Tiêu chuẩn hiện hành để kiểm nghiệm vibrio

Vi khuẩn tả Vibrio cholerae là vi khuẩn hình cong dấu phẩy do đó được gọi là phẩy khuẩn không bắt mầu gram, không sinh nha bào, di động nhanh nhờ có một lông.. alginolyticus - Phản ứng

Tiêu chuẩn hiện hành

để kiểm nghiệm Vibrio

1 Giới thiệu chung

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, bộ Vibrionales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria Đặc điểm chung các loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio: Gram

âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0.3-0.5 x 1.4-2.6 μm Chúng không hình thành bào tử và chuyển động nhờ một tiên mao hoặc nhiều tiên mao mảnh.

Vibrio là vi sinh vật gram âm, hình que hai đầu không đều nhau tạo thành hình dấu

phẩy, di động, sống kị khí tuỳ ý, có các phản ứng catalase và oxidase (+), lên men glucose nhưng không sinh hơi, không sinh H2S, nhạy cảm với Vibriostaticum O/129 Trừ

V cholera hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loài Vibrio khác đều cần muối để tăng

trưởng và thường xuyên được phân lập được từ các vùng nước ven biển Giống này có 4

loài là tác nhân gây bệnh cho người gồm: V cholera, V parahaemolyticus, V.vulnificus,

V alginolyticus.

Người ta đã xác định được 21 loài thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây bệnh cho người gồm: V cholera, V parahaemolyticus, V vulnificus, V alginolyticus.

Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) là vi khuẩn hình cong dấu phẩy (do đó được gọi là phẩy

khuẩn) không bắt mầu gram, không sinh nha bào, di động nhanh nhờ có một lông Phẩy khuẩn tả dễ nuôi cấy trong môi trường nghèo dinh dưỡng, pH kiềm (pH từ 8,5-9,0) và mặn Phẩy khuẩn tả có khoảng 140 nhóm huyết thanh đã được xác nhận, nhưng chỉ có

nhóm huyết thanh O là gây được bệnh tả Phẩy khuẩn tả được chia thành V cholerae O1

và không O1 (Vibrio cholera không ngưng kết với O1 còn được gọi là chủng NAG) Vibrio cholerae gồm 2 tuýp sinh học (biotype) là vi khuẩn tả cổ điển và tả El Tor Mỗi

tuýp sinh học lại được chia thành các tuýp huyết thanh như Ogawa, Inaba và Hikojima Phẩy khuẩn tả gây bệnh bằng độc tố ruột Độc tố ruột gắn vào niêm mạc ruột non, hoạt hoá enzyme adenylcyclase dẫn đến tăng AMP vòng, làm giảm hấp thu Na+, tăng tiết Cl-

và nước gây tiêu chảy cấp tính Phẩy khuẩn tả có thể chuyển hóa trong thiên nhiên, thay

đổi tính di truyền do đột biến từ chủng không gây dịch có thể thành chủng gây dịch và kháng nhiều loại kháng sinh Phẩy khuẩn tả dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt độ (800C/5 phút), bởi hóa chất (Clo 1 mg/lít) và môi trường axit Khô hanh, ánh nắng mặt trời cũng làm chết phẩy khuẩn tả Nó có thể tồn tại lâu trong phân, đất ẩm, nước, thực phẩm.

Trong đất, phẩy khuẩn có thể sống 60 ngày, trong phân 150 ngày, trên bề mặt thân thể

30 ngày, trong sữa 6-10 ngày, trên rau quả 7-8 ngày, trong nước 20 ngày Nhiệt độ 250C-

370C, nồng độ muối 0,5 đến 3%, độ pH kiềm (7 - 8,5) và giàu chất dinh dưỡng hữu cơ trong nước là những điều kiện tối ưu cho phẩy khuẩn tả tồn tại

Vibrio parahaemolyticus và Vibrio cholerae có khả năng gây bệnh đường ruột.

Vibrio vulnificus có thể vào cơ thể thông qua vết thương hở hoặc do bệnh nhân uống

nước biển chứa vi khuẩn Triệu chứng nhiễm khuẩn thường xảy ra là nôn, sốt, tiêu chảy

và hạ huyết áp Những người có hệ miễn dịch hoạt động yếu như bệnh nhân ung thư, rối loạn thận, bệnh gan mạn tính, hoặc nhiễm HIV dễ có nguy cơ nhiễm vi khuẩn này

alginolyticus

- Phản ứng oxidase (+)

- Tăng trưởng được trong môi

trường canh trypton ở 42oC

- Arginine dehydrolase (-)

- Lysine decarboxylase (+)

- Lên men được sucrose

- Khử nitrate thành nitrite

- Có thể tăng trưởng trong

môi trường chứa 0-3%

NaCl, không phát triển được

trong môi trường chứa

- Khử nitrate thành nitrite

- Không lên men sucrose

- Không sinh hơi

- Tăng trưởng trong môi trường chứa 8% muối, ức chế trong môi trường chứa 10% muối

- Không lên men sucrose

- Không tăng trưởng được trong môi trường không

có muối, ức chế trong môi trường có 8-10% muối

- Không lên men sucrose

- Phát triển được trong môi trường chứa đến 10% muối

o Có thể phát hiện các loài Vibrio dựa trên nguyên tắc sau:

- Một lượng mẫu xác định được tăng sinh trong môi trường chọn lọc đặc trưng.

- Cấy phân lập từ môi trường tăng sinh sang môi trường phân biệt chọn lọc đặc trưng Các khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường phân lập được khẳng định bằng các thí nghiệm sinh hoá và huyết thanh lọc

- Môi trường tăng sinh chọn lọc cho V cholera, V alginolyticus và V vulnificus

là nước pepton kiềm Trong khi đó môi trường Clistine Polymicine Broth

thường được dung để tăng sinh V parahaemolyticus Môi trường thường dùng

để phân lập Vibrio là TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Sucrose Agar) Các vi

sinh vật lên men được sucrose trong môi trường này sẽ cho khuẩn lạc màu vàng

và làm acid hoá môi trường bên dưới khuẩn lạc Nếu vi sinh vật không lên men được đường sucrose sẽ cho khuẩn lạc màu xanh

2 Quy trình phân tích và nguyên tắc xác định

2.1 Tăng sinh chọn lọc:

- Rất khó phát hiện Vibrio trong mẫu, vì vậy ta sử dụng lượng mẫu lớn Và cũng chính vì khó phát hiện nên phải tạo điều thuận lợi để Vibrio sinh trưởng bằng

cách tăng sinh trong môi trường pepton kiềm chứa 1% muối NaCl cho trường

hợp V cholera, V alginolyticus và V vulnificus; canh Colistine cho trường hợp

V parahaemolyticus.

- Mẫu lỏng: cho vào nước peptone kiềm, ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ

- Mẫu rắn: cho vào túi PE vô trùng chứa nước peptone kiềm và đồng nhất trong máy dập mẫu rồi ủ ở 37oC trong 18 – 24 giờ.

2.2 Phân lập:

- Phân lập từ phần váng của dịch tăng sinh lên môi trường TCBS agar Ủ ở

370C/24h

- Cấy khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường TSA hay thạch máu

- Ủ 370C để lấy sinh khối cho bước tiếp theo là thử nghiệm sinh hóa

 Nhận diện khuẩn lạc điển hình :

2.3 Thử nghiệm sinh hóa

+ Quan sát tính di động và hình thái trên kính hiển vi

• Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40X

• Ghi nhận kết quả: di động hay bất động, hình dạng tế bào

- Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ 1 giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên trên.Soi tiêu bản trực tiếp trên kính hiển vi thấy vi khuẩn tả di động rất nhanh theo những đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường

- Lam kính 2: Nhỏ 1 giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh tả đa giá Nếu là vi khuẩn tả thì vi khuẩn sẽ bị bất hoạt, không di động nữa.Soi tiêu bản trên kính hiển vi nền đen, vi khuẩn tả di động như sao đổi ngôi

+ Thử nghiệm khả năng lên men đường

• Môi trường: Phenol red broth base pH 7.4

• Chỉ thị pH: đỏ phenol, màu đỏ chuyển sang vàng khi pH dưới 6.8

• Kiểm nghiệm khả năng lên men: lactose, sucrose, mannose

• Bổ sung đường vào môi trường rồi khử trùng

• Sau đó cấy và ủ 370C trong 18 – 20 giờ

• Đánh giá dựa vào sinh acid (làm đổi màu chỉ thị) và sinh hơi (CO2

tạo thành được bẫy lại trong ống Durham)

• Kết quả:

o Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng

o Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ

+ Thử nghiệm Decarboxylase

• Enzyme carboxylase do VK tạo ra loại nhóm carboxyl của acid amin tạo amin hay diamin và CO2

• Môi trường: Decarboxylase Basal Medium

• Chỉ thị: Bromothymol purple pH 6.0, vùng chuyển màu pH 5.2 – 6.8 thay đổi từ vàng thành tím

• Kiểm nghiệm: ADH, LDC

• Hấp khử trùng môi trường rồi cấy

• Bổ sung dầu khoáng hay parafin rồi ủ 370C trong 1 đến 4 ngày

• Kết quả:

(+) Môi trường đục, màu tím (CO2 sinh ra làm thay đổi pH, đổi màu chỉ thị)

(-) Môi trường trong, màu vàng

+ Thử nghiệm khả năng sinh Indol

• Môi trường: Trypton

• Thuốc thử: Kovac’s

• Cho thêm eter để chiết Indol

• Ủ 44.50C trong 24 giờ

• Kết quả:

(+) Bề mặt môi trường màu đỏ

(-) Bề mặt môi trường có màu vàng của thuốc thử

(đôi khi có màu cam do Skatol là tiền chất Methyl hóa của Indol tạo ra)

• Đĩa petri: BSA

• Cấy vào môi trường rồi ủ 370C trong 24 – 48 giờ hoặc đến 7 ngày nếu cần

• Xác định sự hiện diện của enzym oxidase ở VSV Enzym quan trọng nhất của hệ enzym này là cytochrome oxydase trong chuỗi truyền điện tử của hô hấp hiếu khí.

• Thuốc thử: p – phenylenediamine

• Cấy lên ống thạch nghiêng rồi ủ 24 – 48 giờ

• Tiếp tục tiến hành theo 1 trong 2 cách:

• Nhúng giấy lọc vào tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochloride 1%, dùng que cấy dàn đều sinh khối lên tấm giấy lọc đó

• Nhỏ lên sinh khối vài giọt p – aminophenylenediamine oxalate 1%

và α – napthol 1% trong ethanol

• Môi trường: ONPG broth 0.6% (o – nitrophenyl – D – galactopyranoside) trong dung dịch Na2HPO4 1mM

• Khử trùng môi trường, cấy và ủ 370C trong 24 giờ

+ Thử nghiệm khả năng oxi hóa – lên men

• Nhằm xác định VSV biến dưỡng carbohydrate theo phương thức oxi hóa hay lên men, quá trình lên men tạo môi trường có tính acid cao hơn quá trình oxi hóa => làm đổi màu chỉ thị

• Môi trường: Hugh – Leifson chứa glucose là nguồn carbon duy nhất

• Chỉ thị: Bromothymol Blue

• Cấy VSV vào 2 ống môi trường, sau đó chỉ có 1 ống phủ lên bề mặt lớp dầu khoáng parafin để cản sự tiếp xúc với oxi không khí

• Ủ 2 ống ở 370C trong 24 – 48 giờ

+ Thử nghiệm kháng huyết thanh

Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên một vị trí khác của lam Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn Kết luận dương tính khi

có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng

ngưng kết ở giọt nước muối Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện.

Một số phương pháp nhanh:

+ Test kit: Thường được dùng để sàng lọc ở một phạm vi lớn, một số sản phẩm cũng đã được thương mại

+ Phương pháp miễn dịch: như EIA, ELISA cũng được phát triển, tuy nhiên các

bộ kit được thương mại hoá thì không phổ biến khiến phương pháp này không được thịnh hành

+ Phương pháp sinh học phân tử: Ngày nay một số phương pháp phân tử đã được phát triển,đáng chú ý là kỹ thuật PCR Hiện nay đã có bộ sinh phẩm dùng

xác định cả 3 loài: V cholerae, V parahaemolyticus và V vulnificus chỉ trong

vòng 24h bằng kỹ thuật real time PCR (Labelled DNA probes ) từ mẫu thực phẩm,

hơn nữa còn có thể xác định độc tố của V.cholerae mà bằng phương pháp phân tích từ các chủng V.cholerae rất khó khăn.

Quy trình phát hiện và định danh V cholera và V parahaemolyticus

3 Trường hợp cụ thể cho Vibrio parahaemolyticus

THƯỜNG QUY KỸ THUẬT

ĐỊNH LƯỢNG VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS TRONG THỰC PHẨM

(Ban hành kèm theo Quyết định số 3349/2001 QĐ-BYT ngày 31 tháng 7 năm 2001 của

- V cholera: khuẩn lạc vàng, đường kính 2-3 mm

- V parahaemolyticus: khuẩn lạc xanh, đường kính 3-4 mm

Ria lên TSA chứa 1% NaCl hay BHI, ủ qua đêm ở 37oC

Vibrio parahaemolyticus phát triển được trong môi trường có nồng độ muối cao Lựa chọn khuẩn lạc V parahaemolyticus xác định tính chất sinh vật hoá học theo thường quy.

Các dụng cụ và thiết bị thông thường trong phòng kiểm nghiệm vi sinh vật

2 Môi trường, thuốc thử

- Thạch TCBS (Thiosunfat - Citrat - Bile - Salt - Sucroza)

- Thạch Tryple sugar iron (TSI)

- Thạch Wagatsuma

- Môi trường Clark - lubs

- Canh thang Trypticase Soy (TSB)

- Thạch Trypticase Soy (TSA)

- Canh thang muối glucoza (GSTB)

- Canh thang Glucose Hugh Leifson (HLGB)

- Môi trường di động

- Môi trường đường có chỉ thị màu bromocresol

(Các đường manitol, lactoza, sacaroza, arabinoza)

- Môi trường decarboxylaza (ADH, LDC, ODC)

- Thuốc thử hoặc giấy thử Oxidaza

- KOH, α naphton

- Dầu parafin vô trùng

- Thuốc nhuộm Gram

Chú ý: tất cả các loại môi trường phải có ít nhất 3% muối NaCl

IV CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG, THUỐC THỬ

1 Chuẩn bị môi trường

Môi trường nuôi cấy, canh thang, nước pha loãng và môi trường sinh vật hoá học được điều chế theo công thức Các môi trường được đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm và được hấp tiệt trùng (110oC/30 phút hoặc 121oC/15 phút)

2 Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử

- Sò, hến: Toàn bộ cơ quan nội tạng

- Tôm, cua : Thịt và cơ quan nội tạng Nếu cần có thể tách riêng xét nghiệm các bộ phận của chúng (ruột, mang, gạch )

Trước khi xét nghiệm, phải làm tan băng

2.2 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -1

- Cân chính xác 50 g thực phẩm đã được chuẩn bị (hoặc hút chính xác 50ml thực phẩm lỏng) cho vào bình nón chứa sẵn 450 ml nước đệm muối 3%

- Lắc đều 2 - 3 phút Thu được dung dịch mẫu thử 10-1

2.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -2 ,10 -3 ,10 -4

- Hút chính xác 50ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang bình nón chứa sẵn 450ml nước đệm muối 3%

- Lắc đều trong 2 - 3phút Thu được dung dịch 10-2

- Tiếp tục làm tương tự như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tương ứng 10-3, 10-4,

- Lấy 1ml dung dịch mẫu thử từ 10-2, 10-3, 10-4 cho sang ống nghiệm chứa sẵn 10ml GSTB đậm độ thường Mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 ống ủ ấm ở 350C/18-24 giờ

- V parahaemolyticus hiếu khí tuyệt đối, phát triển tạo thành màng trên bề mặt ống canh

thang, chuyển mầu môi trường sang mầu vàng

- Quan sát và nhận định khuẩn lạc trên thạch TCBS

- V parahaemolyticus có khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, đường kính 2 - 3mm trung tâm

khuẩn lạc có màu xanh hoặc xanh lá cây

Bước 4: Tăng sinh thuần chủng và xác định hình thể, tính chất bắt mầu

a) Tăng sinh thuần chủng

- Trích khuẩn lạc điển hình từ thạch TCBS cấy vào môi trường canh thang TSB hoặc canh thang thường có NaCl 3% và ủ ấm 18 - 24 giờ/ 350C, thu được canh trùng thuần nhất

- Từ canh trùng thuần nhất cấy vào Thạch TSI, TSA nghiêng có NaCl 3%;

- Canh trùng được soi tươi trên lam kính: phẩy khuẩn di động nhanh

Bước 5: Tính chất sinh vật hoá học

a) Tính chất lên men các loại đường

- Thử tính chất lên men đường glucoza, lactoza, sacaroza, khả năng sinh hơi, sinh H2S trên môi trường TSI

- Lên men đường sacaroza, manitol, arabinoza

- Dùng canh thang có chỉ thị màu bromocresol để xác định tính chất lên men các loại đường Để tủ ấm 350C/ 4 - 5 ngày rồi đọc kết quả

b) Tính chất ưa muối

- Từ canh trùng thuần nhất cấy vi khuẩn vào ống canh thang muối (STB) có NaCl từ: 0%; 6%; 8%, 10% ủ ấm ở 350C/24 giờ

c) Thử nghiệm VP

- Từ canh thang TSB cấy vào canh thang Clark-lubs, ủ ấm ở 350C/48 giờ Nhỏ thuốc thử 0,2ml KOH 40% và 0,6ml α napton

- Để ở nhiệt độ thường trong 1 giờ Đọc kết quả

d) Test ADH, LDC, ODC

- Dùng que cấy lấy vi khuẩn từ thạch TSA cho vào 3 ống ADH, LDC, ODC (Các ống môi trường đã có parafin vô trùng phủ dày 10mm) Nới lỏng nút bông, để ở nhiệt độ

350C/ 24 giờ, kiểm tra hàng ngày, trong 4 ngày

- Đọc kết quả: V parahaemolyticus LDC (+), ADH (-), ODC (+).

e) Test Kanagawa

- Xác định khả năng làm tan máu thỏ dạng β (test phân biệt

giữa V.parahaemolyticus phân lập từ thuỷ sản): Cấy vi khuẩn sau khi nuôi cấy 18 giờ lên

bề mặt thạch Wagatsuma có máu thỏ thành các chấm Thử nghiệm phải có chứng dương

và chứng âm

- Ủ 350C và đọc kết quả sau 24 giờ

V TÍNH KẾT QUẢ

Khuẩn lạc điển hình trên môi trường TCBS tương ứng với nồng độ pha loãng nhất của

canh thang GSTB còn có sự phát triển của V.parahaemolysticus Tra bảng MPN ở nồng

độ tương ứng để tính số khuẩn lạc có trong mẫu thử

Ví dụ:

Nồng độ 10-1: có 3 ống (+);

Nồng độ 10-2: có 1 ống (+);

Nồng độ 10-3: có 0 ống (+)

Tra bảng MPN , xác định trong 1g mẫu thử có 43 con vi khuẩn

Tiêu chuẩn xác định V parahaemolysticus trong thực phẩm

Phẩy khuẩn, Gr (-) Oxidaza: (+) VP: (-) Di động: (+)NaCl 0%; (-), NaCl 6%: (+) NaCl 8%: (+) NaCl 10%: (-)Glucoza (+), Lactoza (+) Sacaroza(-), Hơi (+); H2S: (-)ADH: (-) ODC: (+) LDC: (+) Kanagawa (-)

Sơ đồ định lượng V parahaemolyticus