PHẦN II THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.2 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT
2.2.2 Xây dựng quy trình định lượng glycogen trong mô gan chuột
> Nguyên tắc: glycogen bị kết tủa bởi ethanol và được chiết ra từ dịch chiết mô, sau đó bị thủy phân thành glucose trong acid sulfuric đặc thành glucose và thực hiện phản ứng lên màu với thuốc thử Anthrone.
> Quy trinh ; Lấy chính xác khoảng Igam mô gan tươi nghiền đồng thể với 5ml acid tricloacetic 7%. Sau đó ly tâm loại bỏ tủa protein. Dịch trong thu được cho vào bình định mức 1 OOml, bổ sung acid tricloacetic cho đủ thể tích, lắc đều. Lấy chính xác Iml dịch trong vào ống ly tâm có thể tích 15ml thêm ethanol để kết tủa glycogen. Để kết tủa hoàn toàn glycogen, đặt trong tủ điều nhiệt 37°c trong thời gian 3 giờ. Sau đó ly tâm thu tủa glycogen. Hòa tan tủa trong 2ml nước cất, thêm lOml thuốc thử Anthrone, lắc đều đun sôi cách thủy 15 phút, thu được dung dịch có màu xanh. Đo quang ở bước sóng 620nm.
> Tiến hành: khảo sát lượng ethanol cần thiết và số lần nghiền đồng thể để xây dựng một quy trình định lượng chi tiết.
a. Khảo sát hàm lượng ethanol:
• Để xác định lượng ethanol cần sử dụng để thu được kết tủa glycogen cao nhất ta tiến hành thí nghiệm với các mẫu ở các tỉ lệ ethanol khác nhau.
• Tiến hành theo quy trình trên, lấy chính xác khoảng Igam mô gan tươi, dịch trong thu được sau hai lần nghiền đồng thể gộp lại trong bình định mức lOOml, bổ xung acid tricloacetic đủ thể tích.
Gọi là dịch A. Lấy dịch A này làm 7 mẫu :
25
Bảng 3: Các mẫu tương ứng vói tỷ lệ dịch trong và ethanol
Mầu 1 Mầu 2 Mầu 3 Mầu 4 Mầu 5 Mầu 6 Mầu 7
Dich
(ml) 1 1 1 1 1 1 1
Ethanol
(ml) 0,5 1 2 3 4 5 6
Các mẫu được ủ 3 giờ ở 37°c để kết tủa glycogen. Sau đó mang đi ly tâm thu tủa glycogen và tiến hành phản ứng lên màu theo quy trình trên. Kết quả thu được tại bảng 4:
Bảng 4: Hàm lượng glycogen đo được tại các nồng độ ethanol khác nhau
Mầu Mầu
1
Mầu 2
Mầu 3
Mầu 4
Mầu 5
Mầu 6
Mau 7 Thí nghiệm Hàm lượng glycogen trong lOOg mô gan (gam) Thí nghiệm 1 0,75 1,85 2,27 2,65 2,82 2,92* 2,91 Thí nghiệm 2 0,53 1,12 1,93 2,15 2,27 2,76* 2,72 Thí nghiệm 3 0,67 1,63 2,53 2,78 2,95 3,17* 3,12 Thí nghiệm 4 0,39 1,58 2,34 2,65 2,78 2,89* 2,85 Thí nghiệm 5 0,22 1,33 2,16 1,83 1,87 2,02* 2,00 P(so với mẫu 6) <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05 >0,05
Nhận xét: Kết quả thu được tại bảng 4 cho thấy tại mẫu 6 cho kết quả thu được là cao nhất. Nhưng so sánh giữa số liệu thu được tại mẫu 6 với các mẫu khác sự khác biệt có ý nghĩa thống kê chỉ có xảy ra với mẫu 1, mẫu 2 và mẫu 3 (p<0,05), còn với mẫu 4, 5 và mẫu 7
sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Như vậy có thể kết luận ở tỷ lệ ethanol cần dùng là từ gấp ba lần dịch chiết trở lên. Chúng tôi lựa chọn tỷ lệ (dịch A : ethanol) là 1: 5 cho quy trình của mình.
b. Khảo sát lượng gỉycogen thu được theo số lần nghiền đồng thể:
• Với phương pháp nghiền đồng thể, tổ chức mô khó được phá vỡ triệt để. Vì vậy để thu được toàn bộ glycogen trong mô cần thời gian nghiền lâu và thực hiện nhiều lần. Chúng tôi tiến hành khảo sát số lần nghiền cần thiết để có thể lấy được toàn bộ glycogen trong mô gan. Với thời gian nghiền cho mỗi lần là 5 phút.
• Mầu gan được tiến hành nghiền đồng thể trong TCA 7% , thời gian 5 phút. Sau đó đem ly tâm, dịch trong thu được của lần nghiền thứ nhất này cho trong bình định mức 1. Phần tủa đem nghiền đồng thể lần 2 trong TCA 7% cũng trong thời gian 5 phút và mang li tâm thu được dịch trong lần 2 cho vào bình định mức 2. Lặp lại như thế 4 lần. Thu dịch chiết của mô gan sau 4 lần nghiền đồng thể, định lượng glycogen theo quy trình trên.
• Kết quả thu được tại bảng 5:
Bảng 5: Hàm lượng glycogen thu đưọc qua các lần nghiền đồng thể
Thí nghiệm
Hàm lượng glycogen trong lOOg mô gan (gam)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4
gam % gam % gam % gam %
Thí nghiệm 1 3,25 95,5 0,13 3,9 0,02 0,6 0 0
Thí nghiệm 2 3,87 97,8 0,69 1,7 0,02 0,5 0 0
Thí nghiêm 3 2,92 95,4 0,12 3,8 0,03 0,8 0 0
Thí nghiệm 4 2,76 92,3 0,22 7,3 0,01 0,4 0 0
Thí nghiệm 5 2,26 92,7 0,\5 6,0 0,03 1,3 0 0
27
• Nhận xét: Như vậy qua bảng 5 ta thấy sau lần nghiền thứ nhất không thể lấy được toàn bộ glycogen có trong mô. Chỉ sau lần nghiền thứ 3, lượng glycogen mới được lấy ra hết. Với phương pháp nghiền đồng thể mô gan trong TCA cần thiết tiến hành nghiền 3 lần mỗi lần nghiền trong 5 phút và gộp dịch nghiền thu được để định lượng glycogen.
> Kết luân : Sau các thực nghiệm khảo sát, chúng tôi đã lựa chọn và xây dựng một quy trình định lượng glycogen như sau:
Nghiền đồng thể/ 5ml TCA 7%
1 gam
Ly tâm SOOOrpm /15 phút
Dịch trong (làm 3 lần)
Bổ sung TCA 7%
lOOml dịch trong
Ly tâm SOOOrpm
20 phút ^
5ml Ethanol ủ 37°c/ 3giờ
Lấy Iml
Kết tủa
2ml nước cất .. r^guội
Đun sôi
^ cách thủy 10 ml thuốc thử 15 phút Anthrone
Đo quang 620nm