Nghiên cứu thành phần steroit phân lập từ loài hải miên haliclona subarmigera

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC o0o PHẠM THÀNH CÔNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN STEROIT PHÂN LẬP TỪ LOÀI HẢI MIÊN HALICLONA SUBARMIGERA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa Hữu Cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. PHAN VĂN KIỆM HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Khoá luận tốt nghiệp này được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trước tiên, với lòng kính trọng và biết ơn chân thành, em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phan Văn Kiệm đã nhiệt tình, tận tâm hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Em xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Văn Bằng cùng toàn thể các thầy cô giáo trong khoa Hóa học, các thầy cô giáo trong Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập tại trường. Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn tới TS. Hoàng Lê Tuấn Anh cùng TS. Nguyễn Xuân Nhiệm và các thầy cô, anh chị nhân viên, phòng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hoá sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong thời gian làm khoá luận tốt nghiệp. Trong quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp, em đã cố gắng rất nhiều nhưng chắc chắn không tránh khỏi những thiếu xót. Vì vậy, em kính mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của các thầy cô và bạn bè! Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Phạm Thành Công LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận: “Nghiên cứu phân lập các steroit của loài hải miên Haliclona subarmigera”, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phan Văn Kiệm là hoàn toàn trung thực và không trùng với kết quả của tác giả khác. Sinh viên Phạm Thành Công MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1 Tổng quan về các loài hải miên và các loài hải miên thuộc chi Haliclona 2 1.1.1. Tổng quan về các loài hải miên 2 1.1.1.1. Phân bố, sinh thái 3 1.1.1.2. Thành phần hóa học 3 1.1.1.3. Công dụng 3 1.1.2. Tổng quan về các loài hải miên thuộc chi Haliclona 3 1.2. Tổng quan về steroit 5 1.2.1. Giới thiệu chung 5 1.2.1.1. Khái niệm 6 1.2.1.2. Cấu trúc khung cơ bản của steroid 6 1.2.1.3. Phân loại steroit 7 1.2.2. Một số steroit cơ bản 7 1.2.2.1. Sterol 7 1.2.2.2. Axit mật 11 1.2.2.3. Hormon steroit 13 1.3. Các phương pháp chiết mẫu thực vật 17 1.3.1.Chọn dung môi chiết 17 1.3.2. Quá trình chiết 19 1.4. Các phương pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ 20 1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí 21 1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí 21 1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí 22 1.4.3.1. Sắc kí cột (C.C) 24 1.4.3.2. Sắc kí lớp mỏng 26 1.5. Một số phương pháp hóa lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ 26 1.5.1. Phổ hồng ngoại 26 1.5.2. Phổ khối lượng 27 1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 28 1.5.3.1. Phổ 1 H-NMR 28 1.5.3.2. Phổ 13 C-NMR 29 1.5.3.3. Phổ DEPT 29 1.5.3.4. Phổ 2D-NMR 29 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Mẫu sinh vật biển 31 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất 31 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 31 2.2.2. Sắc ký cột (CC) 31 2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất 32 2.3.1. Phổ khối lượng (MS) 32 2.3.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 32 2.4. Dụng cụ và thiết bị 32 2.4.1. Dụng cụ và thiết bị tách chiết 32 2.4.2.Dụng cụ và thiết bị xác định cấu trúc 33 2.5. Hoá chất 33 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM 34 3.1. Phân lập các hợp chất 34 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 1 37 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất 2 40 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) 1 H NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance Spectroscopy) 1 H- 1 H COSY 1 H- 1 H Chemical Shift Correlation Spectroscopy 2D-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (Two-Dimensional NMR) CC Sắc ký cột (Column Chromatography) DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer EI-MS Phổ khối lượng va chạm electron (Electron Impact Mass Spectroscopy) FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh (Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) HMBC Heteronuclear Multiple Bond Connectivity HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HR-FAB-MS Phổ khối lượng bắn phá nguyên tử nhanh phân giải cao (High Resolution Fast Atom Bombardment Mass Spectroscopy) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy) NOESY Nucler Overhauser Effect Spectroscopy TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ Trang Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 1 và chất tham khảo 39 Bảng 4.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 2 và chất tham khảo 42 Hình 1.1 Hải miên Haliclona sp.……………………………………… 2 Hình 1.2 Hải miên Haliclona subarmigera……………… 4 Hình 1.3 Cấu trúc hợp chất Haliclonacyclamine B 5 Hình 1.4 Cấu trúc hợp chất Halicyclamine A…………………………… 5 Hình 4.1 Phổ 1 H- NMR của hợp chất 1 38 Hình 4.2 Phổ 13 C –NMR của hợp chất 1………………………………… 39 Hình 4.3 Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 39 Hình 4.4 Phổ DEPT- NMR của 1 39 Hình 4.5 Phổ 1 H-NMR của hợp chất 2…………………… 41 Hình 4.6 Phổ 13 C-NMR của hợp chất 2………………………………… 42 Hình 4.7 Phổ DEPT của hợp chất 2………………………………… 42 Hình 4.8 Cấu trúc hóa học của hợp chất hợp chất 2…………………… 42 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất 35 MỞ ĐẦU Việt Nam ta có nguồn tài nguyên thiên nhiên rất phong phú và đa dạng không chỉ ở trên đất liền mà còn có ở dưới biển. Những năm gần đây xu hướng tìm kiếm tài nguyên ở dưới biển có tác dụng chữa bệnh ngày một tăng, thu hút các nhà khoa học nghiên cứu. Đây là nguồn tài nguyên thiên nhiên vô cùng quý giá và có ý nghĩa to lớn cho sự phát triển của ngành y tế, ngành hóa học và một số ngành khác. Hiện nay, với sự phát triển mạnh mẽ của nền y học, các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên có vai trò quan trọng trong việc phát hiện và phát triển các dược phẩm mới và làm nguyên liệu cho các ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, chất bảo vệ thực vật… do đặc tính ít độc, ít tác dụng phụ và không làm ảnh hưởng tới môi trường. Hải miên Haliclona subarmigera là loài động vật thuộc ngành Porifera (động vật ăn lọc – pore bearer), là một loài chứa nhiều hoạt tính gây độc tế bào và kháng sinh mạnh…[2]. Đây là nguồn tài nguyên quý, cần được nghiên cứu để giải thích tác dụng chữa bệnh, tạo cơ sở để tìm kiếm các hoạt chất có thể ứng dụng vào cuộc sống. Trên cơ sở các nghiên cứu của các nhà khoa học về hoạt tính sinh học của loài Hải miên Haliclona subarmigera, chúng tôi đã lựa chọn loài này làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài của khóa luận là “Nghiên cứu thành phần steroit từ loài hải miên Haliclona subarmigera” với mục đích tìm hiểu thành phần hóa học. Nhiệm vụ của đề tài: 1. Xử lí mẫu và tạo dịch chiết metanol. 2. Nghiên cứu phân lập các hợp chất steroit. 3. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về các loài hải miên và các loài hải miên thuộc chi Haliclona. 1.1.1. Tổng quan về các loài hải miên. Hải miên là các loài động vật thuộc ngành Porifera, chúng có mặt từ thời tiền sử, là nguồn cung cấp dồi dào các hợp chất có chứa nhiều hoạt tính sinh học quý như kháng viêm, chống ung thư… Cơ thể của chúng bao gồm một lớp trung mô dạng thạch được kẹp giữa hai màng tế bào mỏng. Trong khi tất cả các loài động vật khác có các tế bào chưa biệt hóa có thể chuyển thành các dạng tế bào chuyên biệt khác nhau thì duy nhất các loài hải miên có một số tế bào đã được biệt hóa mà vẫn có thể chuyển thành các dạng tế bào khác, thông thường chúng di chuyển giữa các màng tế bào cơ bản và lớp trung mô. Hình 1.1: Hải miên Haliclona sp. Trong hơn 15000 hợp chất phân lập từ các loài sinh vật sống ở đại dương, có đến hơn 5300 hợp chất phân lập từ hải miên. Hoạt động dược học của các hợp chất này có thể xếp vào các nhóm chống viêm, chống khối u, ức chế miễn dịch, chống virus, chống sốt rét, kháng sinh…[1]. [...].. .Hải miên không có hệ thần kinh, hệ tiêu hóa hay hệ tuần hoàn Thay vào đó, hầu hết chúng dựa vào việc duy trì một dòng nước ổn định chảy qua cơ thể để thu nhận thức ăn và oxi cũng như thải cặn bã [2] 1.1.1.1 Phân bố, sinh thái Mặc dù có một số loài hải miên nước ngọt nhưng đa phần hải miên là các loài động vật biển, phân bố rộng khắp từ các vùng triều cho tới tận độ sâu hơn 8.800 m [2] 1.1.1.2 Thành. .. 1.3: Cấu trúc hợp chất Haliclonacyclamine B Hình 1.4: Cấu trúc hợp chất Halicyclamine A Tuy nhiên cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài Haliclona subarmigera 1.2 Tổng quan về Steroit [4,5] 1.2.1 Giới thiệu chung Steroit có nhiều trong thiên nhiên và chúng tạo thành một nhóm hợp chất phân phối rộng khắp Do tác dụng sinh lí của steroit nên nó không những... Tổng quan về loài hải miên thuộc chi Haliclona Trong số khoảng từ 5.000 đến 10.000 loài hải miên đã được biết đến, hầu hết chúng sống dựa vào nguồn thức ăn là các vi khuẩn và các mảnh vụn trong nước Đối với một vài vi sinh vật chủ tổng hợp quang năng, chúng thường sản xuất thức ăn và oxi nhiều hơn số chúng tiêu thụ Một số loài hải miên sống trong các môi trường nghèo dinh dưỡng và trở thành động vật... [2] 1.1.1.3 Công dụng Mối liên hệ giữa hải miên và y học đã có từ thời xưa khi các thầy lang thời kỳ La Mã sử dụng một số loài hải miên hòa với Iốt để kích thích quá trình đông máu hoặc trộn với một số dịch chiết thực vật để gây mê bệnh nhân Các hợp chất từ hải miên luôn có những đặc tính quý để phát triển thành thuốc chữa bệnh cho con người trong đó có Haliclona subarmigera cho hoạt chất chống ung thư... vào các loài giáp xác nhỏ Hình 1.2: Hải miên Haliclona subarmigera Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện gần 200 hợp chất thuộc chi Haliclona Thành phần hóa học chủ yếu của các loài Haliclona là các hợp chất thuộc nhóm sterol, axit béo, các ancaloit, các hợp chất chứa brom, một số hợp chất có nhiều nối ba hoặc có cấu trúc rất phức tạp và có hoạt tính gây độc tế bào và kháng sinh mạnh như Haliclonacyclamine... này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược) 1.5.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất, kể cả cấu trúc lập thể của phân tử với việc sử dụng kết hợp... chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau Ngoài... phân bố rộng khắp từ các vùng triều cho tới tận độ sâu hơn 8.800 m [2] 1.1.1.2 Thành phần hóa học Các hợp chất phân lập được thường tập trung vào các nhóm chất nucleosit không điển hình, các tecpen, sterol, các peptit vòng, alcaloit, axit béo và các dẫn xuất của axit amin [1] Thành phần hóa học chủ yếu của các loài Haliclona là các hợp chất thuộc nhóm sterol, axit béo, các ancaloit, các hợp chất chứa... Estron: Công thức phân tử: C18H22O2 Công thức cấu tạo: Estron Phân bố ở hầu hết các cơ quan của cơ thể + Estrion: Công thức phân tử: C18H24O3 Công thức cấu tạo: Estrion + Estradiol: Công thức phân tử: C18H24O2 Công thức cấu tạo:   estradiol   estradiol - Estradiol được phân bố rộng ở khắp nơi trong cơ thể, estradiol chuyển hóa nhiều ở gan, bài tiết qua nước tiểu, một lượng nhỏ qua phân - Sự giảm estradiol... Công thức phân tử: C21H30O2 Công thức cấu tạo: Progesteron Progesteron có bản chất hóa học là hợp chất steroit được tổng hợp từ cholesterol hoặc từ axetyl-coenzim A  Hormon sinh dục nam: gồm có andosterol, testosterol, dehydroepiandosteron, dehydrotestosteron, được gọi với tên chung là androgen  Andosterol: Công thức phân tử: C19H30O2 Công thức cấu tạo: Andosterol  Testosterol: Công thức phân tử: . của loài Hải miên Haliclona subarmigera, chúng tôi đã lựa chọn loài này làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài của khóa luận là Nghiên cứu thành phần steroit từ loài hải miên Haliclona subarmigera . HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC o0o PHẠM THÀNH CÔNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN STEROIT PHÂN LẬP TỪ LOÀI HẢI MIÊN HALICLONA SUBARMIGERA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên. Tổng quan về các loài hải miên và các loài hải miên thuộc chi Haliclona. 1.1.1. Tổng quan về các loài hải miên. Hải miên là các loài động vật thuộc ngành Porifera, chúng có mặt từ thời tiền