BÁO CÁO THỰC TẬP-SẢN XUẤT RƯỢU VANG

xuất khác nhau và hàng trăm loại rợu vang ra đời độ rợu 9% - 14% : Chianti,chablis, rợu Rhine, Granache rose, Burskendy, sautesne, Zinfandet,[2].Thực chất của rợu vang bắt nguồn từ sự bi

Lời cảm ơn

Nghiên cứu khoa học là một công việc cần thiết của thế hệ trẻ, đặc biệt với mỗi sinh viên Để đạt đợc mục đích và hoàn thành nội dung của đề tài không thể tự bản thân mỗi sinh viên thực hiện, mà cần có sự tạo điều kiện của nhà trờng, của khoa và

sự hớng dẫn tận tình của các thầy, cô giáo.

Bằng tấm lòng thành kính em xin đợc bày tỏ tấm lòng biết ơn sâu sắc tới Thạc sỹ Nguyễn Khắc Thanh, TS Đinh Thị Kim Nhung đã tận tình hớng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khoá luận này.

Qua đây em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, các cô trong bộ môn vi sinh cùng các thầy cô trong Khoa Sinh - KTNN đã chỉ bảo em tận tình trong quá trình học tập và nghiên cứu.

Em rất mong sự cổ vũ và những ý kiến đóng góp để khoá luận này hoàn thiện hơn.

Ngời ta đã biết làm rợu vang từ 3000 năm trớc công nguyên Đến thời Trung

cổ, nhu cầu về rợu vang 150 l/đầu ngời/năm[2] Hàng năm trên thế giới sản xuấtkhoảng 18 tỷ lít rợu vang Trong đó 1/3 của Pháp và Angiêri[14]

Đa số rợu vang (Wine, win ) trên thế giới đợc sản xuất từ nho, vì vậy từ “rợuvang” gần đây đồng nghĩa với “rợu nho” [2] Theo thời gian và kỹ thuật sản xuất rợuvang ngày càng phong phú và hoàn thiện Mỗi nớc khác nhau có phơng thức sản

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

xuất khác nhau và hàng trăm loại rợu vang ra đời (độ rợu 9% - 14% ): Chianti,chablis, rợu Rhine, Granache rose, Burskendy, sautesne, Zinfandet,[2].

Thực chất của rợu vang bắt nguồn từ sự biến đổi tự nhiên của các loại hoa quả

có đờng, do hệ enzim có trong một loại vi sinh vật là nấm men Sacharomyces mà chủ yếu là loài: Sacharomyces cerevisiae, ngoài ra còn có các phụ phẩm khác: các

chất thơm, tanin, axít hữu cơ, vitamin, chất khoáng, muối và các este Do đó, rợuvang không chỉ có đặc điểm nổi bật là gây say êm dịu mà còn có giá trị dinh dỡngcao, kích thích tiêu hoá, thần kinh, tim mạch Việt Nam là một nớc nhiệt đới khí hậunóng ẩm, hoa quả nhiều về số

lợng, phong phú về chủng loại, thuận lợi cho sản xuất rợu vang từ các nguồn nguyênliệu khác nhau nh: Dâu, dứa, vải, táo, chuối, mơ trong đó phổ biến nhất là vang vảivì vang vải đã đợc sản xuất ở một số nớc nh: Florida (Mỹ ), Trung Quốc [12, 17].Bên cạnh đó, quả vải giá thành thấp lại rất đa dạng, phong phú Tổng số diện tíchtrồng khoảng 28.000 ha, sản lợng cho thu hoạch khoảng 36.000 tấn/ năm Nơi códiện tích trồng và thu hoạch nhiều nhất là Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (HngYên ) [12, 17] Quả vải dùng chủ yếu để ăn (chiếm khoảng 30% - 35% sản lợng quảcho thu hoạch, số còn lại buộc phải sấy khô hoặc bán thẩm lậu qua biên giới Việt –Trung Việc chế biến quả vải thiều ở dạng nớc giải khát đóng hộp cũng chỉ đáp ứngmột phần nhỏ sản lợng thu hoạch hàng năm và sản phẩm rất khó đợc thị trờng chấpnhận [12, 17]

Ngành sản xuất rợu vang ở Việt Nam thực sự phát triển từ những năm 80 củathế kỷ XX đợc đánh dấu bằng sự xuất hiện của vang Thăng Long, sau đó là một sốcơ sở sản xuất khác hiện lên: vang Gia Lâm, vang Thanh Ba, vang Đà Lạt, nh ng lạithiếu nguồn nguyên liệu Do đó theo chúng tôi, việc nghiên cứu sử dụng quả vảithiều để sản xuất rợu vang là rất cần thiết và phù hợp với thực tiễn ở Việt Nam.Chúng tôi tiến hành lựa chọn và nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu ảnh hởng của hàm lợng đờng và NaCl trong qúa trình lên men

vang vải thiều (Litchi chinensis sonn )”.

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Từ nguồn nguyên liệu vài thiều phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khảnăng lên men vang vải thiều

- Nghiên cứu ảnh hởng hàm lợng đờng, KH2PO4, NaCl, pH, men giống và nhiệt

độ để lựa chọn mức thích hợp cuả các nhân tố này tới quá trình lên men vang vảithiều với quy mô phòng thí nghiệm

- Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả vải thiều

1.3 Nhiệm vụ

Giúp sinh viên biết phơng pháp sản xuất rợu vang ở Việt Nam tận dụng nguồnnguyên liệu sẵn có

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh

hoá của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H 7 và C 13 có khả năng lên men

vang vải thiều Từ đó tìm hiểu quá trình sản xuất vang vải thiều trên quy mô phòngthí nghiệm để ứng dụng sản xuất vang trong gia đình tận dụng nguồn nguyên liệusẵn có ở Việt Nam

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

Phần 2 Tổng quan tài liệu

2.1 Khái quát chung về rợu vang

2.1.1 Các loại rợu vang

Rợu vang là loại nớc thơm ngon giàu chất bổ dỡng với độ cồn nhẹ và hơngthơm trái cây còn giữ lại đợc trong rợu [1] Rợu vang theo đúng nghĩa là rợu lên men

từ nớc ép quả nho (không chng cất ) Gần đây, ngời ta mở rộng khái niệm rợu vang

để chỉ các loại rợu lên men từ các loại hoa quả khác nhau nh: mơ, dứa, táo, vải, xoài,nhãn Sự đa dạng về các loại rợu vang đang là kết quả của sự biến đổi sinh hoá khilên men Trong rợu vang ngời ta còn chia thành hai loại chính: Rợu vang không gaz

và rợu vang có gaz Trong hai loại chính này rợu vang lại đợc chia thành nhiều loạitheo màu sắc, theo hàm lợng đờng có trong rợu hoặc theo độ cồn

Theo màu sắc có vang trắng, vang đỏ (màu đỏ Bordaux) Theo hàm lợng đờng

có trong rợu vang thì có vang chát hay vang khô (ít đờng ) và vang ngọt (nhiều đờng), vang nửa khô[13] Vang khô thờng uống giữa bữa ăn, vừa ăn, vừa uống Vangngọt dùng sau bữa ăn, vang nửa khô (vang Vermouth ) có mùi rất thơm (chứa 21%

độ rợu ) dùng để khai vị Champagne là loại rợu vang có qúa trình lên men phụ sinh

CO2, nên khi uống thờng có bọt và đợc dùng nhiều trong đại tiệc, phụ nữ thờng athích loại vang này[2]

2.1.2 Nguyên liệu sản xuất rợu vang

Việt Nam là một nớc nhiệt đới gió mùa không thuận lợi cho nho phát triển,nhng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt bốn mùa Tất cả các loại quả nếuchứa đờng, prôtêin, muối khoáng và không chứa chất độc hại với nấm men đều cóthể chế biến lên men rợu vang Nh vậy, nguồn nguyên liệu sản xuất rợu vang chủyếu là các loại quả trồng (mận, mơ, táo, dâu, dứa, chuối, vải, nhãn)

Nói chung thành phần hoá học của quả có ảnh hởng rất lớn đến chất lợng rợuvang Điều kiện khí hậu, đất đai, nông hoá thổ nhỡng, kỹ thuật canh tác cũng ảnh h-ởng lớn đến chất lợng rợu vang, bởi chúng ảnh hởng tới sự có mặt của các hợp chấthữu cơ có mặt trong quả

Bảng 1 Thành phần hoá học của các loại quả [7, 16].

9,889,191610,393,99,0

0,560,495,16 0,010,61,1

0,920,310,25

0,070,0350,83

2.1.3.Tàng trữ rợu vang

Vang truyền thống đợc tàng trữ từ 1ữ5 năm hoặc nhiều năm, hàng thế kỷhoặc lâu hơn nữa Trong thời gian này xảy ra sự oxi hoá khử màu tím sang màu đỏtía Vang trắng trở nên vàng, thậm chí đỏ nâu Thành phần axít tăng, độ cồn giảm,este và hơng vị tăng lên [13], [14] Cho nên, công nghệ cổ truyền ngời ta cho rằngcần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh ở mức độ tối thiểu một số chỉtiêu lý hoá Ngợc lại trong thực tế cơ chế thị trờng đã thúc đẩy nhà sản xuất phải xử

lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các phơng pháp công nghệ học, ly tâm, nạp khí CO2,làm lạnh

2.2 Nấm men trong sản xuất rợu vang

Nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rợu vang vì quá trình trao

đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành sản phẩm.Nấm men sản xuất rợu vang gồm nấm men thuần chủng và nấm men tự nhiên

2.2.1 Sơ lợc về nấm men

Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, th ờngsinh sản bằng nảy chồi Từ năm 1680 Levenhuc đã quan sát thấy Nấm men, và từ

1857 Pasteur đã nghiên cứu khá tỉ mỉ về men rợu Nấm men phân bố rộng rãi trong

tự nhiên (Trong đất, trong nớc, trong không khí, trong lơng thực, thực phẩm, tronghoa quả) Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rợu do đó từ lâu con ngời đãbiết sử dụng nấm men để nấu rợu, bia, sản xuất cồn Nấm men sinh sản theo lối nảychồi, sinh sản nhanh chóng, sinh khối của nấm men giàu prôtêin – vitamin Vì vậychúng còn đợc sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổsung cho ngời, gia súc và gia cầm Nấm men còn đợc sử dụng làm nở bột mì, gây h-

ơng cho nớc chấm, sản xuất một số dợc phẩm khác Tuy nhiên bên cạnh đó có một

số nấm men có hại cho ngời và gia súc, làm h hỏng lơng thực, thực phẩm [3]

2.2.2 Hình thái, kích thớc và cấu tạo của tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae

Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng Hình dạng và kích thớc

điển hình của tế bào nấm men chỉ tạo đợc trong điều kiện nhất định Nếu thay đổithì hình dạng tế bào cũng thay đổi

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

Kích thớc của tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 àm x 2- 8àm Tế bàonấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp hơn tếbào vi khuẩn Về mặt hoá học, có sự phân bố rõ ràng, tế bào nấm men

Sacharomyces cerevisiae đợc bao bởi lớp thành tế bào.

Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lợng khô(trong đó 31% manan, 29% glucan ) Ngoài ra còn chứa 1%- 3% kitin, 6% - 10%prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng Thành tế bào có cấu tạo nhiều lớp là cơquan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào Thành tế bào nấm men có khả năng kếtdính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất rợu vang và bia Bên ngoài chấtnguyên sinh là màng sinh chất (màng chất nguyên sinh ) có chức năng quan trọng làhấp phụ các chất dinh dỡng và thải các các sản phẩm trao đổi chất Màng chấtnguyên sinh là lipoprotêin chứa nhiều hợp chất canxi Màng chất nguyên sinh ăn sâuvào trong tạo thành mạng lới nội chất gồm 2 lớp và dày khoảng 30- 40A0 và có tythể Ty thể của nấm men có dạng hình hạt và có thể thay đổi tuỳ thuộc điều kiệncủa môi trờng cũng nh trạng thái sinh lý của tế bào, kích thớc khoảng 0,2 – 0,6 cm,

ty thể có màng trong suốt, mỏng (60 – 80 A0 ), có tính thấm cao, màng ty thể cócấu tạo 2 lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lợc Lớp ngoài

đợc cấu tạo bằng nhiều đơn vị hình thái Ty thể đợc cấu tạo chủ yếu bằng hợp chấtprôtêin, lipit trong đó chiếm một lợng lớn nuclêoprôtêin, photpholipit Số lợng ty thểtrong tế bào nấm men từ 10 đến 20 Chúng tham gia vào quá trình sinh tr ởng của tếbào, sự hình thành và nảy mầm của bào tử [1, 3, 9 ]

Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc một hệ thống không bào đợc hìnhthành từ thể glogi hay mạng lới nội chất, không bào có tính chất thẩm thấu cao và lànơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất Không bào chứa một hệ thống keo,trong đó gồm các điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, các muối canxi, photpho,kali, axit nuclêic Hình dạng của không bào thờng thay đổi do sự co rút của chấtnguyên sinh Trong không bào thờng xảy ra các phản ứng oxi hoá - khử nhờ vào hệthống enzim xitocromoxidaza trong không bào Một dạng dự trữ của tế bào làglucogen trong môi trờng giàu hiđrat cacbon, glicogen của tế bào nấm men đợc tíchluỹ khá nhiều

Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình tròn,hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thớc 1- 2,4 àm Nhân tế bào đợcbao bọc bởi 2 lớp màng tế bào, mỗi màng có cấu trúc nh màng cơ sở, gồm 3 lớpphân tử, những lớp này đợc liên hệ với nhau ở gần lỗ màng nhân Lỗ màng nhântham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất tế bào [6, 9]

2.2.3 Sinh sản của tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính,).Bình thờng tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không thuận

Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất Khi tếbào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi làmầm (hay chồi ) Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bào mẹ Cùng mộtlúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều những chồi ở nhiều phía khác nhau ở mỗi chồi sẽnhận đợc một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ Sau khi nảy mầm tếbào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập, cũng có thể không tách khỏi tế bào

mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào nấm men giống hình cành cây Trong

điều kiện thuận lợi một tế bào đợc hình thành điều chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ vớithời gian 20- 30 phút

Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử Bào tử túi đợc sinh ra trongnhững túi nhỏ gọi là túi nang Mỗi túi nang chứa từ 1 – 8 bào tử (Thờng từ 4 bào

tử ) Nấm men đợc tạo thành từ 1 tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp Bào tử túi gặp

điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men Tế bào này sinh sản theo lốinảy chồi (Lodder.J.1971 )

Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử Tếbào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử Nhờkính hiển vi điện tử khoa học đã thấy đợc sự khác nhau về thời gian hình thành thoivô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men nảy chồi

Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi Giữa quá trình này

có thể sinh sản hữu tính

2.2.4 Nấm men thuần chủng

Trong thiên nhiên tồn tại một số lợng lớn các chủng nấm men khác nhau, chúng

có những đặc tính đặc biệt và đợc sử dụng trong sản xuất Tế bào nấm men có thểtìm thấy ở khắp mọi nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây Tuy nhiên trên bề mặt trái câytồn tại cả những nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc Để tránh ảnh hởng cuả nấm dại,

vi khuẩn, nấm mốc, mà ngày nay xu thế lên men với chủng thuần khiết đang đợcphổ biến rộng rãi

Nấm men thuần chủng là nấm men đợc phát triển từ cùng một tế bào đã đợcphân lập và tuyển chọn trên môi trờng Hansen

Nấm men đợc phổ biến và sử dụng nhiều trong sản xuất là loài Sacharomyces cerevisiae – loài này đôi khi đợc gọi là Sacharomyces ellípsoideus hoặc Sacharomyces vini nhng những tên này đợc coi là lỗi thời, nó đợc đặt tên bởi Hoyer

(1837 ), đợc mô tả từ đầu bởi Schwann trong cùng một năm

* Một số chủng hay dùng trong sản xuất rợu vang:

Sacharomyces vini trớc đây gọi là Sacharomyces cerevisiae vaxini nấm men này chiếm tới 80% Saccharomyces Trong khi lên men loại này có khả năng lên men

glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin

Saccharomyces oriformis đợc tách từ nớc nho lên men tự nhiên, đặc biệt loại

này chịu đợc đờng cao, tạo độ rợu cao (10% V) trong qúa trình lên men Trong quá

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

trình lên men giống nhau tạo thành màng trên bề mặt dịch quả, có khả năng lên menglucoza, fructoza, mantoza.

Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rợu vang, trớc đây gọi

là Saccharomyces ellipsoides khi lên men đạt 10 – 20% V cồn.

* Khả năng lên men đờng của Saccharomyces

Sự lên men rợu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kỳ đầu khi môi trờngcòn chứa nhiều hàm lợng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đờng đến CO2

và H2O, và sinh sôi nảy nở một cách mạnh mẽ Năng lợng của sự lên men không

đảm bảo cho mức độ phát triển cao của tế bào thời kỳ này Trong giai đoạn cuốicùng của sự lên men, vì đờng còn lại ít trong môi trờng nấm men sẽ sử dụng cácglicogen đã đợc tích luỹ trong đó, do đó hàm lợng glicogen trong tế bào giảm dần

Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rợu bia là khác nhau

đối với mỗi loại đờng Tốc độ lên men đờng glucoza và fructoza nhanh hơnxaccaroza Tốc độ lên men đợc xác định lợng CO2 bay ra từ một thể tích môi trờngnhất định trong một đơn vị thời gian (Nelte và cộng sự, 1976 )

* Có nhiều ý kiến khác nhau về việc sử dụng chủng nấm men thuần chủngcho sản xuất rợu vang [7] Nhng chỉ từ khi có những hãng rợu sản xuất đợc vangngon từ giống thuần chủng thì vấn đề này mới đợc quan tâm, phát triển

Nấm men sử dụng rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces cerevisiae Chúng có sự luân phiên thế hệ n và 2n Thành phần hoá học của nấm

men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng của chúng và môi trờng nuôi cấy Trungbình nấm men chứa 75% nớc, 25% chất khô

Theo quan điểm kinh tế, ngời ta chia nấm men ra thành các chủng nh sau:+ Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối u sản xuất thì đạt20,5% V cồn

+ Chủng lên men trong thời gian ngắn, sản sinh 8 – 12% V cồn, thậm chí ởnhiệt độ thấp 4 – 100 c không bị kìm hãm

+ Chủng chịu đợc nông độ đờng cao, lên men đợc rợu vang gần 30% đờngvới hàm lợng cồn 10 -13% V

2.3 Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rợu vang, khả năng lên

men đờng của Saccharomyces cerevisiae

Quá trình sản xuất rợu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men sinhsản trong môi trờng dịch quả Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích sinh trởng của nấmmen Sau đó tạo điều kiện lên men rợu etylic yếm khí nhanh chóng, chiếm toàn bộkhoảng không cho quá trình lên men tạo thành CO2 và rợu etylic xảy ra mạnh mẽ, sựlên men rợu etylic đợc biểu diễn theo phơng trình sau: [1, 12]

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q

Năng lợng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và tích

 Giai đoạn 1: Giai đoạn hoạt hoá phân tử glucoza gồm 3 phản ứng Phân tửglucoza nhở enzim: hexotrinaza chuyển một gốc photphat từ ATP sang tạo

o ch2oop

* Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch

Fructo 1,6 đi  dễ dàng biến đổi thành 3 – Photphoglyxeralđehyt và

đioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza

O

ch2oop

oh

ohoh

ch2oop

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

ở giai đoạn này dới tác dụng của trioza – photphatizomericeza có thểchuyển hoá lẫn nhau.

Đioxyaxeton photphat alđehyt – 3 – photphoglyxeric

* Giai đoạn 3: Oxy hoá

Dới tác dụng của enzim alđehyt photphoglyxeriđehyđrogenaz mà alđehyt –

3 – photphoglyxeric bị oxy hoá thành axit 1,3 đi phophoglixeric

Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP thành ATP Phản ứng này

có ý nghĩa hơn vì năng lợng giải phóng cho quá trình oxy hoá đợc tích luỹ trong cácphân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lợng cho quá trình hoạt động của tế bào trong

điều kiện không có oxy Phản ứng do enzim photpho – glyxeratkitonaza xúc tác tạoaxit 3 – photphoglyxeric

A.1.3.Đ.P.G

ATP ADP

* Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit piruvic

Dới sự tác dụng của enzim photphat glyxeranmutaza mà axit 3 –photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 – photphoglyxeric

cho

A.3.P Gcooh

* Giai đoạn 5: Sự chuyển axit piruvic thành rợu.

Đầu tiên axit piruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO2 và axetalđehyt nhờenzim xúc tác là pyruvat đecacbonxylaza Sau đó axetalđehyt bị khử thành etanolnhờ enzim alcođehiđrogenaz

Phơng trình tổng quát quá trình lên men:

C6H12O6 + 2ADP+ 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 6H2O

Nh vậy sự lên men chuyển đờng thành rợu là một dãy các quá trình oxy hoákhử có enzim trong tế bào nấm men tham gia

2.4 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rợu vang, bệnh vang

2.4.1 Nấm men

2.4.2 Nấm mốc

Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rợu vang, thùng chứa thiết bị

hoặc do bụi, không khí đa đến nh nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus.

2.4.3 Vi khuẩn

Trong nớc hoa quả và nớc rợu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn cótính ổn định lớn với rợu và axit hữu cơ Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu sắctrong rợu vang về vị chua, mùi và có loài còn gây bệnh làm đục cho vang, đó thờng

là các vi khuẩn Acetorbacter xylium, Acetorbacter aceti Pasteur đã khám phá cơ

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

chế làm hoá lỏng vang của các vi sinh vật khi rợu vang tiếp xúc với không khí nhiễm

vi khuẩn Bacillus Do vậy, để bảo quản rợu vang ngời ta có thể thanh trùng pasteurnhng nó làm giảm chất lợng rợu vang, phơng pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảoquản phổ biến nh SO2 ( 75 – 120 mg/l )

2.4.4 Bệnh vang

Bệnh vang đã đợc Pasteur nghiên cứu và khám phá Bệnh vang là hiện tợng

r-ợu bị chua đi và phẩm chất giảm rất nhanh [1,18]

Nguyên nhân: Do rợu vang tiếp xúc với không khí và do đó dới tác dụng của

vi khuẩn axit axetic phát triển đã biến cồn thành axit Ngoài ra bệnh vang còn có thể

- Sản sinh năng lợng

- Tạo thành những tiền chất

- Thực hiện quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành sảnphẩm trung gian, để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trờng

2.5.2 Nguồn nitơ và muối khoáng

- Nguồn nitơ: Trong quá trình sống của nấm men cũng nh tất cả những cơ thểsống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào Do đó môi trờng nuôi cấy cần cung cấp

đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hoá

- Các nguyên tố của photpho, lu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong quátrình trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân,hạt nhiễm sắc thể, enzim

Các ion: Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men

Các ion: Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động sinh học cũng

ảnh hởng tới sinh trởng và phát triển của nấm men [16]

2.6 Các yếu tố ảnh hởng tới quá trình lên men

2.6.1 pH môi trờng

Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trờng bị biến đổi khiến cho sự sinh sản củanấm men cũng bị biến đổi, ở giai đoạn cuối pH tăng lên một ít do môi tr ờng lúc nàybắt đầu khan hiếm chất dinh dỡng và hoạt lực enzim trong tế bào lớn Vì vậy nấmmen tự phân huỷ và giải phóng NH3 Khi pH dới 2 – 3 thì quá trình lên men bị yếu

đi Nếu pH trên 6,5 – 7,5 khả năng lên men vang phát triển tốt: 4,0 – 5,0

Ngợc lại ở nhiệt độ thấp (<20 0c), quá trình lên men xảy ra chậm chạp, cáccấu tử có lợi cho rợu vang đợc hình thành quá ít Quá trình lên men bắt đầu tốt ởnhiệt độ 200 c, ở 25 0c quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12 h, còn 17 - 18 0c xảy

ra sau 24 h Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ thấp 100c Nh vậy nhiệt độthích hợp cho nấm men phát triển là 20 - 28 0c

2.6.3 ảnh hởng của nồng độ cồn

Nghiên cứu cho biết nồng độ cồn thích hợp cho rợu vang phát triển tốt: 9 –

140 Hàm lợng cồn cao gây khó khăn cho quá trình lên men, làm chậm, thậm chí làmdừng lại quá trình lên men ảnh hởng của cùng một hàm lợng cồn ở 300 c và 200c

là hoàn toàn khác nhau ở 300 c cồn gây ảnh hởng xấu hơn ở 20 0c Điều này có ýnghĩa quan trọng trong việc cải tạo chất lợng rợu vang Nhiều thí nghiệm chỉ rarằng, chính hàm lợng cồn cao (nồng độ cồn 14% ) đã cản trở sự lên men chứ khôngphải sự thiếu vắng các chất sinh trởng hoặc sự tạo thành các chất kháng khuẩn

Để phục vụ cho công nghiệp sản xuất rợu vang, cải thiện chất lợng vang,nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra những nòi nấm men thích ứng với nồng độ cao Việc

sử dụng các nòi nấm men này là bổ ích song các nòi này rất nhạy cảm với nhiệt độcao

2.6.4 ảnh hởng của nồng độ đờng và áp suất thẩm thấu

Ngoài yếu tố pH, nhiệt độ, độ cồn thì nồng độ đờng cũng là một yếu tố quantrọng, ảnh hởng đến quá trình lên men Nồng độ đờng cao, ức chế quá trình lên men

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

Nồng độ đờng thích hợp khoảng 200 – 280 g/l Nếu cao hơn nữa tốc độ lên mengiảm đi.

Đờng và các chất hoà tan khác trong môi trờng tạo áp suất, áp suất thẩm thấuchênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trờng nuôi cấy Sự chênh lệch này làm chocác chất dinh dỡng dễ hòa tan và thấm vào môi trờng tế bào qua màng và sản phẩmcủa tế bào hoà tan vào môi trờng áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tợng khô sinh

lý teo chất nguyên sinh Nồng độ quá cao tế bào nấm men không sinh trởng đợc.Nồng độ đờng quá thấp tế bào sẽ ngừng phát triển

Phần 3

Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu

3.1 Đối tợng nghiên cứu

Quả vải thiều (Litchi chinensis sonn ) đợc thu nhận từ hai trung tâm trồng và thu

hoạch nhiều nhất ở Việt Nam là huyện Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (HngYên )

Các chủng nấm men nghiên cứu đợc phân lập từ dịch cùi quả vải thiều có vị tríphân loại theo Yelinov N.(1996 ) sau đây:

MgSO4 7H2O ( Magie sun phat )

- Một số chất hữu cơ: Thạch agar, peptôn, phenolphtalein

- Bình cầu, bình tam giác

- Bàn trong thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, côc thuỷ tinh

- Que cấy, đèn cồn

3.4 Môi trờng

Dựa vào tính chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi chọn

môi trờng vô cơ theo tỷ lệ sau:

3.4.1 Môi trờng Hansen (MT 1 ) g/l: Môi trờng phân lập và sơ tuyển chủng nấm men

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

3.4.3 Môi trờng lên men (MT 3 ) : g/l.

- Dịch siro hoa quả :200

Trong đề tài này tôi sử dụng phơng pháp nghiên cứu sau:

1 Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men

2 Xác định hoạt lực lên men bằng:

+ Cân bình trọng lợng

+Xác định số lợng tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống

3 Xác định hàm lợng đờng bằng khúc xạ kế

4 Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH

5 Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại

3.5.1 Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trờng thạch đĩa:

Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thớchình thái và khả năng lên men nh nhau, chúng tôi chọn phơng pháp phân lập trên

Các tiến hành: Môi trờng phân lập đợc khử trùng và phân vào các hộp pêtrivô trùng để nguội theo phơng pháp Pasteur.

Dịch hoa quả đã đợc pha loãng 10-1- 10-10 bằng nớc cất Nhờ một hai giọthuyền phù với độ pha loãng 10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang Gói kín

và nuôi trong tủ ẩm ở điều kiện 24 – 280c trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện cáckhuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trng cho nấm men (mép răng ca và nhẵnbóng )

3.5.2 Phơng pháp hoạt hoá giống

Trớc khi cấy nấm men vào dịch lên men để có những tế bào to khoẻ thì tôitiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trên môi trờng thạch nghiêng 24 – 280ctrong vòng 24 h trên máy lắc Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống đợc pha ở nồng

độ đờng 10% trong vòng 24 h đợc giống cấp hai

3.5.3 Phơng pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Để biết đợc hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi đã tiến hànhdùng các phơng pháp sau:

* Phơng pháp cân bình trọng lợng:

Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trờng, có cùng mộtlợng tế bào nấm men của các giống khác nhau Sau 24 h lên men đem cân trọng l-ợng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại

* Phơng pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev:

Cấy giống vào môi trờng nhân giống ở 280c, lắc đều canh trờng dùng pipetchia độ pha loãng canh trờng Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển mà độ pha loãngtheo tỷ lệ khác nhau Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào một khe hở giữa haitấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3 – 5 phút rồitiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéonhau

Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A 50 B

Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù

A: Số lợng tế bào trung bình trong 1 ô vuông

B : Hệ số pha loãng

3.5.4 Phơng pháp phân tích

+ Xác định hàm lợng đờng bằng khúc xạ kế

+ Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH

+ Xác định hàm lợng axit trong dịch lên men bằng cách:

Dựa vào nguyên tắc trung hoà axit bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ số mlNaOH 0,1 N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lợng axit trong dịch lên men

Phản ứng trung hoà: OH- + H+ H2O

3.5.5 Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng

nếu n < 30

n

X Xi

Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

4.1 Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men

4.1.1 Tiêu chuẩn chọn chủng

Quá trình sản xuất etanol phụ thuộc vào chủng dùng trong lên men Nấm men

sử dụng để lên men rợu vang từ dịch vải thiều phải đạt các yêu cầu sau: [10, 12]

- Lên men tốt trong môi trờng có hàm lợng đờng cao

- Chịu độ cồn và độ axit cao

- Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn

- Hơng thơm có tạo các este đặc biệt

2 giọt, dùng bàn trang vô trùng nhẹ nhàng dàn đều thể tích đó khắp bề mặt môi tr ờng Nuôi trong tủ ấm 280 c trong thời gian 48 giờ Sau 12 lần phân lập chúng tôi đãchọn đợc 35 mẫu nấm men Khi có mẫu tiến hành lựa chọn 2 mẫu có đờng kínhkhuẩn lạc lớn nhất và khả năng lên men cao nhất đa sang nghiên cứu tiếp Hai mẫunấm men này tạm thời đợc gọi là H7 và C13

-4.1.3 Xác định tên khoa học của hai mẫu nấm men H 7 và C 13

Dựa vào khoá phân loại của Loder năm 1971 (Khoá phân loại mới đợc nhiềungời sử dụng ), theo khóa phân loại này cả hai mẫu nấm men nghiên cứu đều có đặctính [10]:

- Sinh sản bằng nảy chồi nhiều phía

- Không đồng hoá nitrat

- Tế bào hình trứng, ovan, hình cầu

- Lên men Glucôza mạnh

- Lên men đợc saccaroza, galactoza, mantoza

- Điều kiện không thuận lợi hình thành 1  4 bào tử

- Mỗi nang chứa 2  4 bào tử

Từ đó tạm thời đặt tên cho 2 mẫu nấm men là Sacharomyces cerevisiae H7 và

C13

4.2 Xác định hoạt lực lên men

Trong quá trình lên men thì hoạt lực lên men đợc đánh giá bằng hàm lợng

CO2 sinh ra Lợng CO2 sinh ra càng nhiều, thoát ra ngoài môi trờng thì trọng lợngbình lên men càng giảm Điều đó chứng tỏ hoạt lực lên men càng mạnh Chúng tôi

Phạm Thị Hải Lớp: K27A Sinh KTNN

tiến hành thí nghiệm trên hai chủng H7 và C13 với số lần nhắc lại là 8 lần, thu đợckết quả lợng CO2 thoát ra trong 72 h từ khi lên men ở bảng số 2.

Bảng 2.Hàm lợng khí CO 2 giải phóng sau 72 h lên men của hai chủng nấm men

Qua kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng H7và C13 đều lên men mạch, lợng

CO2 thoát ra nhiều, phủ kín bề mặt lên men làm môi trờng lên men ít bị ô nhiễm Sựphát triển nhanh của tế bào nấm men làm cho vi khuẩn, nấm men dại khó xâm nhập,với lợng CO2 thoát ra đạt trên 4g/100 ml là đạt yêu cầu dùng cho lên men r ợu vangcác loại hoa quả Vì vậy, hai chủng này đợc nghiên cứu tiếp động thái phát triển[10]

4.2.2 Động thái phát triển của hai chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H 7

và C 13

Trong qúa trình sản xuất rợu vang giai đoạn nhân giống chiếm một thời gianngắn khoảng 24 – 28 h, nhng nó lại đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trìnhtăng nhanh số lợng của tế bào nấm men Việc nghiên cứu các nhân tố ảnh hởng tới

sự sinh trởng và phát triển 2 chủng H7 và C13 là một phần trong quá trình sản xuất ợu

r-Chúng tôi tiến hành nuôi cấy trên môi trờng số 2 (môi trờng nhân giống ) ở

điều kiện môi trờng 280c, số tế bào ban đầu 3,5 106 tế bào, cứ sau 12 h kiểm tra 1lần Mục đích là xác định động thái phát triển của 2 chủng nấm men H7 và C13 Kếtquả thí nghiệm đợc diễn ra ở bảng 3 và đồ thị 2

Bảng 3 Động thái phát triển của 2 chủng nấm men S cerevisiae H7 và C13