Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật là chiết ngâm bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Hiện nay máy chiết ngâm có thể dùng bình thuỷ tinh mà không đòi hỏi phải làm bằng kim loại như trước đây.
Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa và quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết sẽ được lấy ra. . Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Đối với việc chiết các ancaloit, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất
này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoit thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozit trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, để đạt được hiệu quả cao, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì mà chúng ta cần lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung.
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…) tương ứng với pha động và pha tĩnh.
Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh có sự khác nhau. Nguyên nhân của sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực với pha động và pha tĩnh khác nhau. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí nhờ vào đặc điểm trên.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí.
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần):
n = n.b.C 1+b.C
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp phụ nào đó. b : Hằng số.
C : Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí.
Trong phương pháp sắc kí: pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
Theo bản chất của hai pha sử dụng - Pha tĩnh: có thể là chất rắn hoặc chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn: thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang
- Pha động: có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất lỏng: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột.
+ Pha động là chất khí: thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ.
Theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình phân tách chất. - Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography) + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation. - Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography), gel filtration chromatography)
+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.
+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng.
- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)
+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein.
+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.
- Sắc ký lỏng cao áp
+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên để có được một tốc độ chảy thích hợp, phải có một áp lực tác động lên cột Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration).
- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin – layer chromatography). Trong sắc ký giấy:
+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos + Pha động: là chất lỏng
Trong sắc ký lớp mỏng
+ Chất hấp phụ thông dụng trong sắc ký lớp mỏng là silica gel, là loại pha tĩnh với tính chất rất phân cực
+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng
- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)
+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.
+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh
+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột
Theo trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.
Theo cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng.
1.4.3.1. Sắc kí cột (C.C).
Sắc kí cột là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất. Chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chúng được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được) có thể xảy ra nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ, tốc độ chảy
càng giảm. Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).
Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.
Trong sắc kí, Rf được gọi là tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng đường đi của dung môi, với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau. Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.
Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ chất so với chất hấp phụ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.
Trong sắc kí cột, tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất sẽ có các phương pháp khác nhau để có thể đưa chất lên cột . Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.
Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột: - Cách 1: Nhồi cột khô.
Chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.
- Cách 2: Nhồi cột ướt.
Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.
Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò.
Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc độ dòng chảy quá thấp thì sẽ kéo dài thời gian tách và ảnh hưởng đến tiến độ công việc còn nếu tốc độ dòng chảy quá lớn sẽ làm giảm hiệu quả tách.
1.4.3.2. Sắc kí lớp mỏng.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh, thường được sử dụng để kiểm tra và định hướng cho sắc kí cột. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.
1.5. Một số phƣơng pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [6]
Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh…
1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy, IR).
Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi
kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Vì vậy có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất dựa vào phổ hồng ngoại, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700 - 1750 cm-1, của nhóm C = C trong vùng 1630 – 1650 cm-1
, của nhóm ete C – O – C trong vùng 1020 – 1100 cm-1
,... Đặc biệt vùng dưới 700 cm-1 được gọi là vùng vân tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.
Hiện nay, đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác bởi vì thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 – 3 mg chất và khó thu hồi lại.
1.5.2. Phổ khối lượng (Mass spectroscopy, MS).
Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất vì phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác . Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:
- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.
- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.
- Phổ FAB-MS (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.
- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy), cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.
- Ngoài ra, hiện nay người ta còn sử dụng kết hợp các phương pháp sắc kí kết hợp với khối phổ khác như: GC-MS (sắc kí khí - khối phổ) cho các chất dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).
1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của