Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm vibrio

Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Trang 1 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 1. Giới thiệu chung Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria. Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm. Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh. Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu phẩy, di động, sống kị khí tuỳ ý, có các phản ứng catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H 2 S, nhạy cảm với Vibriostaticum O/129. Trừ V. cholera hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng trưởng và thường xuyên được phân lập được từ các vùng nước ven biển. Giống này có 4 loài là tác nhân gây bệnh cho người gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V.vulnificus, V. alginolyticus. Người ta đã xác định được 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: V. cholera, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus. Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) là vi khuẩn hình cong dấu phẩy (do đó được gọi là phẩy khuẩn) không bắt mầu gram, không sinh nha bào, di động nhanh nhờ có một lông. Phẩy khuẩn tả dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (pH từ 8,5-9,0) và mặn. Phẩy khuẩn tả có khoảng 140 nhóm huyết thanh đã được xác nhận, nhưng chỉ có nhóm huyết thanh O là gây được bệnh tả. Phẩy khuẩn tả được chia thành V. cholerae O1 và không O1 (Vibrio cholera không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG). Vibrio cholerae gồm 2 tuýp sinh học (biotype) là vi khuẩn tả cổ điển và tả El Tor. Mỗi tuýp sinh học lại được chia thành các tuýp huyết thanh như Ogawa, Inaba và Hikojima. Phẩy khuẩn tả gây bệnh bằng độc tố ruột. Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng AMP vòng, làm giảm hấp thu Na + , tăng tiết Cl - và nước gây tiêu chảy cấp tính. Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay Trang 2 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio đổi tính di truyền do đột biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh. Phẩy khuẩn tả dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ (80 0 C/5 phút), bởi hóa chất (Clo 1 mg/lít) và môi trường axit. Khô hanh, ánh nắng mặt trời cũng làm chết phẩy khuẩn tả. Nó có thể tồn tại lâu trong phân, đất ẩm, nước, thực phẩm. Trong đất, phẩy khuẩn có thể sống 60 ngày, trong phân 150 ngày, trên bề mặt thân thể 30 ngày, trong sữa 6-10 ngày, trên rau quả 7-8 ngày, trong nước 20 ngày. Nhiệt độ 25 0 C- 37 0 C, nồng độ muối 0,5 đến 3%, độ pH kiềm (7 - 8,5) và giàu chất dinh dưỡng hữu cơ trong nước là những điều kiện tối ưu cho phẩy khuẩn tả tồn tại. Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae có khả năng gây bệnh đường ruột. Vibrio vulnificus có thể vào cơ thể thông qua vết thương hở hoặc do bệnh nhân uống nước biển chứa vi khuẩn. Triệu chứng nhiễm khuẩn thường xảy ra là nôn, sốt, tiêu chảy và hạ huyết áp. Những người có hệ miễn dịch hoạt động yếu như bệnh nhân ung thư, rối loạn thận, bệnh gan mạn tính, hoặc nhiễm HIV dễ có nguy cơ nhiễm vi khuẩn này. V. cholerae V. parahaemolyticus V. vulnificus V. alginolyticus - Phản ứng oxidase (+) - Tăng trưởng được trong môi trường canh trypton ở 42 o C - Arginine dehydrolase (-) - Lysine decarboxylase (+) - Lên men được sucrose - Khử nitrate thành nitrite - Có thể tăng trưởng trong môi trường chứa 0-3% NaCl, không phát triển được trong môi trường chứa 6,8- 10% muối. - Phản ứng oxidase (+) - Phát triển được trong canh trypton ở 24 o C - Phản ứng ADH (-), LDC (+) - Khử nitrate thành nitrite - Không lên men sucrose - Không sinh hơi - Tăng trưởng trong môi trường chứa 8% muối, ức chế trong môi trường chứa 10% muối. - Không lên men sucrose - Không tăng trưởng được trong môi trường không có muối, ức chế trong môi trường có 8- 10% muối. - Không lên men sucrose - Phát triển được trong môi trường chứa đến 10% muối. o Có thể phát hiện các loài Vibrio dựa trên nguyên tắc sau: Trang 3 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio - Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng. - Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng. Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thí nghiệm sinh hoá và huyết thanh lọc. - Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus là nước pepton kiềm. Trong khi đó môi trường Clistine Polymicine Broth thường được dung để tăng sinh V. parahaemolyticus. Môi trường thường dùng để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar). Các vi sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng và làm acid hoá môi trường bên dưới khuẩn lạc. Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh. 2. Quy trình phân tích và nguyên tắc xác định 2.1 Tăng sinh chọn lọc: - Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu, vì vậy ta sử dụng lượng mẫu lớn. Và cũng chính vì khó phát hiện nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng bằng cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường hợp V. cholera, V. alginolyticus và V. vulnificus; canh Colistine cho trường hợp V. parahaemolyticus. - Mẫu lỏng: cho vào nước peptone kiềm, ủ ở 37 o C trong 18 – 24 giờ Trang 4 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio - Mẫu rắn: cho vào túi PE vô trùng chứa nước peptone kiềm và đồng nhất trong máy dập mẫu rồi ủ ở 37 o C trong 18 – 24 giờ. 2.2 Phân lập: - Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar. Ủ ở 37 0 C/24h. - Cấy khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường TSA hay thạch máu. - Ủ 37 0 C để lấy sinh khối cho bước tiếp theo là thử nghiệm sinh hóa.  Nhận diện khuẩn lạc điển hình : Trang 5 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 2.3 Thử nghiệm sinh hóa + Quan sát tính di động và hình thái trên kính hiển vi • Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X. • Ghi nhận kết quả: di động hay bất động, hình dạng tế bào. - Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên.Soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi thấy vi khuẩn tả di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường. - Lam kính 2: Nhỏ 1 giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh tả đa giá. Nếu là vi khuẩn tả thì vi khuẩn sẽ bị bất hoạt, không di động nữa. Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, vi khuẩn tả di động như sao đổi ngôi . + Thử nghiệm khả năng lên men đường • Môi trường: Phenol red broth base pH 7.4 • Chỉ thị pH: đỏ phenol, màu đỏ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8 • Kiểm nghiệm khả năng lên men: lactose, sucrose, mannose • Bổ sung đường vào môi trường rồi khử trùng • Sau đó cấy và ủ 370C trong 18 – 20 giờ • Đánh giá dựa vào sinh acid (làm đổi màu chỉ thị) và sinh hơi (CO 2 tạo thành được bẫy lại trong ống Durham). • Kết quả: o Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng Trang 6 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio o Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ + Thử nghiệm Decarboxylase • Enzyme carboxylase do VK tạo ra loại nhóm carboxyl của acid amin tạo amin hay diamin và CO 2 • Môi trường: Decarboxylase Basal Medium • Chỉ thị: Bromothymol purple pH 6.0, vùng chuyển màu pH 5.2 – 6.8 thay đổi từ vàng thành tím • Kiểm nghiệm: ADH, LDC • Hấp khử trùng môi trường rồi cấy • Bổ sung dầu khoáng hay parafin rồi ủ 37 0 C trong 1 đến 4 ngày • Kết quả: (+) Môi trường đục, màu tím (CO 2 sinh ra làm thay đổi pH, đổi màu chỉ thị). (-) Môi trường trong, màu vàng + Thử nghiệm khả năng sinh Indol • Môi trường: Trypton • Thuốc thử: Kovac’s • Cho thêm eter để chiết Indol • Ủ 44.5 0 C trong 24 giờ • Kết quả: (+) Bề mặt môi trường màu đỏ (-) Bề mặt môi trường có màu vàng của thuốc thử (đôi khi có màu cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của Indol tạo ra) Trang 7 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio + Thử nghiệm H 2 S • Enzym desulfohydrase do VK tổng hợp sẽ xúc tác sự chuyển hóa acid amin chứa lưu huỳnh (cystein, cystin, methionin) và phóng thích H 2 S. • Môi trường: • Thạch nghiêng: KIA, TSI • Thạch đứng: SIM, PIA • Đĩa petri: BSA • Cấy vào môi trường rồi ủ 37 0 C trong 24 – 48 giờ hoặc đến 7 ngày nếu cần. • Kết quả: (+) Môi trường xuất hiện màu đen do H 2 S tạo tủa đen với sulfide trong môi trường. (-) Môi trường không có sự xuất hiện hay chuyển màu đen. + Thử nghiệm Oxidase Trang 8 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio • Xác định sự hiện diện của enzym oxidase ở VSV. Enzym quan trọng nhất của hệ enzym này là cytochrome oxydase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí. • Thuốc thử: p – phenylenediamine • Cấy lên ống thạch nghiêng rồi ủ 24 – 48 giờ • Tiếp tục tiến hành theo 1 trong 2 cách: • Nhúng giấy lọc vào tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochloride 1%, dùng que cấy dàn đều sinh khối lên tấm giấy lọc đó. • Nhỏ lên sinh khối vài giọt p – aminophenylenediamine oxalate 1% và α – napthol 1% trong ethanol. • Kết quả: (+) Xuất hiện màu xanh dương đậm do có sự hiện diện của cytochrom khử trong tế bào làm thuốc thử oxy hóa thành indolphenol. (-) Không xuất hiện màu xanh dương + Thử nghiệm ONPG • Các VK lên men lactose tổng hợp trong tế bào tạo enzym β – galactosidase. Enzym này xúc tác thủy phân lactose và permease có vai trò vận chuyển lactose vào trong tế bào • Môi trường: ONPG broth 0.6% (o – nitrophenyl – D – galactopyranoside) trong dung dịch Na 2 HPO 4 1mM. • Khử trùng môi trường, cấy và ủ 37 0 C trong 24 giờ • Kết quả: (+) Xuất hiện màu vàng trong dịch cấy do quá trình thủy phân phóng thích o – nitrophenol có màu vàng. (-) Không xuất hiện màu vàng Trang 9 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio + Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men • Nhằm xác định VSV biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa hay lên men, quá trình lên men tạo môi trường có tính acid cao hơn quá trình oxi hóa => làm đổi màu chỉ thị. • Môi trường: Hugh – Leifson chứa glucose là nguồn carbon duy nhất • Chỉ thị: Bromothymol Blue • Cấy VSV vào 2 ống môi trường, sau đó chỉ có 1 ống phủ lên bề mặt lớp dầu khoáng parafin để cản sự tiếp xúc với oxi không khí. • Ủ 2 ống ở 37 0 C trong 24 – 48 giờ + Thử nghiệm kháng huyết thanh Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng Trang 10 [...]... Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Thạch TCBS 5 Xác định tính chất sinh vật hóa học 6 Tiêu chuẩn xác định V parahaemolyticus Phẩy khuẩn, Gr (-) Oxidaza: (+) VP: (-) Di động: (+) NaCl 0%; (-), NaCl 6%: (+) NaCl 8%: (+) NaCl 10%: (-) Glucoza (+), Lactoza (+) Sacaroza:(-), Hơi (+); ADH: (-) ODC: (+) LDC: (+) 4 Chỉ tiêu của Vibrio trong thực phẩm Trang 19 H2S: (-) Kanagawa (-) Tiêu chuẩn hiện hành. .. Trang 13 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio - KOH, α naphton - Dầu parafin vô trùng - Thuốc nhuộm Gram Chú ý: tất cả các loại môi trường phải có ít nhất 3% muối NaCl IV CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ 1 Chuẩn bị môi trường Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và... manitol, arabinoza - Dùng canh thang có chỉ thị màu bromocresol để xác định tính chất lên men các loại đường Để tủ ấm 350C/ 4 - 5 ngày rồi đọc kết quả b) Tính chất ưa muối - Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống canh thang muối (STB) có NaCl từ: 0%; 6%; 8%, 10% ủ ấm ở 350C/24 giờ Trang 16 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio c) Thử nghiệm VP - Từ canh thang TSB cấy vào canh thang Clark-lubs,... tháng 7 năm 2001 của Bộ trưởng Bộ Y tế) I NGUYÊN LÝ PHƯƠNG PHÁP Trang 12 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Vibrio parahaemolyticus phát triển được trong môi trường có nồng độ muối cao Lựa chọn khuẩn lạc V parahaemolyticus xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy II PHẠM VI ÁP DỤNG Phát hiện các ô nhiễm do Vibrio parahaemolyticus trong sản phẩm thuỷ sản và thức ăn chế biến sẵn III.. .Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio ngưng kết ở giọt nước muối Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện Một số phương pháp nhanh: + Test kit: Thường được dùng để sàng lọc ở một phạm vi lớn, một số sản phẩm cũng đã được thương mại + Phương pháp miễn dịch: như EIA,... nghiệm, phải làm tan băng 2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-1 - Cân chính xác 50 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút chính xác 50ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón chứa sẵn 450 ml nước đệm muối 3% - Lắc đều 2 - 3 phút Thu được dung dịch mẫu thử 10-1 Trang 14 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10-2,10-3,10 -4 - Hút chính xác 50ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang... cả các mẫu, số khuẩn lạc đều lớn hơn M - Khi c : n > 2 : 5 Bảng 3 Chỉ tiêu vi sinh vật của Surimi Tên chỉ tiêu Mức và yêu cầu 1 Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tính bằng số khuẩn lạc trong 1 g sản phẩm, không lớn hơn 100.000 2 Tổng số coliform, tính bằng số khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, 100 Trang 21 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio không lớn hơn 3 Staphylococcus aureus, tính bằng số khuẩn lạc... có vi khuẩn phát triển cấy sang các đĩa thạch TCBS Ria cấy để tạo được các khuẩn lạc riêng rẽ - Ủ ở 350C/18 - 24 giờ Bước 3: - Quan sát và nhận định khuẩn lạc trên thạch TCBS - V parahaemolyticus có khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, đường kính 2 - 3mm trung tâm khuẩn lạc có màu xanh hoặc xanh lá cây Trang 15 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Bước 4: Tăng sinh thuần chủng và xác định hình thể, tính... khuẩn lạc trong 1g sản phẩm, M = 100 n=5 c=2 Trang 20 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio m = 10 Hoặc E coli (trên môi trường đặc), tính bằng số khuẩn lạc trong1g sản phẩm M = 100 n=5 c=1 3 Vi sinh vật gây bệnh, tính bằng số khuẩn lạc trong 25 g sản phẩm : Khôngcho phép - Salmonell c=0 n=5 Không cho phép - Shigella n=5 c=0 Không cho phép - Vibrio cholera n=5 c=0 + Trong đó : - n là số mẫu - m... PCR (Labelled DNA probes ) từ mẫu thực phẩm, hơn nữa còn có thể xác định độc tố của V.cholerae mà bằng phương pháp phân tích từ các chủng V.cholerae rất khó khăn Trang 11 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Quy trình phát hiện và định danh V cholera và V parahaemolyticus Đồng nhất 25g mẫu trong 225ml APW hoặc Colistine Ủ canh khuẩn ở 37oC Phân lập lên TCBS Phân lập lên TCBS Ủ ở 37oC trong 24 . Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Trang 1 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio 1. Giới thiệu chung Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae,. Kanagawa (-) 4. Chỉ tiêu của Vibrio trong thực phẩm Trang 19 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio Bảng 1. Chỉ tiêu vi sinh sản phẩm thuỷ sản đông lạnh - cá basa philê. Tên chỉ tiêu Mức 1. Tổng. xuất hiện màu đen do H 2 S tạo tủa đen với sulfide trong môi trường. (-) Môi trường không có sự xuất hiện hay chuyển màu đen. + Thử nghiệm Oxidase Trang 8 Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm Vibrio •