PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM
• Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, thuần chủng, trọng lượng 20 - 25g do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp, được nuôi bằng thức ăn tổng hợp .
• Chuột cống trắng khỏe mạnh, thuần chủng, trọng lượng 100 - 125g do Học viện Quân Y cung cấp, được nuôi bằng thức ăn tổng họp.
2.1.2 Hóa chất
• Ethanol
• Thioure
• Anthrone
• Acid tricloacetic
• Acid sulfuric
• Glucose tinh khiết
• Kali hydroxyd
• Thuốc thử Anthrone:
Thêm cẩn thận 180 ml acid sulfuric vào 70 ml nước cất. Đến nhiệt độ khoảng 80°c thêm vào 2,5g thioure, hòa tan và thêm tiếp 125mg thuốc thử Anthrone, khuấy cho tan hoàn toàn, để mát. Bảo quản trong tủ lạnh. Không để lâu quá hai tuần[6].
• Các hóa chất tinh khiết khác.
<♦ Hóa chất do bộ môn hóa sinh cung cấp đạt tiêu chuẩn tinh khiết hóa học.
2.1.3 Máy móc thí nghiệm
• Máy li tâm thường (3000 vòng / phút) (Clay Adams - Anh)
• Máy li tâm lạnh Heraeus sepatech
• Máy đo quang Spectro ƯV-VIS Auto - LaboMed, Inc.
• Máy đo đường huyết One touch Basic (Jonhson & Tonhson).
• Kít đo đường huyết One touch Basic Ợonhson & Jonhson).
• Tủ điều nhiệt.
2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 2.1.4.1 Cơ sở thực nghiệm:
Hiện nay bệnh liên quan đến rối loạn chuyển hóa glucid ngày càng phát triển, đặc biệt bệnh đái tháo đưòng đang ở giai đoạn bùng nổ dịch tễ trên phạm vi toàn cầu. Để chẩn đoán và đánh giá mức độ những bệnh này đòi hỏi phân tích được các chỉ số hóa sinh liên quan. Mặt khác việc nghiên cứu các thuốc điều trị càng trở nên cấp thiết. Muốn đánh giá tác dụng cũng như cơ chế của những thuốc này cần định lượng được các chỉ số hóa sinh mà thuốc gây ảnh hưởng. Glycogen là dạng dự trữ của glucose. Việc đánh giá hàm lượng glycogen là một khâu quan trọng trong quá trình nghiên cứu các thuốc tác dụng trên chuyển hóa glucid cũng như để chẩn đoán những bệnh liên quan.
Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu xây dựng một phương pháp định lượng glycogen trong gan chuột dựa trên các phương pháp đã công bố, có sửa đổi, điều chỉnh và sơ bộ đánh giá mức độ tổng hợp glycogen từ glucose ngoại sinh.
2.L4.2 Phương pháp nghiên cứu:
<♦ Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng glycogen trong gan:
• Tham khảo các phương pháp định lượng đã công bố.
• Bằng thực nghiệm, khảo sát các điều kiện tiến hành để xây dựng một quy trình hợp lý dựa theo nguyên tắc: Glycogen được chiết
21
ra khỏi dịch chiết mô bởi ethanol. Sau đó được định lượng bằng thuốc thử Anthrone sau khi glycogen thủy phân thành glucose nhờ acid sulftiric đặc. Quy trình sơ lược được khái quát như sau:
Nghiền đồng thể/ 5ml TCA 7%
Mô gan ______________________ ^ Dịch trong Ly tâm SOOOrpm /15 phút
Bổ sung TCA 7%
lOOml dịch trong
Ethanol 95% Lấy
Ly tâm SOOOrpm ^ \
20 phút ---
Kết tủa
ủ 37°c/ 3giờ 2ml nước cất
Đun sôi
^ cách thủy 10 ml thuốc thử 15
Anthrone
Để nguội
Đo quang 620nm Kết quả tính theo công thức:
%glycogen/ ^ xO,1x100x0,9x /\gam ^ D c
100
g{mô)
Trong đó 0,1: mg glucose trong dung dịch chuẩn 100; thể tích dịch trong
0,9: Hệ số đổi glucose —>• glycogen
❖ Định lượng glycogen trong gan chuột cống và chuột nhắt đói theo quy trình đã chọn:
❖ Đánh giá mức độ tổng họp glycogen từ glucose ngoại sinh:
- chuột nhắt trắng cho nhịn đói 12 giờ chia làm 4 lô, mỗi lô 5 con.
Lô 1: nhịn đói 12 giờ, sau đó định lượng glycogen gan và glucose máu.
Lô 2: nhịn đói 12 giờ, sau đó cho uống glucose, định lượng glucose máu và glycogen gan sau 1 giờ
Lô 3: nhịn đói 12 giờ, sau đó cho uống glucose, định lượng glucose máu và glycogen gan sau 2 giờ
Lô 4: nhịn đói 12giờ, sau đó cho uống glucose, định lượng glucose máu và glycogen gan sau 3 giờ .
Cho chuột uống dung dịch glucose 30% với liều 3g/kg.
<♦ Định lượng glycogen theo quy trình đã lựa chọn .
❖ Định lượng glucose: Bằng máy đo đường huyết theo nguyên tắc dùng glucose oxidase (GOD) như sau: Phản ứng oxi hóa glucose thành gluconic được xúc tác bởi glucose oxidase theo phản ứng:
Glucose + H2O + O2- -—> acid gluconic +H2O2
0-dianisidin + H2O2 --- ► phức hợp màu vàng nâu + H2O Cường độ màu được xác định bằng phương pháp đo quang tưong ứng với nồng độ glucose trong mẫu cần định lượng.
2.1.4.3 Xử lý số liệu:
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê với phần mềm Excel 2003. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05 .
23