Nghiên cứu phát triển thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial Fuel Cell) sử dụng làm cảm biến sinh học đánh giá chất lượng nước thải

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- NÔNG MINH TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT MICROBIAL FUEL CELL SỬ DỤNG LÀM CẢM BIẾN SINH H

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NÔNG MINH TUẤN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU

VI SINH VẬT (MICROBIAL FUEL CELL) SỬ DỤNG LÀM CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NÔNG MINH TUẤN

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN THIẾT BỊ PIN NHIÊN LIỆU

VI SINH VẬT (MICROBIAL FUEL CELL) SỬ DỤNG LÀM CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS PHẠM THẾ HẢI

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, Em xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thế Hải, giảng viên bộ môn Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã tận tình hướng

dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Đồng thời em cũng xin cảm ơn Ths Nguyễn Thu Thủy, phòng Vi sinh vật học môi trường, và KTV Đỗ Minh Phương, phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học đã giúp đỡ

trong thời gian em làm luận văn ở phòng

Em cũng xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới các Thầy, Cô trong Khoa sinh Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại Học Quốc Gia Hà Nội, đã tận tình giảng dạy, truyền đạt những kiến thức chuyên môn, bổ ích cho em trong suốt thời gian học tập tại Trường

học-Tôi cũng vô cùng cảm ơn các bạn trong lớp và các em sinh viên phòng Vi sinh vật học môi trường đã động viên, hỗ trợ tôi trong thời gian học tập và làm đề tài

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn vô hạn, con xin gửi lời cảm ơn tới

Bố, Mẹ và những người thân trong gia đình đã nuôi nấng, dậy dỗ, và luôn ủng hộ, động viên con trong suốt quá trình học làm người

Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu mã số 08/HĐ - ĐT.08.14/CNMT thuộc “Chương trình nghiên cứu khoa học, ứng dụng và chuyển giao công nghệ phát triển ngành công nghiệp môi trường” của Bộ Công thương

Hà Nội, ngày….tháng….năm 2014

Học Viên

Nông Minh Tuấn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH ẢNH

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 – TỔNG QUAN 3

1.1 Ô NHIỄM NƯỚC TẠI VIỆT NAM 3

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI SAU XỬ LÝ 5 1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI SAU XỬ LÝ 7

1.3.1 Cảm biến sinh học dựa trên hành vi của sinh vật 7

1.3.2 Cảm biến sinh học vi sinh vật 9

1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT 12

1.4.1 Các loại Thiết kế MFC 15

1.4.2 Vật liệu cấu tạo MFC 17

1.4.2.1 Vật liệu cho điện cực 17

1.4.2.2 Màng trao đổi ion 19

1.4.3 Vật liệu tạo khung cho MFC 22

1.4.4 Ứng dụng của MFC 23

1.5 HỆ VI SINH VẬT TRONG MFC 24

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG MFC 27

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 29

2.1.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 29

2.1.2 Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 30

2.2 CÁC THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Lựa chọn thiết kế tối ưu cho MFC 31

2.2.2 Thiết kế, lắp đặt hệ thống MFC 31

2.2.3 Quy trình làm giầu vi sinh vật trong các MFC: 32

2.2.4 Vận Hành Hệ Thống MFC 33

2.2.5 Đo đạc và xử lý số liệu 35

2.2.7 Phương pháp DGGE 38

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 LỰA CHỌN THIẾT KẾ MFC PHÙ HỢP 43

3.1.1 Lựa chọn vật liệu cho MFC 43

3.1.2 Lựa chọn thiết kế MFC nhằm phát triển cảm biến sinh học 44

3.1.3 Thử nghiệm để chọn lựa thiết kế thiết kế ưu việt hơn 47

3.1.3.1 Kết quả làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa trong MFC 47

3.1.3.2 So sánh các MFC với dạng thiết kế khác nhau 48

3.2 LỰA CHỌN NGUỒN VI SINH VẬT PHÙ HỢP ĐỂ LÀM GIÀU HỆ VI SINH VẬT ĐIỆN HÓA TRONG CÁC MFC 53

3.2.1 Dòng điện phát sinh bởi các MFC trong giai đoạn làm giàu hệ vi sinh vật điện hóa 53

3.2.2 Độ ổn định của dòng điện phát sinh trong MFC sau khi làm giàu thành công hệ vi sinh vật điện hóa 55

3.2.3 Kết quả phân lập hệ vi sinh vật trong điện cực anode của MFC sau khi làm

giàu thành công 57

3.2.4 Kết quả phân tích quần xã vi khuẩn bằng phương pháp DGGE 60

3.2.5 Kết quả phân tích trình tự các băng DNA thu được từ các quần xã trên DGGE 63

3.3 BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM HỆ THỐNG MFC VỚI DUNG DỊCH MÔ PHỎNG NƯỚC THẢI SAU XỬ LÝ TRONG PHÕNG THÍ NGHIỆM 66

KẾT LUẬN 68

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BOD Biochemical oxigen demand Nhu cầu oxy sinh hóa

COD Chemical oxigen demand Nhu cầu oxy hóa học DGGE Denaturing gradient gel

electrophoresis

Điện di gradient gel biến tính

MFC Microbial fuel cell Pin nhiên liệu vi sinh vật

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của một MFC 12

Hình 2: (a) Thiết kế MFC sử dụng chổi than chì là điện cực anode như là một bề mặt cho vi sinh vật phát triển và với điện cực cathode sử dụng vải carbon (b) Biểu diễn phương thức truyền điện tử của trong màng biofilm: sản sinh nanowires, chất truyền điện tử trung gian, và tiếp xúc qua bề mặt tế bào 13

Hình 3: Hai dạng thiết kế MFC 14

Hình 4: Vật liệu carbon sử dụng cho điện cực anodes: (A) giấy carbon, (B) vải các bon, (C) lưới carbon 18

Hình 5: Một vài vật liệu dùng làm điện cực cho MFC (A) Thanh than chì (B; C; D) Tấm than chì 18

Hình 6: (A) Hạt than chì, (B; C) Chổi than chì (D) Sợ than chì 19

Hình 7: Các loại màng được sử dụng trong MFC 21

Hình 8: Cơ chế hoạt động của các loại màng phân tách 21

Hình 9: MFC hai khoang-khung thủy tinh 22

Hình 10: MFC một khoang-khung thủy tinh 22

Hình 11: MFC một khoang- khung polyacrylic 23

Hình 12: MFC hai khoang- khung polyacrylic 23

Hình 13: MFC dạng ống- khung polypropylen 23

Hình 14: MFC một khoang- khung Plexiglas 23

Hình 15 : MFC khoang chữ nhật 32

Hình 16 : MFC khoang trụ 32

Hình 17: Sơ đồ hoạt động hệ thống MFC 34

Hình 19: Biểu đồ hiệu điện thế MFC trong quá trình làm giàu (BOD 50 ppm) 47

Hình 20: Hiệu điện thế MFC khoang hình hộp chữ nhật sau quá trình làm giàu (BOD 50 ppm) 49

Hình 21: Hiệu điện thế MFCs khoang hình trụ sau quá trình làm giàu 49

Hình 22: MFC khoang hình hộp chữ nhất 51

Hình 23: MFC khoang hình trụ 51

Hình 24: MFC khoang hình hộp chữ nhất 52

Hình 25: MFC khoang hình trụ 52

Hình 26: Quá trình làm giàu MFC với nguồn quần xã khác nhau 54

Hình 27: So sánh dòng điện sau quá trình làm của MFC tại hai thời điểm có khoảng là cách 20 ngày 56

Hình 28: Ảnh phân lập mẫu điện cực anode từ MFC đã được làm giàu thành công 57 Hình 29: Tỷ lệ phần trăm số chủng vi khuẩn phân lập được từ điện cực anode tại các MFC 59

Hình 30: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR gen 16s rRNA và vùng V3 60

Hình 31: Kết quả phân tích gen 16S rRNA bằng DGGE của các mẫu quần xã vi khuẩn trong các nguồn khác nhau và các mẫu quần xã vi khuẩn từ điện cực anode của các MFC làm giàu từ các nguồn 62

Hình 32: Kết quả phân tích tương quan của các quần xã vi khuẩn được nghiên cứu dựa trên kêt quả DGGE (bằng cách sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.0) 63

Hình 33: Biểu đồ dòng điện trung bình của MFC thử nghiệm với các nồng độ BOD khác nhau trong dung dịch nước thải mô phỏng ở anode 67

Hình 34: Vị trí các băng DNA trên DGGE được thôi gel và đem giải trình tự 1

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1: Đặc trưng thành phần nước thải của một số ngành công nghiệp 3

Bảng 2: Tổng lượng nước thải và lượng thải các chất ô nhiễm trong nước thải từ một số khu công nghiệp đồng bằng sông hồng 4

Bảng 3: Một số thông số ô nhiễm nước thải trong công nghiệp theo tiêu chuẩn 5

Bảng 4: Theo dõi sự thay đổi hành vi của cá liên kết với điều kiện stress 8

Bảng 5: Tổng hợp nghiên cứu về cảm biến sinh học vi sinh vật quang học 10

Bảng 6: Các chủng vi khuẩn điện hóa trong MFC không sử dụng chất truyền điện tử trung gian 26

Bảng 7: Môi trường LB 35

Bảng 8: Môi trường C 36

Bảng 9: Môi trường PDA 36

Bảng 10: Môi trường Hansen 37

Bảng 11: Môi trường BG 11 37

Bảng 12: Thành phần của dung dịch Trace metal mix A5 38

Bảng 13: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân gen16s rRNA 39

Bảng 14: Thành phần và chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân vùng V3 thuộc gen16s rRNA 40

Bảng 15: Thành phần của dung dịch biến tính 0% và 60% 41

Bảng 16: Thành phần của “Working solution” 41

Bảng 17: Phân tích ưu nhược điểm của các vật liệu cấu tạo MFC 43

Bảng 18: Phân tích ưu nhược điểm vật liệu cấu tạo khung MFC 44

Bảng 19: Phân tích ưu nhược điểm của các loại màng phân tách 44

Bảng 21: Tổng hợp các nghiên cứu về dạng MFC biosensor 46 Bảng 22: Bảng so sánh trình tự các băng DNA đƣợc thôi gel từ gel DGGE với dữ liệu trình tự DNA trên NCBI 64

MỞ ĐẦU

Nước là một phần thiết yếu trong quá trình sinh hoạt–sản xuất của con người Tuy nhiên, với sự phát triển của dân số, quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa, lượng nước do con người sử dụng đang ngày càng gia tăng, đi kèm với nó là hậu quả gây ô nhiễm nước nghiêm trọng Ảnh hưởng của ô nhiễm nước đối với sức khỏe con người có thể thông qua hai con đường: (i) ăn-uống phải nước bị ô nhiễm hay các loại rau quả và thủy sản được nuôi trong môi trường nước ô nhiễm, (ii) do tiếp xúc với môi trường nước trong quá trình lao động và sinh hoạt Ngoài ra ô nhiễm nước còn kéo theo các thiệt hại về kinh tế do bệnh tật, thiệt hại về thủy sản

và nông nghiệp, và ảnh hưởng tới nguồn cung cấp nước sạch [2, 4, 5]

Một trong những nguyên nhân chính gây ô nhiễm nguồn nước hiện nay là tình trạng nước thải chưa qua xử lý hoặc xử lý kém được trực tiếp xả vào môi trường Để ngăn chặn nguy cơ này thì cần phải có các phương pháp hợp lý để đánh giá nhanh chất lượng nước thải sau xử lý, nhằm đáp ứng nhu cầu của người sản xuất cũng như người quản lý [2]

Phương pháp phân tích hóa-lý là phổ biến hiện nay được sử dụng cho việc phân tích-đánh giá chất lượng nước thải Phương pháp này sử dụng mối tương tác giữa chất cần phát hiện trong nước với một loại hóa chất được thêm vào dùng làm chỉ thị để định tính cũng như định lượng chất cần kiểm tra, hoặc áp dụng các kỹ thuật như: sắc ký lỏng cao áp (HPCL), sắc ký phối khổ (GC – MS), hay phương pháp so màu Tuy nhiên, tất cả các kỹ thuật này đòi hỏi người phân tích phải có tay

nghề chuyên môn cao, tốn kém trong sử dụng, và thời gian phân tích dài [1]

Những nghiên cứu gần đây đã tập trung phát triển phương pháp sử dụng tác nhân sinh học như một cảm biến hay một hệ thống cảnh báo sớm chất lượng nước Cảm biến sinh học (biosensor) là hệ thống phân tích các tác nhân sinh học như DNA, enzymes, mô, cơ thể sống kết hợp với việc đánh giá – đo lường các dấu hiệu

đánh giá chất lượng nước như kiểm tra trực tiếp nguồn nước, nhạy cảm với chất độc

và phát hiện nhiều độc tố cùng một thời điểm, cảnh báo chất độc, không chỉ theo dõi độc tính mà còn theo dõi tốc độ thay đổi thành phần-nồng độ chất độc, có thể theo dõi từ xa, dễ dàng sử dụng [9, 32, 66, 70, 73] Trong đó, cảm biến sinh học khai thác quá trình trao đổi chất của vi sinh vật đang được đặc biệt quan tâm nghiên cứu và ứng dụng [32] Pin nhiên liệu vi sinh vật là một dạng thiết bị cảm biến hoạt động dựa trên hoạt tính điện hóa của vi sinh vật Loại thiết bị này được nghiên cứu tại nhiều quốc gia như Hàn Quốc, Hoa Kỳ, hay Châu Âu, chúng có ưu điểm như có khả năng chỉ dẫn BOD nước thải, có thời gian phản ứng nhanh, dễ dàng sử dụng, chi phí thấp [17, 25, 26, 29]

Tại Việt Nam hiện nay những nghiên cứu về pin nhiên liệu vi sinh vật cũng như ứng dụng chúng làm cảm biến sinh học trong đánh giá chất lượng nước thải còn khá hạn chế [52] Nhằm góp phần vào các nghiên cứu về pin nhiêu liệu vi sinh cũng như phát triển một thiết bị cảm biến có khả năng đánh giá chất lượng nước thải với thời gian phân tích nhanh và khả năng sử dụng nhiều lần… chúng tôi tiến hành đề tài “ Nghiên cứu phát triển thiết bị pin nhiên liệu vi sinh vật (Microbial fuel cell)

sử dụng làm cảm biến sinh học đánh giá chất lượng nước thải”

Chương 1 – TỔNG QUAN

1.1 Ô NHIỄM NƯỚC TẠI VIỆT NAM

Ô nhiễm nước xuất phát từ nhiều nguyên nhân khác nhau, tuy nhiên tại Việt Nam hiện nay có bốn nguồn gây ô nhiễm nước chính: nước thải nông nghiệp, công nghiệp, sinh hoạt và y tế Theo Báo cáo môi trường quốc gia 2012 của Việt Nam, nước thải sinh hoạt chiếm 30% tổng lượng nước thải trực tiếp ra các sông hồ; kênh rạch Trong giai đoạn đẩy mạnh công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước, nhiều ngành công nghiệp được mở rộng quy mô sản xuất, cũng như phạm vi phân bố Tuy nhiên mức đầu tư cho hệ thống xử lý nước thải lại chưa đáp ứng được như cầu này,

Số lượng nước thải công nghiệp được xử lý là đang ở mức trung bình (50 – 60%), nhưng hơn 50% hệ thống xử lý đó vẫn chưa hoạt động hiệu quả Cũng theo báo cáo của Sở Tài Nguyên Môi Trường Hà Nội năm 2009, có tới 93% tổng lượng nước thải chưa được xử lý xả thẳng vào hệ thống, lượng nước còn lại chỉ được xử lý sơ bộ trong các bể tự hoại, bể lắng trong tuyến thoát nước Bên cạnh đó, nước thải nông nghiệp cũng là vấn đề đáng quan tâm hiện nay Nước thải nông nghiệp thường chứa các chất hóa chất bảo vệ thực vật, hay thuốc trừ sâu gây hại cho sức khỏe con người

Chế biến nước uống có cồn, bia,

Bảng 2: Tổng lượng nước thải và lượng thải các chất ô nhiễm trong nước thải

từ một số khu công nghiệp đồng bằng sông hồng [4]

Khu Vực

Lượng nước thải (m 3 / ngày)

780 triệu USD trong lĩnh vực sức khỏe cộng đồng vì ô nhiễm môi trường Ô nhiễm sông Thị Vải là một ví dụ điển hình: một đoạn sông dài khoảng 12 km (từ hợp lưu suối Cả-sông Thị Vải tới khu vực cảng Khú Mỹ, phía sau khu công nghiệp Mỹ Xuân) hầu như không một loài tôm, cá, thủy sản nào có thể tồn tại và phát triển Tại khu vực này chỉ còn chứa các động-thực vật phù du Ước tính ban đầu diện tích nông nghiệp bị thiệt hại là 1.438,5 ha, trong đó phần lớn là ao nuôi thủy sản và 29,5

ha là đất nông nghiệp Một ví dụ khác, một nghiên cứu về ảnh hưởng của hoạt động sản xuất tại khu chế biến kim loại màu thuộc tỉnh Thái Nguyên chỉ ra rằng, hàm lượng chì và arsen trong nước thải sinh hoạt tại vùng này cao hơn 1,5 – 6 lần so với vùng đối chứng Qua xét nghiệm máu của phụ nữ trong độ tuổi sinh sản sống liên tục ở vùng nghiên cứu 5 năm cho thấy hàm lượng chì và arsen trong máu của họ cao hơn trong máu của người ở vùng đối chứng 3 – 80 lần [2, 4]

Từ các dẫn liệu trên có thể thấy việc xả nước thải xử lý kém là một trong những nguyên nhân chính dẫn đến ô nhiễm nước nghiêm trọng Vì vậy, một nhu cầu thực tế hiển nhiên được đặt ra là cần có các phương pháp hiệu quả để đánh giá nhanh chất lượng nước thải sau xử lý

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI SAU XỬ LÝ

Đánh giá chất lượng nước cũng như mức độ ô nhiễm của nước cần đựa vào một số thống số cơ bản về thành phần hóa học và sinh học đối với từng loại nước sử dụng với các mục đích khác nhau và so sánh chúng với chỉ tiêu cho phép Các thông

số cơ bản bao gồm: độ pH, màu sắc, độ đục, hàm lượng chất rắn, các chất lơ lửng (huyền phù), các kim loại nặng, chỉ số COD (nhu cầu oxy hóa học-chemical oxygen demand) và BOD (nhu cầu oxy sinh hóa-Biochemical oxygen demand)…

Bảng 3: Một số thông số ô nhiễm nước thải trong công nghiệp theo tiêu chuẩn

tảo, nấm, động vật nguyên sinh…Tổng chất rắn (TS) được xác định bằng trọng lượng khô thành phần còn lại sau khi cho bay hơi 1 lít mẫu nước rồi sấy khô ở

103oC, hay chất rắn huyền phù (SS) là trọng lượng khô của chất rắn sau khi cho 1 lít mẫu nước đi qua giấy lọc sợi thủy tinh rồi sấy ở 103 – 105oC tới khối lượng không đổi [1, 3, 54]

Các kim loại nặng trong nước hay các chất độc hữu cơ (như phenol, DDT, thuốc diệt cỏ…) có thể được đánh giá bằng các phương pháp so màu với thuốc thử, sắc ký, hoặc chuẩn độ theo thể tích với một chất hóa học Ví dụ, để xác định hàm lượng phenol có thể sử dụng một trong hai phương pháp sau: (1) Phương pháp xác định phenol bằng phương pháp đo màu theo nguyên tắc là tách phenol ra khỏi nước

và cho tác dụng với 2-6 dicloroquinon diclorimmid để tạo phức màu xanh của indophenol, và qua cường độ màu thu được ta biết được hàm lượng phenol (đo bước sóng 610 nm) (2) phương pháp chuẩn độ thể tích theo phép đo iot bằng cách cho phenol trong nước tác dụng với brom tạo thành tribromophenol, khi thêm kali iodua vào dung dịch, lượng brom phản ứng thừa với phenol sẽ đẩy iot ra khỏi muối kaliiodua, sau đó ta tiến hành định lượng iot bằng natri thiosunfat và qua đó ta tính được hàm lượng phenol Một ví dụ khác là phương pháp xác định hàm lượng asen trong nước thải bằng cách so màu trên quang sắc kế với bạc dietylthiocacbamat: dùng hydro mới sinh để khử muối asen thành khí asin (AsH3); asin sau khi đi qua một ống chứa bông thủy tinh hoặc giấy lọc tẩm chì axetat rồi đi vào ống hấp thụ có chứa bạc dietylthiocacbamat hòa tan trong pirindin Trong ống hấp phụ asen phản ứng với muối bạc tạo thành một phức tan màu đỏ sử dụng để so màu, cường độ màu

sẽ tỷ lệ với hàm lượng asen có trong nước (đo ở bước sóng 350 - 540 nm)[1, 3]

Chỉ số COD là lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa toàn bộ các chất hữu cơ có trong nước thải thành CO2 và H2O Để xác định chỉ số này người ta thường xử dụng chất oxy hóa mạnh trong môi trường axit (thường là bicromat-

K2Cr2O7) Lượng bicromat dư được chuẩn độ bằng dung dịch muối Fe(NH4)2(SO4)2 với chỉ thị là dung dịch Ferroin (chỉ thị sẽ chuyển từ màu xanh lam sang màu đỏ nhạt) [1, 3, 54]

Mohrp-Chỉ số BOD là nhu cầu oxy cần thiết để oxy hóa các chất hữu cơ có trong nước bằng vi sinh vật (thường là vi khuẩn) dị dưỡng, hiếu khí Quá trình oxy hóa chất hữu cơ này đòi hỏi thời gian dài ngày, phụ thuộc vào bản chất của chất hữu cơ, các chủng loại vi sinh vật, hay nhiệt độ và thành phần độc tính của nước Phương pháp thường sử dụng hiện nay để đo chỉ số BOD của nước là chỉ số BOD5: tức là xác định lượng oxy cần thiết để oxy hóa chất hữu cơ trong 5 ngày tại nhiệt độ 20oC trong bóng tối [1, 3, 54]

Các phương pháp đánh giá chất lượng nước thải ở trên có ưu điểm là: định lượng chính xác nồng độ chất gây ô nhiễm, đã được áp dụng rộng rãi tại nhiều nước trong thời gian dài Tuy nhiên chúng lại có những nhược điểm như: không thể chi ra nhiều tác nhân gây ô nhiễm cùng một lúc, thời gian phân tích khá dài, giá thành đắt, quy trình phân tích đòi hỏi người có chuyên môn cao và máy móc-hóa chất đắt tiền… Vậy nhằm hướng tới sự thuận tiện và hiệu quả (đặc biệt là về mặt thời gian) trong việc đánh giá chất lượng nước thải của người quản lý hay các công ty tư nhân, việc đưa ra được một phương pháp đánh giá nhanh chất lượng nước thải sau xử lý, với chi phí cạnh tranh và dễ sử dụng đang là một nhu cầu bức thiết

1.3 CẢM BIẾN SINH HỌC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NƯỚC THẢI SAU

XỬ LÝ

Một cảm biến sinh học (Biosensor) là một hệ thống phân tích sử dụng các tác nhân sinh học như DNA, enzymes, mô, cơ thể sống kết hợp với việc đánh giá – đo lường các dấu hiệu hóa – lý của các tác nhân sinh học đó Các dạng cảm biến sinh học hay được sử dụng hiện nay để đánh giá chất lượng nước thải thường thuộc hai dạng: (i) cảm biến dựa trên hành vi của sinh vật, hoặc (ii) cảm biến sử dụng vi sinh vật [8, 32, 65, 66]

1.3.1 Cảm biến sinh học dựa trên hành vi của sinh vật

Nghiên cứu hành vi của sinh vật cung cấp các hiểu biết liên quan đến sinh lý

và sinh thái của sinh vật và môi trường của chúng Các đặc tính hành vi này gồm

chuỗi của hành động có thể xác định Việc nghiên cứu các đặc tính này cần dựa trên những hiểu biết về hệ thống thần kinh ngoại vi, và sự tích lũy - biểu hiện của gen, các phản ứng sinh hóa, quá trình sinh lý cần thiết cho cơ thể sống, như việc ăn, sinh sản, tránh xa động vật ăn thịt Các đặc tính hành vi này cho phép các sinh vật

có thể điều chỉnh các nhân tố bên trong và bên ngoài cơ thể nhằm giúp cho chúng

có thể thích nghi với những biến đổi của môi trường Nhờ có các đặc tính hành vi này và sự ổn định của chúng mà sinh vật có thể sống sót, thích nghi, và sinh sản với môi trường sống Năm 1985 Rand đã công bố về hành vi phản ứng với độc tố của sinh vật trong nước, và sau 20 năm đã có nhiều nghiên cứu quan tâm về số hành vi phản ứng của nhiều loài với độc tố, cũng như các cách thức chọn lựa xử lý số liệu

và đánh giá chúng Năm 1986 chính phủ Hoa Kỳ đã chấp nhận hành vi tránh xa chất độc là bằng chứng hợp pháp của tổn thương sinh vật Rất nhiều sinh vật được nghiên cứu về các đặc điểm biến đổi hành vi nhằm ứng dụng để đánh giá chất lượng nước như: cua, bọ nước, cá, sò… [8]

Bảng 4: Theo dõi sự thay đổi hành vi của cá liên kết với điều kiện stress khác nhau

Cá hồi Đại Tây

Cá thái dương DDT Trạng thái kích động Ellgaard 1977

Cá hồi đốm đem Hỗn hợp kim loại

nặng Hành vi tránh xa Svecevicius 2001

Mô hình cá trong kiểm tra đặc tính hành vi độc tố (Bảng 4): Cá là một mô

hình lý tưởng cho việc nghiên cứu các hành vi của động vật với các tác nhân stress

và các độc tố bởi vì: (i) cơ thể cá tiếp xúc trực tiếp với nước của môi trường có chứa nhiều chất hóa học cần thử nghiệm, (ii) môi trường sống của cá khá đa dạng, (iii) cá

dễ dàng nuôi; có khả năng sinh sản; và được nghiên cứu nhiều với các độc tố Bất

cứ nghiên cứu nào hướng tới phát triển một mô hình cảm biến dựa trên phản ứng hành vi của cá cần phải dựa trên những nghiên cứu về đặc điểm sinh thái của loài tương ứng [8]

Mô hình Bọ nước (Daphnia) phát hiện độc tố trong nước: Bọ nước được sử

dụng như một cảm biến sinh học hữu ích trong việc phát hiện độc tố trong nước Chúng có kích thước cơ thể nhỏ, vòng đời ngắn, dễ nuôi và có thể sinh sản trong phòng thí nghiệm và phản ứng nhanh với sự thay đổi của thành phần hóa học trong nước Bọ nước khi được thử nghiệm độc tố sẽ có những thay đổi về đặc điểm hành

vi và sinh lý cơ thể Các chỉ tiêu đánh giá bọ nước trong việc đánh giá chất lượng nước gồm: tốc độ - chiều cao – góc – chuyển động bơi, vị trí phân bố [73]

1.3.2 Cảm biến sinh học vi sinh vật

Cảm biến sinh học sử dụng tập tính hành vi của sinh vật có một số nhược điểm như: thời gian đáp trả dài, nghiên cứu về tập tính sinh vật phức tạp đòi hỏi người nghiên cứu phải có kiến thức chuyên môn sâu, bị ảnh hưởng bởi yếu tố bên ngoài (gây kết quả sai lệch)… Vì vậy, nhiều nghiên cứu gần đây đã tập trung sử dụng vi sinh vật như một mô hình cảm biến sinh học Các vi sinh vật cũng có phản ứng sinh học tốt giống như động vật hay thực vật đôi với tác nhân stress Ngoài ra chúng còn có khả năng phát hiện nhiều chất hóa học hơn, có thể dễ dàng cải biến vật chất di truyền, hoạt động với phổ nhiệt độ và pH rộng, thời gian phản ứng nhanh… Một vài dạng cảm biến sinh học sử dụng vi sinh vật đã được nghiên cứu và phát triển như: các cảm biến dựa trên sự phát quang, sự phát huỳnh quang của vi sinh vật, hoặc cảm biến dựa trên sự điện hóa của vi sinh vật…[32]

Cảm biến sinh học vi sinh vật quang học: là cảm biến dựa trên sự biến đổi

đặc tính quang học như sự hấp thụ tia cực tím, sự phát quang sinh-hóa, gây sự phản

xạ hoặc phát huỳnh quang bởi các phản ứng nội sinh của vi sinh vật (Bảng 5) [32]

Bảng 5: Tổng hợp nghiên cứu về cảm biến sinh học vi sinh vật quang học [32]

Độc tố của chlorophenol P fluorescens 10586r pUCD607 Phát quang

Ni2+ và Co2+ Ralstonia eutropha AE2515 Phát quang

Arsenite E coli DH5α (pPR-arsR-ABS,

biểu hiện gen egfp

Phát quang

Toluen P fluorescens A506 (pTolLHB) Huỳnh quang

Sự phát quang sinh học có liên kết với ánh sáng phát ra từ tế bào vi sinh vật

và đóng vai trò quan trọng trong sự chỉ thị trực tiếp chất ô nhiễm Gen phát quang

lux đã được phát hiện ở Vibrio fischeri và nghiên cứu ứng dụng rộng rãi Có thể thông qua sự biểu hiện của gen lux để đánh giá nồng độ của chất độc ta quan tâm,

bằng cách khai thác quá trình điều hòa của gen này; và qua đó có thể dễ dàng phân tích số lượng nồng độ chất độc dựa vào cường độ phát quang sinh học của sinh vật

chứa gen lux Ngoài ra các gen có khả năng tạo protein huỳnh quang cũng đã được ứng dụng trong việc thiết kế cảm biến sinh học vi sinh vật phát quang như: gen gfp

mã hóa protein phát huỳnh quang màu xanh lá cây [32]

Cảm biến sinh học vi sinh vật điện-hóa: Các cảm biến này hoạt động dựa

trên sự biến đổi của dòng điện (amperometric), điện thế (potentiometric) hay độ dẫn điện (conductometric) trong mối tương quan đến hoạt động trao đổi chất của vi sinh

vật [32]

Cảm biến sinh học vi sinh vật điện hóa dựa trên dòng điện (amperometric microbial biosensor) hoạt động với hiệu điện thế cố định, và tiến hành phân tích

dòng điện phát sinh bởi quá trình vi sinh vật oxy hóa hoặc khử cơ chất xung quanh

bề mặt điện cực Cảm biến này đã được nghiên cứu và ứng dụng trong việc đánh giá nhu cầu oxy sinh hóa (BOD) trong nước Một số chủng vi sinh vật đã được nghiên

cứu sử dụng: Torulopsis candida, Trichosporon cutaneum, Pseudomonas putida, Bacillus subtilis… Ngoài ra, cảm biến sinh học vi sinh vật dựa trên dòng điện phát sinh còn được sử dụng để đánh giá các chất độc trong nước, ví dụ như: Moraxella

sp và P putida phát hiện chất hữu cơ có chứa gốc phosphate là độc tố thần kinh

chứa phosphate có thể sử dụng một số chủng vi khuẩn Flavobacteium sp với dạng điện cực pH, hay có thể hiện urea nhờ chủng Bacillus sp với dạng điện cực chọn

lọc ion NH4+, hay có thể phát hiện trichloroethylene nhờ chủng P aeruginosan

JI104 có dạng điện cực chọn lọc ion chloride [32]

Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) là dạng cảm biến sinh học đã được nghiên

cứu như một cảm biến đo BOD trong một thời gian dài, từ khi Karube và cộng sự

công bố cảm biến BOD kiểu MFC được sử dụng sản xuất khí hydro bởi Clostridium butyricum vào năm 1977 [32] Cảm biến MFC trong việc đánh giá BOD ngày càng

được phát triển và tối ưu nhằm mục đích dễ dàng sử dụng, phát hiện nhanh-trực tiếp nồng độ BOD [17, 25, 26, 35, 36, 45] Ngoài ra hệ thống MFC có thể sử dụng làm cảm biến phát hiện độc tố, nhờ dựa vào sự ức chế cơ chế di chuyển electron hoặc quá trình trao đổi chất của vi khuẩn bởi các thành phần độc tố có trong môi trường Theo Mia và cộng sự khi thử nghiệm MFC với các chất độc như: Pb, Hg, PCB, có

1.4 PIN NHIÊN LIỆU VI SINH VẬT

Pin nhiên liệu vi sinh vật (MFC) là hệ thống có khả năng phát sinh dòng điện

từ sự oxy hóa cơ chất bằng cách sử dụng vi sinh vật Nghiên cứu sớm nhất về MFC được thực hiện bởi Potter vào năm 1911, khi tác giả đã thu được dòng điện phát

sinh trong MFC khi nuôi cấy Escherichia coli và Saccharomyces Tuy nhiên, MFC

không gây được sự chú ý cho đến những năm 1980 khi có những phát hiện rằng mật

độ dòng điện và năng lượng đầu ra có thể được tăng lên cao bằng cách thêm vào MFC chất truyền điện tử trung gian (electron mediator), là chất có thể mang điện tích từ ngoài tế bào tới điện cực âm (anode) Phần lớn các vi sinh vật có các thành phần màng lipid, peptidoglycans, lipopolysaccharides và không dẫn điện, có thể cản trở việc di chuyển của electron tới anode [37, 38]

Hình 1 Nguyên lý hoạt động của một MFC [38]

Ghi chú: Bacterium: vi khuẩn; Anode: cực âm; Cathode: cực dương: MED: chất truyền điện tử trung gian: e-: điện tử

Hiện nay, các nghiên cứu về hệ vi sinh vật nằm trong màng biofilm tại anode của MFC cho thấy có hai phương cơ chế vận chuyển điện tử: thông qua kết nối trực tiếp giữa bề mặt điện cực với màng ngoài tế bào nhờ các cytochrome (vận chuyển e-

trên bề mặt tế bào hoặc nhờ nanowire) hoặc thông qua các chất truyền điện tử trung gian (được bổ sung từ ngoài hoặc do vi khuẩn tự sinh ra) [38, 39]

Hình 2: (a) Thiết kế MFC sử dụng chổi than chì là điện cực anode như là một

bề mặt cho vi sinh vật phát triển và với điện cực cathode sử dụng vải carbon Tại đây sử dụng màng khếch tán polytetrafluoroethylene (b) Biểu diễn

phương thức truyền điện tử của trong màng biofilm: sản sinh nanowires, chất truyền điện tử trung gian, và tiếp xúc qua bề mặt tế bào [39]

Gorby và đồng nghiệp đã công bố về phương tiện truyền điện tử của hai loài

Geobacter sulfurreducens và Shewanella oneidensis và gọi chúng là“nanowires”

Tiếp đến tác giả nghiên cứu đột biến thiếu hụt cytochrome trong hô hấp với giả thuyết rằng những giới hạn từ sự vận chuyển electron của nanowires, những đột biến (mtrC và omcA) đó hầu hết làm suy yếu khả năng sản sinh điện trong MFC

[10, 20] Những quan sát về nanowires trong sự truyền điện tử của G sulfurreducens báo cáo bởi một tác giả khác là Reguera hoàn toàn giống với những công bố của Gorby, nhưng cấu trúc của nanowires sản sinh bởi G sulfurreducens xuất hiện ít sai khác hơn so với S oneidensis Nanowires của G sulfurreducens được coi là một dạng dây đơn, trong khi nanowires của S oneidensis được cho là có

thể tạo thành một bó dây [61]

Ngoài khả năng sử dụng phương thức vận chuyển điện tử thông qua nanowires, một vài vi khuẩn còn có một khả năng khác là vận chuyển điện tử thông qua bề mặt tế bào Một vài nghiên cứu đã chứng minh rằng, tại bề mặt tế bào có các

phân tử protein nhỏ lồi ra có chức năng vận chuyển điện tử, tuy nhiên chúng không phải là nanowires [38, 42]

Các chất truyền điện tử trung gian thường được đưa vào MFC với mục đích nhằm tăng khả năng sản sinh dòng điện của chúng Những nhiên cứu của Poster,

Bond và Lovley đã nhận thấy đối với E coli khi được nuôi cấy thuần trong MFC

mà không bổ sung chất truyền điện tử trung gian sẽ không có khả năng phát sinh dòng điện trong MFC Một số chất đóng vai trò làm chất truyền điện tử trung gian thường được bổ xung vào MFC như là: đỏ trung tính, anthraquinone-2-6, disulfonate [37, 38]

Rabaey và cộng sự đã chứng minh rằng các chất truyền điện tử trung gian có thể được vi sinh vật trong MFC tự sản xuất, ví dụ như pycoanin và một vài thành

phần tương tự sản xuất bởi Pseudomonas aeruginosa Chúng có thể vận chuyển

electron tới điện cực và sản xuất dòng điện trong MFC Việc sản xuất nồng độ cao

chất truyền điện tử trung gian bằng cách nuôi cấy hỗn hợp có P aeruginosa là loài

chủ yếu, trong thiết kế MFC sử dụng ferricyanide ở cathode ( thay cho oxy), sản xuất 3.1 tới 4.2 W/m2

trong MFC [38, 59]

Hình 3: Hai dạng thiết kế MFC [38]

1.4.1 Các loại Thiết kế MFC

Cho đến nay, có khá nhiều các dạng thiết kế MFC được nghiên cứu và phát triển Mỗi dạng thiết kế có những ưu nhược điểm riêng và phù hợp với những mục đích sử dụng nhất định Các dạng thiết kế MFC cơ bản bao gồm:

Hệ thống MFC với cathode không khí: Một thiết kế đơn giản nhằm cải thiện

năng lượng sản xuất trong MFC với cathode tiếp xúc không khí (air cathode) được phát triển bởi Liu và Logan (2004) Dạng buồng đơn này, với cathode tiếp xúc trực tiếp với không khí tỏ ra thuận tiện cho nghiên cứu và sử dụng Khoang phản ứng gồm có tấm đơn 4 cm Acrylic hoặc Lexan (vật liệu có thể khử trùng) với thể tích khoang là 28 ml, hai điện cực được đặt đối nhau ở cuối bề mặt với diện tích phản ứng là 25 m2

/ m3 Trong thử nghiệm đầu tiên anode được làm từ giấy carbon Toray, cathode là dạng vải carbon bao gồm 0.5 mg/ cm2

của chất xúc tác Pt (E – Tek, USA) mặt bên của phản ứng Trong hệ thống phát triển đầu tiên sử dụng màng cation (CEM) của NafionTM 117 và điện trở được sử dụng gồm loại 500 hoặc 1000

Ω Công suất của MFC sử dụng glucose trong thí nghiệm là 494 + 21 mW/ m2

khi thiếu CEM, và 262 + 10 mW/ m2 với CEM, cao hơn đáng kể so với các thiết kế khác Tuy nhiên, một trở ngại lớn với MFC cathode không khí là sự tương tác giữa

ba pha (khí, lỏng, rắn) của phản ứng oxygen với protons và electron trên bề mặt cathode kém, làm cho đòng điện phát sinh trong MFC không ổn định [15, 17, 18,

oxy hòa tan và các hóa chất hòa tan bị thấm qua màng và sang khoang anode Điện trở trong của hệ thống MFC hai khoang khá lớn, nguyên nhân là do khoảng cách giữa hai điện cực và phản ứng không hiệu quả của oxy hòa tan Tuy nhiên, hệ thống này có một số ưu điểm đáng lưu ý là khả năng hoạt động ổn định và sự thuận tiện, đơn giản trong vận hành và chế tạo [15, 18, 26, 37, 38]

Hệ thống MFC hai khoang với dung dịch điện ly ở cathode (catholytes):

Dung dịch điện ly dạng chứa ferricyanide ở cathode, đã được Rabaey và cộng sự (2006) đề xuất, có thể làm tăng năng lượng đầu ra của một MFC lên 4310 mW/ m2

với cơ chất là glucose Việc sử dụng ferricyanide có ảnh hưởng tới sự di chuyển của điện tử tới điện cực tại cathode, và điện trở trong của hệ thống là thấp hơn so với việc dùng ôxy hòa tan Năng lượng đầu ra của hệ thống MFC có khoang cathode chứa ferricyanide tăng lên tới 80% so với của hệ thống sử dụng nước được sục oxy [15, 37, 38]

Một chất khác là permanganate đã được thí nghiệm bởi You và cộng sự (2006) như là chất nhận điện tử Trong hệ thống này năng lượng được sản xuất là

116 mW/m2, cao hơn so với khi sử dụng ferricyanide (26 mW/m2) hoặc oxy hòa tan (10 mW/ m2) Điện trở trong của permanganate (51Ω) cũng thấp hơn so với ferricyanide (73Ω) Một nhược điểm lớn của hệ thống MFC sử dụng dung dịch điện

ly là: Các chất này có thể gây độc, hoặc nếu hoạt động trong thời gian dài thì bị khử hết dẫn đến yêu cầu phải thay chúng thường xuyên [72]

điều bất lợi của hệ thống có thể là hiện tượng oxy từ cathode khuếch tán sang khoang anode gây phải ứng không đặc hiệu [18, 37, 38, 60]

1.4.2 Vật liệu cấu tạo MFC

1.4.2.1 Vật liệu cho điện cực

Vật liệu sử dụng là điện cực trong MFC cần thỏa mãn yêu cầu sau: tính dẫn điện cao, không bị ăn mòn, có diện tích tiếp xúc bề mặt cao, không bị tắc, không đắt tiền, dễ dàng sử dụng, không gây độc cho vi sinh vật; trong đó tính dẫn điện là chỉ tiêu quan trọng nhất Tính dẫn điện có thể được đánh giá bằng cách đo điện trở của vật chất trên khoảng cách Ví dụ độ dẫn điện; của đồng là 0,1 Ω/ cm, của giấy carbon là 0,8 Ω/ cm, của sợi than chì là 1,6 Ω/ cm, của vải than chì là 2,2 Ω/ cm Điện tử sản xuất bởi vi sinh vật cần được truyền từ điểm phát sinh trên bề mặt của vật liệu điện cực tới điểm gom điện ( kết nối với dây), chỉ cần một vài ohms của điện trở trong được thêm vào có thể ảnh hưởng lớn tới công suất [37, 38]

Vải than chì, giấy carbon, xốp carbon (Hình 4): Việc sử dụng điện cực với

bản chất là carbon cho cực âm anode của MFC là phổ biến, vì những vật liệu này có khả năng dẫn điện khá tốt, trơ với các phản ứng điện hóa và phù hợp với sự phát triển của vi khuẩn Giấy carbon rất cứng, giòn, dễ gãy; vải carbon và xốp carbon có

độ dẻo và diện tích bề mặt hoạt động lớn hơn giấy carbon [37, 38]

Hạt than chì (Hình 6A): Rabaey, Aelterman, Heilmann và Logan cũng đã nghiên cứu sử dụng hạt than chì trong MFC, các hạt than chì có kích thước khác

nhau thường d = 1.5 – 5 mm với diện tích bề mặt được công bố vào khoảng 820 –

2700 m2/m3 Hạt than chì có tính dẫn điện khoảng 0,5 - 1Ω/ hạt, và một trong những yêu cầu để đảm bảo khả năng dẫn điện của anode chứa các hạt than chì là cần phải

có sự tiếp xúc giữa các hat trong khoang anode [37, 38, 60]

Hình 4: Vật liệu carbon sử dụng cho

điện cực anodes: (A) giấy carbon, (B)

vải các bon, (C) lưới carbon [38]

Hình 5: Một vài vật liệu dùng làm điện cực cho MFC (A) Thanh than chì (B; C; D) Tấm than chì [38]

Thanh than chì, miếng than chì, xốp than chì (Hình 5): Thanh than chì đã

được sử dụng trong một số nghiên cứu MFC trước đấy, chúng có tính dẫn điện cao (0,2 Ω/ cm) và bề mặt rõ ràng Tuy nhiên, trước khi sử dụng chúng cần được mài với cát để tăng diện tích bề mặt cho vi sinh vật sinh trưởng Than chì miếng cũng có thể được sử dụng trong MFC, nó có đặc điểm khá giống than thanh than chì, và bởi chúng là các miếng nên có diện tích bề mặt lớn, thuận lợi cho việc sử dụng phân tích màng sinh học (biofilm) sinh điện Tuy nhiên, các miếng than chì thường không rỗng và tạo dòng điện thấp hơn so với dạng cấu chúc dạng xốp Chaudhuri và Lovley (2003) đã phát hiện rằng khi tăng diện tích không gian bề mặt của điện cực dạng thanh than chì hoặc xốp than chì thì sẽ làm tăng dòng điện phát sinh bởi MFC

chứa Rhodoferax ferrireducens Tuy nhiên sự ảnh hưởng này là do sự khác biệt diện

tích bề mặt, chứ không phải là do sự khác nhau trong vật liệu[34, 37, 38]

Hình 6: (A) Hạt than chì, (B; C) Chổi than chì (D) Sợ than chì [38]

Sợi than chì và chổi than chì (Hình 6C và 6D): Đặc điểm của các vật liệu

này là diện tích bề mặt lớn và độ xốp cao Lõi của chổi có thể được làm từ các vật liệu không bị ăn mòn như tianium Đường kính nhỏ của sợi than chì (khoảng 7.2 µm) cho phép tạo được diện tích bề mặt lớn, ví dụ với một cây chổi có đường kính

5 cm và dài 7 cm có diện tích khoảng 1,06 m2 Sợi than chì có thể sử dụng trong anode; tuy nhiên, làm sao để phân tán được tốt các sợi trong khoang là một vấn đề còn tồn tại cần được giải quyết [37, 38]

1.4.2.2 Màng trao đổi ion

Màng trao đổi ion là cần thiết để phân tách hai khoang anode và cathode của MFC, chúng có tác dụng chọn lọc sự di chuyển của proton giữa hai khoang, do đó màng trao đổi ion có thể mà một nhân tố giới hạn năng lượng thu được từ MFC Có một số loại màng trao đổi ion chính được sử dụng trong các hệ thống MFC: màng trao đổi cation (CEM), màng trao đổi anion (AEM), màng phân cực (PBM) [24, 38,

63, 74]

Màng trao đổi cation (Hình 7 A và C): Hầu hết màng trao đổi cation (CEM)

là màng Nafion Màng này đã được phát triển từ việc sử dụng trong hệ thống pin hydrogen, và nó đã được tối ưu hóa nhằm tạo ra sự ổn định cho môi trường dẫn điện

có nồng độ proton cao (pH thấp) và lượng nước được kiểm soát nghiêm ngặt Tuy nhiên, nồng độ proton này trở nên bão hòa trong MFC và màng có thể không đạt được chức năng như đã được kỳ vọng Màng Nafion là màng trao đổi proton, được thiết kế cho sự di chuyển proton, nhưng trong MFC nó cho phép cả sự di chuyển của chất mang điện tích dương như (Na+, K+, NH4+, Ca2+, và Mg2+ ) và sự hiện diện của chúng cao hơn 105

lần so với proton hòa tan trong MFC [63] Vậy sự canh tranh

di chuyển của các cation khác sẽ ảnh hưởng tới hệ thống MFC Khi các chất hòa tan

bị tiêu thụ, proton được sản xuất từ khoang anode và được tiêu thụ tại khoang cathode Nếu proton không thể di chuyển đúng tốc độ từ anode tới cathode, pH có thể bị giảm tại anode và tăng tại cathode trong khi sự cân bằng vật chất được duy trì bởi sự di chuyển của các cation khác pH giảm tại anode ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn và dòng điện phát sinh Một dung dịch đệm tốt có thể bù trừ sự thay đổi pH này để làm giảm ảnh hưởng tới điện lượng sinh ra Các tính toán về quá trình khử oxy tại cathode chỉ ra rằng pH có thể ảnh hưởng đến điện thế cathode [37,

38, , 51]

Màng trao đổi anion (AEM) (Hình 7B): Nếu ion H+ không di chuyển hiệu quả qua CEM, sự cân bằng pH trong MFC sẽ bị ảnh hưởng Kim và cộng sự đã báo cáo rằng có thể tăng hiệu quả di chuyển của proton bằng cách sử dụng hóa chất như đệm pH, hay anion phosphate Bên cạnh đó, có thể sử dụng màng trao đổi anion để ngăn cách hai khoang MFC Năng lượng sinh ra có thể lớn hơn khi sử dụng AEM

Do sự có mặt của phosphate trong khoang anode, AEM cho phép toàn bộ anion phosphate di chuyển qua và pH trong khoang anode có thể được duy trì tốt hơn Tuy nhiên, đối với AEM, việc duy trì pH trong khoang cathode sẽ gặp khó khăn và phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng đệm Vì vậy, mật độ dòng điện cao trong hệ thống,

sự di chuyển mạnh của proton là cần thiết cho sự duy trì và cân bằng pH [38, 63]

Màng phân cực (BPM): Màng phân cực bao gồm màng anion và cation được

ghép với nhau Sự tăng lên của hiệu điện thế là lớn hơn sự di chuyển proton qua màng, kết quả là sự di chuyển anions (OH-) từ anode và cation (H+) từ cathode là được cân bằng Ter Heijne và cộng sự (2006) đã phát triển một hệ thống MFC với

anode vận hành ở pH thấp (<2.5) nhưng nếu sử dụng CEM sẽ không đảm bảo điều kiện này Bằng cách sử dụng màng phân cực, họ có khả năng duy trì pH thấp trong khoang cathode và pH trung hòa trong khoang anode Nhược điểm duy nhất của loại màng này là giá thành cao [21, 37, 63]

Hình 7: Các loại màng được sử dụng trong MFC; (A) Màng cation (CMI –

7000, Membranes International, Inc); (B) màng anion (AMI – 7001, Membranes International, Inc); (C) Nafion 117 (Ion Power, Inc) [38]

Hình 8: Cơ chế hoạt động của các loại màng phân tách; (A) CEM sự di chuyển của cation từ anode tới cathode: (B) AEM sự di chuyển của anion từ cathode sang anode: (C) BPM phân tách nước trong ion proton và hydroxyl trong màng (D) màng khảm CMM sự di chuyển cation từ anode tới cathode hoặc/ và anion từ cathode tới anode (PS = Power supply, C + = Cations, A - = Anions) [63]

1.4.3 Vật liệu tạo khung cho MFC

Vật liệu tạo khung cho MFC giúp tạo hình dáng và ngăn cách khoang phản ứng anode và cathode của MFC với điều kiện môi trường bên ngoài Yêu cầu của vật liệu tạo khung MFC là: không độc với hệ vi sinh vật, không bị phản ứng hay bị

ăn mòn với hóa chất thử nghiệm, có thể khử trùng được Có rất nhiều vật liệu đã được báo cáo sử dụng cho việc làm khung MFC, ví dụ như thủy tinh, polyacrylic, polyplastic, polypropylen, plexiglass…[37, 38]

Hình 9: MFC hai khoang-khung thủy

tinh [38]

Hình 10: MFC một khoang-khung thủy tinh [38]

Vật liệu thủy tinh phục vụ cho làm khung MFC: Thủy tinh (bao gồm cả

plexiglass) có thể đáp ứng được những yêu cầu cơ bản của một vật liệu tạo khung cho MFC Đây là các vật liệu rất tốt để phục vụ cho việc nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong MFC, hay để thử nghiệm các nguồn cơ chất mới [38] Tuy nhiên, vật liệu này bộc lộ nhiều hạn chế khi cần chế tác, thay đổi cấu trúc

Vật liệu polyacrylic: Đây cũng là một vật liệu phổ biến được sử dụng trong

nghiên cứu MFC Do tính chất dẻo của polyacrylic, ta có thể dễ dàng chế tác và sửa chữa vật liệu theo cấu trúc, thiết kế mong muốn Hơn nữa, vật liệu này có giá thành không đắt, dễ dàng sản xuất, và có thể khử trùng được [38]

1.4.4 Ứng dụng của MFC

MFC trong sản xuất điện: MFC có khả năng chuyển hóa năng lƣợng hóa học

trong thành phần hóa học của sinh khối thành năng lƣợng điện tích với sự có mặt của vi khuẩn, bởi các năng lƣợng hóa học bị oxy hóa đƣợc tạo thành dòng điện thay

cho phản ứng sinh nhiệt Chaudhury và Lovley đã báo cáo rằng R ferrireducens có

thể phát sinh dòng điện với sản lƣợng đạt 80%, sự chuyển hóa cao hơn khoảng 89%

đã đƣợc báo cáo bởi Rabaey và cộng sự 2003, hay đạt 97% với điện cực bọc bởi Pt

điện tích bị dự trữ trong thiết bị và sự phân bổ điện tích là không đều [15, 18, 37, 38]

MFC trong sản xuất hydro sinh học: MFC có thể được sử dụng để sản xuất

hydrogen thay cho điện Dưới điện kiện hoạt động bình thường, proton được giải thoát bởi các phản ứng khoang anode di chuyển tới khoang cathode kết hợp với oxy tạo ra nước Nếu cung cấp thêm một lượng điện thế nhỏ ở cathode thì có thể thu được hydro MFC có thể sản xuất 8 – 9 mol H2/ mol glucose trong khi các quá trình lên men chỉ sản xuất 4 mol H2/ mol glucose [38]

MFC trong xử lý nước thải: MFC đã được ứng dụng trong xử lý nước thải từ

rất sớm vào năm 1991 bởi Habermann và Pommer Năng lượng phát sinh của MFC trong xử lý nước thải có thể được tạo ra từ quá trình tiêu thụ cơ chất của vi sinh vật,

và các phân tử hữu cơ như acetate, propionate, butyrate có thể được phân hủy thành

CO2 và H2O MFC dạng đơn và MFC thiếu màng được sử dụng cho xử lý nước thải

có thể phân hủy được hơn 80% lượng chất hữu cơ [15, 37, 38, 49]

MFC sử dụng làm cảm biến sinh học: Một ứng dụng khác của MFC hiện nay

đang được quan tâm nghiên cứu là sử dụng làm cảm biến sinh học cho phân tích các chất gây ô nhiễm và chỉ thị kiểm soát chúng Việc phát sinh dòng điện có mối quan

hệ với nồng độ chất hữu cơ trong nước nước thải và điều này rất thuận lợi cho việc thiết kế cảm biến đo BOD (BOD sensor) Nhờ vậy, ta có thể dùng hệ thống MFC như một cảm biến chỉ thị trực tiếp nồng độ BOD trong nước thải Ngoài ra, hệ thống MFC có thể sử dụng làm cảm biến phát hiện độc tố, dựa vào sự ức chế cơ chế di chuyển electron hoặc quá tình trao đổi chất của vi khuẩn bởi các thành phần độc tố

có khả năng phát sinh dòng điện (Deltaproteobacteria, Alphaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria); hay Bacteroidetes; Acidobacteria, Firmicutes Nấm men Pichia anomala và vi khuẩn lam Synechocytis sp PCC 6803

cũng đã được phát hiện ra là có khả năng sản xuất dòng điện trong MFC Một nghiên cứu của Kim và công sự đã công bố cấu trúc hệ vi khuẩn hoạt động trong MFC bằng phương pháp phân tích thư viện nhân dòng gen 16s rRNA đã nhận thấy

rằng, Bacteriodetes chiếm số lượng lớn với 32,5 % trong tổng số trình tự nhân dòng, tiếp đến là Betaproteobacteria là 23,9 %; Firmicutes 14,2 %; Grammaproteobacteria 10,6 %; Alphaproteobacteria 6,9 %; Spirochaetes 5.9 %; Acidobacteria 2,6 %; Deltaproteobacteria và Planctomycetes chiếm 0,3 %; và các

trình tự chưa định danh được chiếm 1.3% Một nghiên cứu khác của Choo và công

sự (2006) lại chỉ ra rằng lớp vi khuẩn chiếm ưu thế tròng MFC được làm giàu với

nồng độ glucose và glutamate là Grammaproteobacteria (36,5%), mặt khác Logan

và Regan (2006) lại tìm thấy lớp Sigmaproteobacteria là chiếm ứu thế trong quần

xã vi sinh vật điện hóa trong MFC và chúng có trình tự tương đồng gen 16s rRNA

lớn hơn 95% với loài Desulfuromonas acetoxidans Geobacter sulfurreducens và Shewanella oneidensis là các vi khuẩn điện hóa điển hình được tìm thấy trong nhiều

hệ thống MFC và tương tác của chúng với điện cực trong MFC đã được nghiên cứu

kỹ (Bảng 6) Bên cạnh đó, trong một số hệ thống khác, các vi khuẩn thuộc chi

Pseudomonas được phát hiện và khả năng tương tác của chúng với điện cực thông

qua chất truyền điện tử trung gian tự sinh đã được chứng minh Ngoài ra, rất nhiều loài vi khuẩn thông qua nuôi cấy đơn chủng trong MFC đã được chứng minh là có khả năng sinh ra dòng điện (Bảng 6) [16, 27, 39, 41]

Bảng 6: Các chủng vi khuẩn điện hóa trong MFC không sử dụng chất truyền điện tử trung gian [39, 43, 50]

Năm phát hiện Vi khuẩn

Ochrobactrum anthropi YZ-1 Desulfovibrio desulfuricans Acidiphilium sp 3.2Sup5 Klebsiella pneumoniae L17 Thermincola sp JR

Pichia anomala

Ảnh hưởng của vi sinh vật tới hoạt động của MFC: Như ta đã biết MFC hoạt

động dựa trên quá trình trao đổi chất của vi sinh vật Do đó, sự phát triển của vi sinh vật trong MFC, nguồn vi sinh vật sử dụng làm giàu, hay phương thức làm giàu đóng một vai trò quan trọng đến sự phát sinh dòng điện, điều kiện hoạt động, và năng lượng thu được của MFC Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng, những MFC được làm giầu từ nguồn vi sinh vật hỗn hợp có thể cho dòng điện lớn hơn so với làm giàu đơn

chủng Logan đã báo cáo rằng MFC được làm giàu từ quần xã có công suất lớn hơn 22% (576 mW/m2) so với MFC làm giàu từ chủng Geobacter sulfurreducens Ngoài

ra, các quần xã vi sinh vật khác nhau có thể ảnh hưởng tới điện trở trong của MFC

Ví dụ, Ana và cộng sự (2011) đã công bố với MFC làm giầu từ quần xã khử lưu huỳnh có điện trở trong 2550 ohm, trong khi các quần xã methanol và quần xã hiếu khí có điện trở trong lần lượt là 6400 ohm và 115000 ohm Hơn nữa, công suất đầu

ra và điều kiện hoạt động của MFC còn bị giới hạn bởi tốc độ sinh trưởng và mối quan hệ của các chủng vi sinh vật trong quần xã Một bằng chứng là trường hợp

chủng vi khuẩn khuẩn Gram dương Brevibacillus sp PHT1 có thể chuyền điện tử ngoại bào nhờ có hoạt động trao đổi chất của Pseudomonas sp [27, 39, 41, 57, 67]

1.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT TRONG MFC

Phương pháp phổ biến sử dụng nghiên cứu quần xã vi sinh vật là phương pháp phân lập-nuôi cấy truyền thống Tuy nhiên, việc phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật dựa trên nuôi cấy còn nhiều hạn chế, vì các vi sinh vật có kích thước nhỏ bé, dẫn đến sự khó khăn trong phân biệt hình thái của chúng; và vì số lượng vi sinh vật nuôi cấy được là rất thấp Theo một số nghiên cứu gần đây, chỉ có khoảng 1% các chủng vi khuẩn là ta có thể phân lập được bằng các phương pháp nuôi cấy hiện có [7, 46]

Gần đây, các phương pháp sinh học phân tử đã được áp dụng để phân tích quần xã vi sinh vật như: RFLP (đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn), RADP (phân đoạn DNA đa hình được khuếch đại ngẫu nhiên), DGGE (Điện di gel biến tính-denaturing gradient gel electrophoresis) DGGE là phương pháp phân tách các đoạn DNA có chiều dài tương đồng nhau nhưng khác nhau về trình tự sắp xếp, sự phân tách này dựa trên sự giảm tốc độ di chuyển của các sợi DNA đôi có thành phần khác nhau, bị biến tính trong gel polyacrylamide với nồng độ chất biến tính tăng dần (chất biến tính là hỗn hơn urea và formamide), qua đó chúng sẽ dừng lại tại các điểm khác nhau trên gel Nhằm tăng độ đặc hiệu quá trình phân tách các đoạn DNA có trình tự khác nhau, đầu cuối 5’ của đoạn DNA được thêm vào trình tự

thường các kẹp GC thường có độ dài từ 30-50 nucleotide DGGE đã được sử dụng trong: phân tích quần xã vi sinh vật, chỉ dẫn sự thay đổi của quần thể vi sinh vật, phát hiện các trình tự DNA không tương đồng….[46-48, 64]

DGGE tỏ ra đặc biệt hiệu quả khi sử dụng để phân tích so sánh trình tự gen 16s rRNA của vi khuẩn Trình tự 16s rRNA được sử dụng rộng rãi trong phân loại

vi khuẩn Vùng 16s rRNA có 9 vùng biến động (ký hiệu từ V1-V9), đã được chứng minh là có mức độ đa dạng trình tự cao giữa các vi khuẩn khác nhau và có thể sử dụng cho phân loại các loài Ví dụ, vùng V2 và V3 có kích thước khoảng 200 bp có khả năng phân biệt được 110 loại vi khuẩn khác nhau tới mức độ chi Tuy nhiên, các vùng này thường ngắn và không thể chỉ sử dụng một vùng biến động mà có thể phân biệt được tất cả các loại vi khuẩn [12, 47]

Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Nghiên cứu này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Vi sinh vật học

- Khoa Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, sử dụng các máy móc, thiết bị chuyên môn dùng trong nghiên cứu vi sinh vật học, Sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn:

- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ)

- Máy ly tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Máy điện di ngang (BioRad, Mỹ)

- Máy DGGE K-2401 (C.B.S Scientific, Mỹ)

- Bàn soi gel LMW-20 UVP (UK)

- Kính hiển vi quang học (Zeiss, Đức)

Hóa chất sử dụng cho nuôi cấy vi sinh vật: Pepton, các muối (NaCl, MgSO4, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4…); nguyên tố vi lượng (H3BO3, CoCl2.6H2O ) có xuất xứ Trung Quốc (Xilong), Agar (Việt Nam), Cao nấm men (Sigma, Hoa Kỳ)

Hóa chất sử dụng trong phương pháp điện di gel biến tính DGGE: Acrylamide, Bis-AA, 50x TAE buffer, Formamide, TEMED (tetramethyl ethylenediamine), APS (Ammonium persulfate) do hãng Affymetric (USB, Mỹ) cung cấp

Hoá chất sử dụng trong các thí nghiệm Sinh học phân tử: Bộ hóa chất sử dụng tách ADN (Glycogen 20 mg/ml, Ethanol 100 %, Ammonium acetate) , phản ứng PCR (USB Taq PCR Master Mix 2x), điện di kiểm tra sản phẩm PCR (HydraGreen Safe ADN Stain 20 000x, Loading Dye 6x, GeneRuler 1kb ADN Ladder), tinh sạch sản phẩm PCR (ExoSAP-IT PCR Product Cleanup) Tất cả đều được cung cấp bởi Affymetric USB, Merck và Fermentas (Mỹ)