chức, GIP được đồng phân hóa để tạo GÓP nhờ enzym phosphoglucomutase Đây là phản ứng thuận nghịch :
Hình 4: Phản ứng biến đổi GIP GÓP
ở gan và thận có một enzym đặc biệt glucose-6-phosphatase có khả năng thủy phân gốc phosphat của GÓP tạo glucose tự do đi vào máu để tới các tế bào của tổ chức
Trang 111.1.4.2 Tổng hợp glycogen [2,5,23]
Quá trình tổng hợp glycogen xảy ra ở mọi tổ chức nhưng mạnh nhất ở gan
và xương Quá trình tổng hợp glycogen bắt đầu từ nguyên liệu GÓP, sản phẩm
do phản ứng phosphoryl hóa glucose xúc tác bởi hexokinase (ở cơ) và glucose kinase (ở gan) tạo thành
D-glucose + ATP ^ D-glucose - 6 - phosphat + ADP Mặt khác một phần lớn GÓP là sản phẩm của con đường tân tạo glucose ở gan G6P được đồng phân hóa thuận nghịch thành GIP nhờ phosphoglucomutase:
Glucose - 6 - phosphat Glucose - 1 - phosphat Tiếp theo là phản ứng then chốt nhất trong quá trình tổng họp glycogen: phản ứng tạo UDP- glucose (UDPG) xúc tác bởi UDPG pyrophosphorylase:
UTP + Glucose - 1 - phosphat ^ UDP- glucose + PPi
Phản ứng này xảy ra theo chiều tạo UDPG vì pyrophosphat bị thủy phân rất nhanh thành orto phosphat nhờ pyrophosphatase
Ư D P -G lu c o s e P ỵro ph osp ho rỹla se
Hình 5: Phản ứng tạo UDPG
Trang 12UDPG là “chất cho” gốc glucose trong quá trình tổng họp glycogen dưới tác dụng của glycogen synthase Đến đây có thể xảy ra hai trường hợp:
•Trường hợp có sẵn chuỗi glucan
Enzym glycogen synthase: xúc tác việc chuyển gốc glycosyl từ UDPG tới
gắn vào đầu không khử (C4) của một phân tử glycogen gồm n gốc glucose có sẵn để tạo thêm một liên kết mới a (1-^4) glycosid, nghĩa là tạo thành glycogen có n +1 gốc glucose
glycogen („ gốc) + UDP-glucose -> glycogen („+1 góc) + UDP
Khi tạo được thêm ít nhất 6 gốc glucose, enzym gắn nhánh : amylo(1^4 -
1—>6) - transglycosylase hay glycosyl (4 ^ 6 ) - transferase có tác dụng vừa
cắt đứt liên kết a (1 ^ 4 ) glycosid của đoạn glycogen vừa mới tạo ra, vừa
chuyển đến gắn vào OH ở C6 của gốc glucose trên cùng một chuỗi hay một
chuỗi khác tạo ra một điểm nhánh mới a (1 ^ 6 ) glycosid trong quá trình tổng
họp glycogen (Hình 6)
Sau đó mạch nhánh mới tạo thành lại được kéo dài ra nhờ tác dụng của
glycogen synthase dẫn đến tạo các liên kết mới a (1 ^ 4 ) glycosid Quá trình
trên được lặp lại nhiều lần làm cho số lượng mạch nhánh tăng lên dần cho đến khi đạt được một phân tử glycogen có cấu trúc phù hợp với nhu cầu
Tác dụng sinh học của sự gắn nhánh là làm cho phân tử glycogen dễ tan hơn và số đầu không khử tăng lên, do đó phản ứng được nhiều hon với glycogen phosphoĩylase và glycogen synthase
Trang 13Hình 6: Quá trình sinh tổng hợp glycogen
• Trưòng hợp không có sẵn chuỗi glucan (ở thời điểm xa bữa ăn khoảng 18-24 giờ, toàn bộ glycogen dự trữ đã được tiêu thụ hết);
Mở đầu cho quá trình tổng họp glycogen cần phải có một chất mồi protein gọi
là glycogenin ( M - 37284) : chất này được tìm thấy ở đầu khử của các phân
tử glycogen Quá trình tổng hợp diễn biến theo 5 giai đoạn:
Giai đoan 1: một gốc glucose từ UDPG gắn vào gốc Tyr 194 của glycogenin nhờ xúc tác của protein-tyrosin -glucosyl transferase
Giai đoan 2: tạo phức hợp của glycogenin đã gắn glucose với glycogen synthase theo tỉ lệ 1:1
Giai đoan3:kéo dài chuỗi glucan tới khi chuỗi gồm 7 gốc glucose hay nhiều hơn Mỗi gốc glucose mới gắn vào đều đi từ ƯDPG và đó là những phản ứng
tự xúc tác thông qua glucosyl transferase của glycogenin
Trang 14Giai đoan4: Glycogen synthase tách dần khỏi glycogenin.
Giai áoan5: Hoàn thành phân tử glycogen nhờ phối hợp tác dụng của glycogen synthase và enzym gắn nhánh (glycogen branching enzyme) Cuối cùng, glycogenin vẫn gắn vào một đầu của phân tử glycogen đã được tạo thành
1.2 NHỮNG BẤT THƯỜNG TRONG CHUYỂN HÓA GLYCOGEN
Những bất thường trong chuyển hóa glycogen được coi là bệnh về dự trữ glycogen, do di truyền khuyết thiếu hoặc sai lệch cấu trúc enzym tham gia chuyển hóa glycogen Sự thiếu hụt enzym dẫn đến những bất thường về cấu trúc hoặc hàm lượng glycogen trong các tổ chức
Gl^pgl
Lysosom e
V Kìnast
-Glycogen and IX
Phosphorylase ịO S Ũ V) cơ
'Bểbmnéĩi n
trong gan Glticose^B-Phosphata $e (G S D I)
Gkicose-6-Phosphâte ĩrânsporler CGSD ỈB|
Hình 7: Vị trí các enzym liên quan đến các typ bệnh dự trữ glycogen
Sự thiếu hụt một enzym chuyển hóa glycogen ảnh hưởng chủ yếu đến dự trữ glycogen tại gan với biểu hiện quan trọng nhất là hạ đưòng huyết, do không
Trang 15huy động được glucose vào máu khi đói ở tổ chức cơ, vì không thể cung cấp
đủ glucose cho quá trình đốt cháy tạo năng lượng dẫn đến khó vận động và tập luyện [7,14]
Những ảnh hưởng cụ thể phụ thuộc vào từng loại enzym riêng Bệnh lí về
dự trữ glycogen được chia thành những typ bệnh sau;
Typ 0: Thiếu hụt enzym tổng hợp glycogen tại gan (glycogen synthase):
Kết quả là giảm dự trữ glycogen tại gan và dẫn đến tình trạng hạ đường huyết lúc đói và tăng đường huyết sau bữa ăn Bệnh thường xuất hiện ở trẻ nhỏ và trẻ sơ sinh với các biểu hiện; hạ đường huyết mạnh đi kèm với nhiễm xeton Mặc dù ăn vào sẽ làm giảm nhẹ các triệu chứng, nhưng dẫn đến kết quả là tăng đường máu và acid lactic máu sau bữa ăn ở bệnh nhân typ 0, trạng thái hạ đường huyết xảy ra trong vòng vài giờ sau bữa ăn vì dự trữ glycogen gan và con đường tân tạo đường không đủ duy trì đường huyết bình thưòng Tăng đường huyết và mức lactac máu sau khi ăn là do con đường tổng hợp glycogen bị giới hạn, nên quá thừa glucose sẽ ưu tiên chuyển thành lactac bởi con đưòng đường phân.[7,l 1]
Typ I : Bệnh Von Gierkes do thiếu hụt enzym glucose-6-phosphatase:
Glucose - 6 - phosphatase là enzym xúc tác cho phản ứng cắt nhóm phosphat của G6P để giải phóng glucose tự do giúp duy trì đường huyết bình thường Bệnh nhân mắc chứng bệnh này không có khả năng giải phóng glucose từ glycogen, dẫn đến không thể duy trì hàm lượng glucose trong máu trong vòng vài giờ sau bữa ăn, vì vậy sẽ bị hạ đường huyết Mức đưòng huyết thấp sẽ gây ra chứng đói mãn tính, mệt mỏi và dễ nổi cáu, đặc biệt ở trẻ nhỏ.Những bệnh nhân typ I có khả năng dự trữ glucose dưới dạng glycogen, nhưng không thể thoái hóa glycogen tạo glucose như bình thường Vì vậy để điều hòa đưòtig huyết, các hormon, acid lactic, triglycerid tăng lên trong máu Chất béo cũng được dự trữ trong gan cùng với glycogen làm cho gan to lên [11,14]
11
Trang 16Typ II: Bệnh Pompe do thiếu hụt acid Maltase (enzym acid alpha-1,4-
glucosidase): Pompe là người đầu tiên mô tả bệnh này khi ông pháp hiện ra một bé gái 7 tháng tuổi bị chết sau cơn cơ tim to tự phát
Acid alpha-glucosidase là một enzym thủy phân của lysosom, cần thiết để thoái hóa một phần nhỏ (1-3%) glycogen trong tế bào Vì thế con đường thoái hóa chính của glycogen ít bị ảnh hưởng ở typ II, cấu trúc glycogen không bị bất thường và tình trạng hạ đường huyết không xảy ra Tuy nhiên, thiếu hoạt động của enzym này sẽ gây ra sự tích tụ glycogen trong lysosom và
tế bào chất Sự tích tụ này có thể làm ảnh hưởng đến những chức năng thông thường khác của tế bào dẫn tới tổn thương tế bào, và gây ra rối loạn toàn bộ tổ chức, làm cho các cơ quan này to hơn bình thường Những cơ quan hay bị tổn thương nhất trong typ bệnh này là tim, xương và cơ hô hấp [12,30],
Typ III: Bệnh Cori do thiếu hụt enzym cắt nhánh :
Năm 1928, Snappes và van Creveld đã mô tả 2 bệnh nhân mắc bệnh này
Cả 2 bệnh nhân đều có triệu chứng gan to và giảm khả năng huy động glycogen dự trữ trong gan Năm 1953, Forbes mô tả trường họp thứ ba mắc bệnh và thấy rằng glycogen trong cả gan và cơ đều có cấu trúc không bình thưÒTig Illingworth và Cori tách glycogen từ mô ra và phát hiện thấy phân tử glycogen này có mạch nhánh phía ngoài cực ngắn Cori đặt tên cấu trúc này
là 1 dextrin giới hạn, và ông đã dự đoán nguyên nhân là do thiếu enzym cắt nhánh Năm 1964 van Creveld với sự giúp đỡ của Huijing đã chứng minh được sự thiếu hoạt động của enzym cắt nhánh glycogen ở những bệnh nhân này[8]
Hạ đường huyết là triệu chứng lâm sàng cơ bản của typ III Đó là kết quả của sự thiếu phân hủy glycogen do thiếu enzym cắt nhánh Vì vậy chỉ có một phần nhỏ glucose được tách ra, bệnh nhân gặp phải các cơn hạ đường huyết ngay cả sau bữa ăn nhẹ Các chỉ số hóa sinh trong máu thay đổi như: đường huyết thấp, tăng cao hàm lượng glycogen trong hồng cầu, tăng các loại lipid
Trang 17Sinh thiết gan thấy tăng cao hàm lượng glycogen có cấu trúc bất thường và thiếu enzym cắt nhánh Sinh thiết cơ thấy lắng đọng glycogen có cấu trúc bất thường[7,14].
Để điều trị bệnh typ này thì việc ăn thường xuyên và chế độ ăn giầu protein là cần thiết [14]
Typ IV : Bệnh Andersen do thiếu hụt enzym gắn nhánh :
Chức năng của enzym gắn nhánh là tạo ra các điểm nhánh tự nhiên trên phân tử glycogen trong suốt quá trình tổng họp glycogen Những điểm nhánh này rất quan trọng đối với cấu trúc vững chắc và khả năng hòa tan trong tế bào của phân tử glycogen Thiếu enzym này làm cho phân tử glycogen có chiều dài bất thường, có ít nhánh hơn vì vậy phân tử glycogen có cấu trúc giống với amilopectin
Sự có mặt của glycogen không thể hòa tan gây ra phản ứng lạ đối với
cơ thể dẫn đến tổn thương tế bào và rối loạn chức năng của các tổ chức, ở typ bệnh này, triệu chứng hạ đường huyết không phải là biểu hiện chủ yếu Bệnh nhân mắc bệnh này có những rối loại tại gan, sau đó tiến triển thành xơ gan, tăng huyết áp tĩnh mạch cửa là đặc trưng của typ bệnh này Những biến chứng về tim có thể gây ra giãn cơ tim, làm tổn thương tim ở hệ thần kinh, giycogen bất thường có thể làm suy yếu khả năng nhận thức và rối loạn cả thần kinh cơ và thần kinh nội tạng [3,7]
Typ V: Bệnh McArdle do thiếu enzym phosphorylase cơ:
Bệnh McArdle là do thiếu enzym phosphorylase cơ (alpha-1,4-glucan orthophosphate glucosyl transferase ), làm cho cơ không có khả năng giải phóng glucose từ glycogen
Năm 1951, McArdle đã phát hiện 1 phụ nữ 30 tuổi phải chịu đựng những cơn đau sau khi tập luyện Mức lactac trong máu tĩnh mạch của bệnh nhân này tăng sau khi bị chứng thiếu máu cục bộ do hoạt động Năm 1959 Schmid và Mahler đã chứng minh được sự thiếu hoạt động của enzym
13
Trang 18phosphorylase cơ ở một bệnh nhân nữ 52 tu ổ i Những đặc trưng của typ bệnh này được McArdle mô tả bao gồm: không chịu được tập luyện vì chứng đau
cơ, mau mệt mỏi, co cứng cơ khi tập luyện, và tình trạng đau sẽ giảm khi nghỉ ngơi Cơ vận động là nhờ vào glucose lấy từ sự phân hủy glycogen do phosphorylase Glucose chuyển thành ATP nhờ con đường đường phân Các triệu chứng xuất hiện ở typ bệnh này là do không sử dụng được nguồn năng lượng từ glycogen của cơ Khoảng một nửa số bệnh nhân phải chịu cơn hoại
tử cơ cấp sau khi tập luyện mạnh [7,8,14]
Typ VI :Bệnh Hers do thiếu enzym phosphoĩylase gan:
Enzym phosphorylase giữ vai trò quan trọng giúp thoái hóa glycogen thành glucose Nếu thiếu enzym này ở gan, glycogen không thể thoái hóa được thành glucose, và lắng đọng glycogen ở gan làm gan to ở hầu hết những bệnh nhân mắc typ bệnh này, enzym khuyết thiếu không hoàn toàn và
sự hình thành glucose vẫn diễn ra Các triệu chứng lâm sàng của typ bệnh này tương tự với typ I nhưng nhẹ hơn Gan có kích thước rất lớn , và hạ đường huyết nhẹ là những biểu hiện chính [12]
Typ VII: Bệnh Tarui do thiếu enzym phosphofructokinase cơ :
Enzym phosphofructokinase cần thiết để thoái hóa glycogen tạo năng lượng cho hoạt động của cơ Bệnh nhân mắc typ bệnh này là do thiếu một lượng phosphofructokinase ở mô cơ Thiếu enzym này ảnh hưởng đến quá trình thoái hóa của glycogen, dẫn đến không cung cấp đủ năng lượng cho cơ hoạt động bằng con đường thoái hóa glycogen Bệnh nhân phải chịu những cơn đau cơ và mệt mỏi khi tập luyện vì suy nhược cơ khi nỗ lực thu năng lượng Vì vậy gây ra chứng đau cơ, mỏi cơ, và co cứng cơ[35]
Typ IX: Thiếu hụt enzym phosphorylase kinase:
Bệnh nhân mắc typ bệnh này là do thiếu enzym phosphorylase kinase Enzym này điều khiển quá trình thoái hóa glycogen, vì vậy thiếu enzym này gây lắng đọng glycogen Những triệu chứng lâm sàng của typ này tương tự
Trang 19với typ VI Biệu hiện chung là gan to, chậm phát triển cơ vận động, tăng lipid máu Mọi triệu chứng đó thường được cải thiện Phosphoiylase kinase là một enzym hỗn hợp Vài typ bệnh do thiếu enzym này đã được xác định, tùy vào
vị trí mô bị thiếu enzym này mà typ bệnh tương ứng là :typ VIII, typ IX, typ
X [15] (hình 7)
Cho đến nay các phương pháp định lượng glycogen được chia làm hai hướng chính là: tách riêng glycogen khỏi mô để định lượng hoặc định lượng glycogen trực tiếp trong mô
1.3.1 Phương pháp tách glycogen ra khỏi mô để định lượng
là tổ chức mô được phá vỡ hoàn toàn bằng hóa chất, vì vậy có thể lấy được tất
cả glycogen ra dịch chiết mô Nhưng nhược điểm của phương pháp này là không loại bỏ được protein ra khỏi dịch chiết mô Kết tủa glycogen thu được
có màu nâu nên ảnh hưởng đến màu thực nếu dùng phương pháp so màu [25]
- Với phương pháp thứ hai (nghiền đồng thể mô với acid tricloacetic) phương pháp này có ưu điểm là loại bỏ được protein ra khỏi dịch chiết mô
15
Trang 20Kết tủa glycogen thu được có màu trắng không làm ảnh hưỏng đến phản ứng lên màu sau đó Nhưng phương pháp này có nhược điểm là tổ chức mô khó được phá vỡ hoàn toàn vì vậy khó lấy được toàn bộ glycogen ra Quá trình nghiền phải được thực hiện nhiều lần.[6].Có thể dùng nhiều hóa chất khác để loại tạp protein thay cho acid tricloacetic như acid perchloric[25], thủy ngân nitrat[10]
(2).Tách và tinh chế glycogen từ dich chiết mô:
- Ethanol là dung môi làm kết tủa glycogen vì vậy được lựa chọn để tách glycogen ra khỏi dịch chiết mô Ngoài ethanol ra có thể lựa chọn dung môi khác như methanol Để kết tủa được triệt để và nhanh hơn nhiều tác giả đề xuất sử dụng thêm NaCl hoặc LiCl [25],
- Để tinh chế glycogen thu được, có thể dùng nước cất hoà tan glycogen và cho kết tủa lại bằng ethanol, lặp lại nhiều lần Good và cộng sự trong nghiên cứu năm 1932 đã sử dụng than hoạt để tinh chế glycogen[10]
(3) Định lương glycogen sau khi đươc tách ra: Glycogen thu được có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau
a Glycogen được thuỷ phân thành glucose rồi định lượng glucose bằng
các thuốc thử khác nhau:
- Dùng thuốc thử Anthrone [25, 6]: Nguyên tắc của phương pháp là
glycogen được thuỷ phân thành glucose trong acid sulíìiric đặc ở nhiệt độ cao,
và phản ứng lên màu với thuốc thử anthrone Đo quang ở bước sóng 620nm
- Dùng thuốc thử : glycogen cũng được thủy phân thành glucose và sau
đó glucose sẽ phản ứng với tạo màu
- Dùng các thuốc thử khác như diphenylamin, phenol,
b Định lượng trực tiếp glycogen bằng thuốc thửlod:
Dựa vào tính chất của glycogen cho sản phẩm mầu nâu đỏ khi phản ứng với lod Dùng phép so màu để định lượng glycogen Nhưng theo Daniel Luzon Moris, phương pháp này khó ổn định vì màu của phản ứng thu được phụ
Trang 21thuộc không chỉ vào hàm lượng glycogen mà còn phụ thuộc vào nhiệt độ tiến hành phản ứng, hàm lượng lod và thậm chí phụ thuộc cả vào nguồn gốc của mẫu glycogen[19].
1.3.2 Định lượng trực tiếp glycogen trong mô
Glycogen có thể được định lượng trực tiếp trong dịch chiết mô mà không cần tách riêng hay tinh chế, được tiến hành theo các phương pháp sau;
Phươns pháp 1:
- Định lượng hỗn hợp glycogen và glucose tự do trong dịch chiết mô bằng
cách thủy phân glycogen thành glucose trong acid sulfuric đậm đặc Glucose phản ứng với acid sulfuric cho màu hồng Đo quang ở bước sóng 520nm
- Sau đó định lượng glucose tự do bằng cách nghiền mô với methanol Khi
đó glycogen sẽ không tan và được tách riêng ra khi ly tâm Dùng than hoạt thêm vào dịch thu được sau ly tâm để hấp phụ những hợp chất khác gây cản trở phản ứng lên màu nhưng không hấp phụ bất cứ một hexose nào Sau đó định lượng glucose bằng phản ứng cho màu hồng với acid sulfuric tương tự như trên
- Glycogen đo được sẽ tính theo hiệu số lượng glucose của hai kết quả trên [16]
Phươns pháp 2 : Phương pháp enzym :
- nguyên tắc : glycogen được thủy phân nhờ enzymglycogen + Pi -► glucosse-1 -P (92%)+ glucose (8%)( 1)glucose-1-P - ► glucose-6-p (2)glucose-6-P + TPH^ ► 6-P-gluconolacton + TPNH (3)Các phản ứng được thực hiện nhờ sự có mặt của các enzym : phosphorylase
a, amylo-l,6-glucosidase, oligo-l,4^1,6-glucan transferase ở phản ứng (1); Phospho-glucomutase ở phản ứng (2); và glucose-6-P dehydrogenase ở phản ứng (3)
17 ' v /
Trang 22Định lượng TPNH bằng phương pháp đo huỳnh quang Hàm lượng glycogen được so với chất chuẩn.
Phương pháp này có độ nhạy cao cho phép định lượng trực tiếp được glycogen có mặt trong mô não với hàm lượng SOịLig, trong gan với hàm lượng
0,3 ụg [24].
Các phươns pháp khác: Glycogen trong mô có thể được định lượng bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [13] hoặc bằng phương pháp
đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (*^C-MRS)[22]
