BÁO CÁO ENZYM CYSTEINE_PROTEASES va SUBTILISIN

Công nghệ Enzyme CYSTEINE PROTEASES 1. Giới thiệu Protease cysteine (CPS) có mặt trong tất cả các sinh vật sống. Hơn hai mươi họ của protease cysteine đã được mô tả nhiều, trong số đó papain,bromelain, ficain, cathepsins động vật có tầm quan trọng công nghiệp. Gần đây protease cysteine, trong lysosomal cathepsins cụ thể, đã thu hút sự quan tâm của ngành công nghiệp dược phẩm điều trị bệnh như loãng xương, viêm khớp dạng thấp, xơ cứng động mạch, ung thư, và viêm và bệnh tự miễn dịch,. 2. Cấu trúc và chức năng 2.1. Phân loại và tiến hóa Protease cysteine (EC.3.4.22) là các protein của khối lượng phân tử khoảng 21-30 kDa. Chúng xúc tác thủy phân các liên kết của peptide, amit, este, este thiol và thiono ester. CP có thể được chia thành: • Exopeptidases: cathepsin X, carboxypeptidase B • Endopeptidases: papain, bromelain, ficain, cathepsins Exopeptidaseschia cắt liên kết peptide gần đầu amino hay hoặc carboxy termini của co chất, trong khi endopeptidases cắt liên kết peptide từ xa-N hoặc C-termini. Cysteine proteases phân cắt thành 5 clans: • CA (papain-like enzymes) • CB (viral chymotrypsin-like CPs), • CC (papain like endopeptidases of RNA viruses) • CD (legumain-type caspases) • CE (containingHis, Glu / ASP, Gln, Cysresidues in the catalytic clef ) Các CPS được tổng hợp như là tiền chất không hoạt động với một N-terminal propeptide N và một peptide tín hiệu. 2.2. Papain Papain là cysteine protease được nghiên cứu nhiều nhất. Nó được phân tách vào năm 1879 từ đu đủ và cũng là protease đầu tiên cho cấu trúc dạng tinh thể được xác định. Nhựa mủ khô đu đủ có chứa một hỗn hợp của ít nhất bốn protease cysteine (papain, chymopapain, caricain, glycylendopeptidase) và enzyme khác. Trung tâm hoạt động gồm –SH Cys 25 và nitrogen (b3) His159 bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 liên kết với ASN 175. Phương pháp tinh chế papain chiết nước giảm tác nhân chelat hóa, kết tủa muối và trích dung môi. Tinh chế bằng phương pháp sắc ký ái lực 1 Công nghệ Enzyme Papain gồm 212 amino acid với 3 cầu nối disulphide. Trọng lượng phân tử 23.4kDa. Nó có bản chất là protein có pI 8.75. Phân tử papain bị gấp thành 2 phần riêng biệt bởi 1 khe. Một số cấu trúc phức hợp papain với các phân tử và chất ức chế được giải thích bởi tia X. Sau khi khí hiệu của Schechter và Berger, cơ chất của nhóm papain liên kết có ít nhất 7 acid amin trong Sn thích hợp. Dựa trên cơ sở của động lực học và cấu trúc dữ liệu Turk et al. đề xuất rằng chỉ có 5 cơ chất quan trọng cho cơ chất liên kết. Theo đề nghị của họ, S2, S1 và S1’ , subsite là quan trọng cho cả 2 backbone và 1 chuỗi liên kết, trong khi S3 và S2’ thì chỉ quyết định cho 1 chuỗi. Một ưu tiên cho cơ chất có chứa một số chuỗi kỵ nước lớn ở vị trí P2 được tìm thấy, acid amin ở vị trí P1 của cơ chất ảnh hưởng đến cơ chất liên kết với enzyme để có một mức độ nhỏ hơn. Có một số chấp nhận cho acid amin cơ bản (Arg, Lys) trong vị trí này nhưng Val thì không chấp nhận. S3 liên kết với enzyme để less constrained. Nó có thể thích nghi với chuỗi acid amin. Nói chung papain có tính đặc hiệu rõ ràng và chia ra thành cấu tử peptide khác. pH hoạt động tối ưu của papain 5.8 – 7 và tại nhiệt độ 50-57 0 khi casein được dùng như một cơ chất. Papain được bảo quản trong nhiều tháng ở 4 0 . Hoạt độ sẽ giảm trong quá trình lưu trữ là do quá trình oxy hóa một phần nhóm thiol. 2.3. Bromelain Các 'tên bromelain' ban đầu tổng hỗn hợp của proteases được tìm thấy trong nước của thân cây và trái cây của dứa. Nó là một đơn chuỗi protein glycosylated có trọng lượng phân tử 24,5 kDa, chứa 212 amino Phân tử bromelain có bảy cysteines, một trong số đó là tham gia vào việc xúc tác. Các sáu khác có liên quan trong cặp hình thành ba cây cầu disulphide. pH tối ưu cho hoạt động bromelain là 6-8,5 nhiệt độ tối ưu enzyme này là 50-60 C. Bromelain được tác chế từ bột khô bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion hay sắc ký ái lực. Bromelain nguyên chất ổn định ở - 20 0 . pH hoạt động tối ưu của Bromelain 6 – 8.5 cho hầu hết các cơ chất, và khoảng nhiệt độ 50- 60 0 . Fruit Bromelain là một chuỗi đơn glycosylated protein có trọng lượng phân tử 25kDa. Nó có hoạt tính phân giải giống như phân tử bromelain và có tính đặc hiệu rõ ràng cho cấu tử peptide. 2.4. Ficain Ficain tên của protease cysteine phân lập từ mủ cao su khô. Ficain có thể được tinh chế bằng lọc gel theo sau sắc ký cộng hóa trị. pH tối ưu là 5-8, trong khi nhiệt độ tối ưu là 45-55 C. enzyme này có đặc trưng rộng với sự chấp nhận của dư lượng amino acid kỵ nước (Phe, Leu, Val). 2.5. Cathepsins Lysosomal cathepsins là một nhóm quan trọng của enzym chịu trách nhiệm đối với một số các quá trình sinh lý bao gồm cả sự xuống cấp protein của tế bào. 2 Công nghệ Enzyme Tất cả Cathepsins có vùng hoàn chỉnh của 214 – 260 amino acid. Cấu trúc của Cathepsins là một L-domain chứa cấu tử cysteine hoạt động, một α - helix bảo tồn, R-domain với cấu tử histidine và 4-6 beta-strands. Với sụ chấp nhận của cathepsins S, cathepsins người có pH acid tối ưu của lysosomal compartment và chúng ngừng hoạt động tại neutral pH. Cathepsins có tính đặc hiệu khác nhau mà có liên quan chức năng rõ ràng trong các mô khác nhau. 3.ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP CỦA CYSTEINE PROTEASE Enzym thủy phân (proteases) đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghệ sinh học. Cysteine proteaza của cây và những cathepsin động vật có tầm quan trọng thương mại đáng kể do hoạt động phân giải protein mạnh mẽ của chúng . Hầu hết các ứng dụng công nghiệp của các enzyms được mô tả cụ thể trong nhiều cuốn sách được xuất bản trong những năm gần đây Một số ứng dụng công nghiệp chủ yếu được trình bày : ỨNG DỤNG ENZYM ĐƯỢC SỰ DỤNG LÝ DO SỬ DỤNG Chất tẩy rửa sinh học papain, bromelain loại bỏ các vết bẩn protein Ngành công nghiệp bánh bromelain, papain giúp cải thiện xủ lý các khối bột mì, ngăn ngừa bột teo co lại, và cho phép lưu lượng lò bánh mỳ nhanh hơn Ngành công nghiệp sản xuất bia bromelain, papain loại bỏ vẩn đục (kết tủa) trong thời gian lưu trữ bia, chia nhỏ protein ra từng phần trong mạch nha Ngành công nghiệp sữa bromelain, papain nước sữa đã tách pho mat, chất làm ngọt, pho mai Ngành công nghiệp nhiếp ảnh Ficin hòa tan gelatin vào mảnh phim cho phép khôi phục lại sự hiện diện của bạc Công nghiệp thực phẩm bromelain, papain, cathepsins tenderizer (cho) thịt, làm chất dinh dưỡng cấp cao, làm những sản phẩm Protein và bữa ăn sáng và đồ uống, ổn định gelatin, thực phẩm sức khỏe, thực phẩm lên men khô rippening Xử lý chất thải bromelain, papain dlowering độ nhớt của nước chiết xuất (dính nước), Protein và sự sản xuất peptit 3 Công nghệ Enzyme Sự sản xuất Chitooligosaccharides bromelain thô, papain thô sự giải trùng hợp chitosan để sử dụng trong dược,. thức ăn động vật, y học Thủy hải sản bromelain, papain sự sản xuất surimi, Protein hydrolyzates Ngành công nghiệp mỹ phẩm bromelain, papain hiệu ứng speeling, sự tẩy trắng răng, có thể giúp xua tan những mụn nhọt, làm sạch mặt Công nghiệp Parmaceutic. và y học bromelain, papain giết chết các tế bào bạch cầu bạch huyết, probacteria, tuberculars ký sinh trùng và trực khuẩn, giúp giảm viêm, bình thường hóa chức năng của túi mật này, giảm đau và tăng cường tiêu hóa Dệt bromelain, papain sử dụng để xử lý lông cừu, sôi bên ngoài những tổ kén và tinh chế lụa tơ tằm Ngành công nghiệp Da Papain thuốc làm rụng lông cho da Thức ăn gia súc bromelain, papain để tăng khả năng sử dụng và đảo ngược của các protein làm giảm chi phí thức ăn thô xanh và khai thác nguồn protein Công nghiệp Hóa học(sythesis hữu cơ) bromelain, papain tổng hợp aspartam, các hợp chất antitumor, hoạt tính sinh peptide 3.1 Sản xuất bia và rượu: Bia có độ sáng và trong được người tiêu dung ưa thích hơn. Các thành phần khác nhau được sử dụng trong sản xuất bia kết hợp với protein tạo ra các phức không hòa tan xuất hiện như là một kết tủa cố định. Khi bia được ướp lạnh làm tăng tính không hòa tan và kết tủa mạnh hơn. Xử lý với một số enzyme protein (thường là papain thô hoặc bromelain) kết quả trong bia giữ nguyên độ trong và tươi khi ướp lạnh. Hiện tại ở một số nước châu Âu, papain ko được sử dụng rộng rãi vì nhiều xu hướng cho các loại bia hiện hành . 3.2 Ngành công nghiệp bánh: Protease được sử dụng trong ngành công nghiệp nướng(bánh) vì bột có thể được làm nhiều hơn, nhanh chóng hơn nếu nó có chứa gluten đã được thủy phân một 4 Công nghệ Enzyme phần. Khi các giống lúa mì cao gluten được sử dụng thì các gluten phải được thủy phân một phần để làm bánh quy hoặc ngăn ngừa co rút của bánh pie thương mại. Bromelain đã được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp nướng (bánh mì) vì tốc độ phản ứng nhanh chóng của nó , pH rộng và Optima nhiệt độ và thiếu amylase hoặc bên pentosanase hoạt động. Protease giúp cải thiện xử lý các khối bột mì, ngăn ngừa bột teo co lại, và cho phép lưu lượng lò bánh nhanh hơn. 3.3. Thực phẩm chế biến Thủy phân protein thực phẩm động vật hoặc thực vật được thực hiện cho các mục đích khác nhau: để cải thiện các đặc tính dinh dưỡng, để làm chậm quá trình hư hỏng, sự cải tiến những đặc tính chức năng khác (độ hòa tan, sủi bọt sự đông đặc, và những khả năng nhũ tương hóa), ngăn ngừa những tương tác không mong muốn, để thay đổi vị ngon và mùi hương, và loại bỏ những nhân tố độc hại hay kìm hãm, ngoài ra enzim thủy phân mạnh mẽ được ưu tiên hơn các phương pháp hóa học bởi vì nó tạo ra sản phẩm thủy phân có chứa hỗn hợp peptide được xác định rõ và tránh sự phá hủy của axit L-amino và hình thành các chất độc hại. Protease cysteine, đặc biệt là papain và bromelain, được sử dụng rộng rãi để thủy phân protein làm sản phẩm có hương vị tuyệt vời hơn vì mất vị đắng . Hải sản , trứng và thực vật (đậu nành, lúa mì, gạo, hoa hướng dương, mè và ngô) được thủy phân protein không chỉ tăng cường hương vị tuyệt vời trong một loạt các loại thực phẩm mà còn cải thiện đồng hóa protein Casein và whey (nước sữa đã pho mát) là một số protein quan trọng có sẵn trong tự nhiên. Whey protein tạo ra sự gia tăng đáng kể trong việc hình thành bọt và cấu trúc bọt xốp ổn định có thể giảm bớt bởi sự thủy phân protein. Những sản phẩm thủy phân protein sữa cũng được sử dụng trong y tế và củng cố những đồ uống thể thao, ở trẻ sơ sinh tiêu hóa dinh dưỡng kém và thức ăn kiêng dể tiêu hóa. Enzym được áp dụng rộng rãi trong một số công thức nấu ăn để làm thịt mềm hơn. Tính mềm dẻo và không dai được xác định là những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự hài lòng của người tiêu dùng khi cảm nhận bằng vị giác. Làm mềm thịt có thể được thực hiện bằng cách phá vỡ các-liên kết chéo giữa các sợi protein thịt (collagen và elastin), hoặc bằng cách chia thịt thành những mãnh nhỏ Các enzym truyền thống này là papain, bromelain hoặc ficin. được phun hoặc rắc vào thịt. Tuy nhiên, các enzym có nguồn gốc thịt - cathepsins và calpains - đóng một vai trò đặc biệt trong việc làm mềm thịt của quá trình lão hóa được kiểm soát. Thịt từ động vật lớn tuổi vẫn còn khó khăn nhưng có thể được làm mềm bằng cách tiêm papain không hoạt động vào tĩnh mạch cổ các động vật sống lâu trước khi giết mổ. Sau khi giết mổ, việc giảm kết quả gây ra sự tích tụ các thiol tự do trong bắp thịt, kích hoạt papain làm mềm thịt. Đây là một quá trình có hiệu quả cao khi chỉ cần 2-5 ppm của enzyme không hoạt động được tiêm., Tuy nhiên, gần đây cho 5 Công nghệ Enzyme thấy rằng điều này đã phá hủy nội tạng của động vật như tim , gan và thận nên không thể bán ra thị trường Hoạt động của papain khó kiểm soát và lẫn vào quá trình nấu. Papain và bromelain cũng như protease cysteine nội sinh được sử dụng để tăng tốc quá trình chín của xúc xích khô lên men. Và sấy khô giăm bông . Các hoạt động của protease cysteine nội sinh (chủ yếu là cathepsins) hoạt hóa trong thời gian nấu được gây ra sự giảm phẩm cấp myosin và sự mất mát kế tiếp (của) kết cấu Trong sản xuất surimi, quá nhiều hoạt động protease cysteine là không mong muốn, do đó ức chế proteinase được áp dụng để ngăn chặn làm suy giảm tính đặc quánh. Các ứng dụng khác bao gồm: sản xuất đậu mất nước, thức ăn trẻ em, thực phẩm dễ dàng tiêu hóa của bệnh nhân, kẹo mềm, khử mùi thực phẩm 3.4. Thức ăn vật nuôi : Việc bổ sung papain vào một số thức ăn xanh thô để pha trộn có thể làm tăng giá trị sẵn có của protein, giảm chi phí thức ăn gia súc và khai thác nguồn protein. Một ứng dụng quan trọng của protease trong ngành công nghiệp thức ăn cho thú nuôi là sản xuất nguyên liệu thô hóa lỏng và tạo ra một hương vị chấp nhận được. Sau đó trộn vào thức ăn khô của vật nuôi để cải thiện vị ngon của nó. 3.5. Sử dụng sản phẩm phụ. Gần đây, vật liệu chitosan đã nhận được sự quan tâm đáng kể vì chúng rất hữu ích trong thực phẩm và nông nghiệp, các ngành công nghiệp vì có những hoạt tính sinh học khác nhau. Chitosan là một dẫn xuất của chitin deacylated là một polysaccharide thiên nhiên phong phú tìm thấy trong các bộ xương ngoài của các sinh vật như động vật giáp xác, côn trùng, và trong nấm. Vật liệu Chitin thu được từ ngành công nghiệp thủy hải sản như một sản phẩm chất thải rắn. Chitosan depolymerisation tăng độ hòa tan của nước và làm giảm độ nhớt cũng như hình thành gel đàn áp trong thời gian lưu trữ. Vì vậy các depolymerisation của chitosan có thể tạo ra các vật liệu liên quan đến chitosan trong nhiều lĩnh vực. Papain, bromelain và ficin thô được sử dụng rộng rãi cho depolymerisation chitosan Tuy nhiên, thủy phân chitin và chitosan bằng bromelain gốc là kết quả của chitinase và các hoạt động chitosanase hiện diện trong enzyme thô chứ không phải do bromelain, proteases cysteine từ cây được sử dụng để cải thiện việc thu hồi các protein từ chất thải lò mổ và chế biến đậu nành. Các protein được thu hồi sau đó được sử dụng trong cả hai ngành thức ăn gia súc và ngành công nghiệp thực phẩm do có giá trị dinh dưỡng tốt và có tính năng vượt trội . 6 Công nghệ Enzyme Ngày nay papain và protease vi khuẩn kiềm cũng được sử dụng đối với chất thải cá để giảm độ nhớt của chất lỏng ở cá trong sản xuất thức ăn gia súc, cũng như để trích xuất carotenoproteins từ tôm nâu . protease cysteine cũng được sử dụng trong tiêu phí cơ xương (xương làm sạch) và quá trình phục hồi thịt. Để khôi phục vật chất này, xương được nghiền nát và ủ ở 60 0 C với protease trung tính hoặc kiềm cho đến 4 giờ. Các bùn thịt được sử dụng trong thịt, xúp đóng hộp và những xương không protein được sử dụng như một nguồn Gelatin 3.6. Công nghiệp thuộc da Papain hoạt động như một tác nhân gây rụng lông. Papain cùng với silicat hòa tan được sử dụng như thuốc làm rụng lông cho da, làm cho sản phẩm nhẵn bóng. 3.7. Công nghiệp dệt may Papain được dùng để chế biến lông cừu và tinh chế tơ lụa, sẽ cho ra các sản phẩm không co rút và khá mềm mại do papain có thể hòa tan sericin nhưng không ảnh hưởng đến protein sợi tơ. 3,8. Công nghiệp mỹ phẩm Papain giúp xua tan các mảng sần và mụn, làm sạch da mặt và thúc đẩy lưu thông máu giúp cho làn da khỏe mạnh và mềm mại. Papain và bromelain được dùng trong các sản phẩm lột da mặt. 3.9. Hóa hữu cơ Papain sử dụng trong tổng hợp axit amin, các peptide có hoạt tính sinh học, thuốc chống ung thư và polyaspartate. 4. Sử dụng protease cysteine trong ngành dược và y tế Bromelain được xem như một hợp chất điều trị kể từ năm 1957. Nguyên tắc hoạt động của Bromelain: ức chế kết tập tiểu cầu, chống viêm, điều tiết cytokine và sự miễn dịch, làm lành da bị bỏng, chống khối u, tăng cường hấp thu các loại thuốc khác, làm loãng đàm ứ động, trợ giúp tiêu hóa, góp phần làm lành vết thương và tăng cường hệ tim mạch và tuần hoàn. Papain có tác dụng chữa lành vết thương, loại bỏ các mô hoại tử, mụn cóc và sẹo, điều trị mụn trứng cá, làm sạch da và là một thành phần của kem đánh răng. Papain còn dùng để điều trị bệnh Parkinson, tạo vắc-xin uốn ván và kháng thể. 7 Công nghệ Enzyme Chymopapain được sử dụng để phân hủy đĩa đệm xương sống bị hư hỏng của con người. Đó chỉ là một vài giá trị ứng dụng của cysteine protease. Trong tương lai kỹ thuật di truyền sẽ được áp dụng đối với enzym để đáp ứng theo yêu cầu của con người. SUBTILISIN 1. Giới thiệu Enzym proteases có mặt khắp mọi nơi trong tự nhiên. Subtilisin (EC.3.4.21.62) là một phân nhánh của nhóm serine proteases (EC.3.4.21 ) với điểm đặc trưng là sử dụng đơn phân Serine (Ser) nằm trong trung tâm xúc tác phản ứng của enzyme. Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ 3 amino acid truyền thống của serine proeases Aspartate, Histidine và Serine giống như enzyme trypsin và chymotrypsin ở hệ tiêu hóa động vật có vú. Subtilisin là phân nhóm lớn thứ hai và thuộc phân nhóm S8 của protease, trong đó có hơn 200 enzym đã biết trình tự axit amin. Chúng bao gồm nhiều loại hoạt động trong phạm vi rộng lớn, chẳng hạn như endopeptidases, exopeptidases, oligopeptidases. Hơn 20 phân nhóm được chia thành 6 nhóm lớn dựa trên cấu trúc và chức năng giống nhau của chúng. Subtilisin được tìm thấy trong Archaebacteria, Eubacteria, Eukaryotes và Virus. Subtilisin vi khuẩn là phân nhóm quan trọng và được nghiên cứu rộng rãi, liên quan đến sự nâng cao hiệu quả xúc tác và tính ổn định của chúng. Đặc biệt subtilisin thu nhận từ vi khuẩn có nhiều ứng dụng trong chất tẩy rửa. 2. Đặc tính chung của sutilisin 8 Công nghệ Enzyme Serine proteases có một bộ ba axit amin xúc tác đặc trưng là Aspartate, Histidine và Serine. Trong đó, serine có vai trò hình thành liên kết cộng hóa trị với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của histidine, aspartate như một chất ái lực để gắn enzym với cơ chất. Điểm chú ý ở đây là cấu trúc hình học trung tâm hoạt động của các phân nhóm tương tự nhau, tuy nhiên có sự khác nhau của các nếp gấp protein và một số trình tự khác. Sự sắp xếp của các cấu tử xúc tác ở trung tâm hoạt động mang lại mối liên hệ giữa các phân nhóm, ví dụ như ở chymotrypsin trình tự các cấu tử là his-ser-asp, còn ở subtilisin là asp-his-ser. Tất cả các enzyme xúc tác quá trình thủy phân peptide và liên kết este đều thông qua sự hình thành của acyl-enzym. Sau khi phức hợp enzyme-cơ chất hình thành, nguyên tử carbon trong nhóm carbonyl hình thành liên kết với vùng hoạt động serine. Trong subtilisin, xảy ra các bước sau: Bước 1: Acyl hóa: Hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử carbon trong nhóm carboxyl của phân tử cơ chất nhờ có hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine bằng liên kết LBHB (low-barrier hydrogen bond). Kết quả phản ứng này là tạo ra một hợp chất trung gian và một ion imidazolium (phản ứng cộng). Hợp chất trung gian không bền này nhanh chóng bị thủy phân thành một acyl-enzyme, vòng imidazole và một amine (phản ứng khử). Bước 2: Khử acyl hóa: Phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử H 2 O theo chiều ngược lại của bước một. Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme. Hầu hết các proteases S8 đều là endopeptidase, chúng hoạt đông ở pH kiềm, có nhiều loại chịu nhiệt tốt, do đó chúng có nhiều ứng dụng. Hầu hết chúng không đặc hiệu do có số vòng tuần hoàn cao và sự tách nước ở đầu C của phân tử kỵ nước. Subtilisin có thể gắn lên cơ chất lớn hơn peptide hay protein do đó chúng còn được sử dụng cho các phản ứng mà cơ chất không có trong tự nhiên trong các phản ứng tổng hợp. Trong các trường hợp đó thì subtilisin có sức chịu đựng ở trong nhân hơn là ở nhóm carboxyl. Ngoài ra chúng còn bị ức chế bởi các chất ức chế serine proteases, ví dụ như diisopropyl fluorophosphates hay phenylmethanesulfonyl fluoride. Cấu trúc bậc ba của chúng được xác định dưới các điều kiện khác nhau, các protease S8 có 3 phân lớp với 7 nếp gấp β được kẹp giữ hai lớp vòng xoắn α (Hình 1). Sự ổn định cấu trúc của các enzyme này được minh họa bởi sự ổn định của subtilisin Carlsberg trong dung môi hữu cơ. Điểm đặc trưng khác của các nhóm proteases là sự có mặt của một hay nhiều Calcium binding, chúng góp phần rất lớn vào khả năng chịu nhiệt của các enzym. 9 Công nghệ Enzyme Sự phát triển của kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã đưa đến một cuộc cách mạng trong sự phát triển của các enzym mới và sự nghiên cứu cấu trúc và chức năng của protein. Mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của subtilisin đã được trình bày trong những nghiên cứu gần đây, sự đột biến đơn ở subtilisin BPN’ không gây ra sự biến đổi cấu trúc của nó, chúng chỉ bị xáo trộn nhỏ nhưng không làm thay đổi cấu trúc. Điều này đóng vai trò quan trọng trong quá trình xúc tác của enzym, và enzym subtilisin Carlsberg cũng có đặc tính này do chúng chỉ khác subtilisin BPN’ khoảng 31%. Tuy nhiên những trình tự khác nhau này vẫn phải được kể đến trong các nhóm enzym. Toàn bộ cấu trúc của subtilisin không thể làm xáo trộn một cách dễ dàng bằng đột biến, đột biến đơn có thể dẫn đến những ảnh hưởng quan trọng trong hiệu quả xúc tác, cơ chất và tính ổn định. 3. Công nghệ sinh học về subtilisins Subtilisin trở thành một mô hình cho những nghiên cứu khoa học về protein. Những nghiên cứu khoa học của Subtilisin được bắt đầu từ năm 1960, mục đích là nghiên cứu về những protein xúc tác và tính ổn định của chúng. Từ lúc kỹ thuật tạo dòng (gene cloning) ra đời vào trước năm 1980, đã có nhiều nghiên cứu về sự vận dụng gen của Subtilisin. Ví dụ như sự tiến hóa có hướng của Subtilisin E từ Bacillus subtilis đã được biến đổi thành một enzyme có chức năng tương đồng với enzyme chịu nhiệt (thermitase) từ Thermoactinomyces vulgaris, nó cũng là một loại Subtilisin có 47% trình tự tương đồng với Subtilisin SBN’. Năm phát sinh đột biến gen bất kỳ, sự tái tổ hợp để tạo nên Subtilisin E 5-3H5. 10 [...]... serin được thống kê là không phổ biến trong những enzyme chịu nhiệt so sánh từ một vài enzyme ưu nhiệt 12 Công nghệ Enzyme Một subtilisin thích nghi ở nhiệt độ lạnh được ứng dụng kiến thức khoa học đã tạo nên một phân tử hidro ở subtilisin ưu nhiệt ổn định là subtilisin savinase ( bảng 1, vị trí điều khiển bị thay đổi từ những phần còn lại ở vùng găn kết của subtilisin ở nhiệt độ thấp (S93) Một vùng 12... ra giảm bớt ở nhiệt độ cao hơi giống với những enzyme ở nhiệt độ thấp 4 Ứng dụng của subtilisin trong chất tẩy rửa Ứng dụng trong công nghiệp lớn nhất của subtilisin là trong chất tẩy rửa Trong những năm 1930, người ta đã sử dụng những enzym từ động vật để tẩy rửa 13 Công nghệ Enzyme nhưng sau này chúng không còn phù hợp Đến năm 1963, enzym alcalase (subtilisin Carlsberg từ Bacillus licheniformis)... nghệ Enzyme Nhiệt độ tối ưu của những enzyme tiến hóa này là 17 0C và chu kỳ bán phân rã là 650C cao gấp 200 lần so với những loại subtilisin E hoang dại khác Hơn nữa, 53H5 hoạt động mạnh hơn theo hướng thủy phân hơn những loại hoang dại ở tất cả nhiệt độ từ 10-900C Mặc dù những trình tự khác nhau của enzyme thermitase của Subtilisin E với 157 vị trí, chỉ cần thay thế 8 amino acid để biến đổi subtilisin. .. trình xúc tác của những enzyme từ ưu nhiệt đến ưu lạnh, ở đây nó không có sự tương tác tuyệt đối giữa sự giảm tính ổn định và tăng hoạt động ở nhiệt độ thấp Subtilisin ưu nhiệt, SSII, 77.4% trình tự giống với những subtilisin tự nhiên ưu nhiệt độ thấp, S41 Mặc dù, ở đây 2 subtilisin này có đến 85 vị trí khác nhau, 11 Công nghệ Enzyme sự thay thế 4 acid amin có khả năng tạo ra một subtilisin SSII có nhiệt... polypeptide đơn gồm 275 axit amin và subtilisin BPN’ cũng gồm 275 axit amin, chúng có cấu trúc 3 chiều tương đối giống nhau nhưng đặc tính động học khác nhau Ngoài ra, subtilisin từ B lentus cũng được sử dụng thường xuyên với pH hoạt động (9-12) cao hơn so với Carlsberg hay BPN’, subtilisin này có 269 axit amin với khoảng 60% có trình tự giống với các enzym khác Tất cả các enzym subtilisin sử dụng trong chất... thermostability mà không làm giảm hoạt tính của enzyme Những nghiên cứu gần đây về các đột biến ổn định của subtilisin BPN’ đã giúp cho những hiểu biết về cấu trúc cơ bản chịu nhiệt của enzyme này Nhân tố căn bản của những nghiên cứu này là việc khắc phục mất canxi khi có sự hiện diện của chất làm mềm nước (chelators) trong quá trình làm sạch Hai biến đổi mới của subtilisin độc lập canxi được tạo ra, ở đây... những đột biến gen ở những vị trí xác định vô cùng quan trọng trong chu trình bán rã của enzyme subtilisin BNP’ có canxi tự do, cùng với những ứng dụng tiềm năng của công nghệ sinh học Những enzyme đơn từ những sinh vật ưa nhiệt thường có hiệu quả xúc tác cao ở những nhiệt độ thấp và nhạy với nhiệt độ cao hơn với những enzyme ưu nhiệt khác Trong quá trình cố gắng tìm hiểu quá trình tiến hóa và những phân... B.subtilis là một hydrolase xúc tác cho phản ưng sau: Arylsulfinamides (R – S(O) – NH2) được sinh ra ở pH trung tính, nó có vai trò trong quá trình tổng hợp amines 6 Kết luận Subtilisin vi khuẩn có vai trò quan trọng trong chất tẩy rửa và một số ứng dụng khác, những vấn đề liên quan đến subtilisin được trình bày ở trên giúp chúng ta hiểu rõ về cấu trúc và chức năng của serine proteases, chúng có trọng lượng... động ở pH tối ưu Những enzym được bổ sung vào chất tẩy rửa phải có hoạt động xúc tác phù hợp với những thành phần khác và điều kiện tẩy rửa Các enzym này phải ổn định ở điều kiện pH kiềm, nhiệt độ cao, và sự có mặt của các nhân tố khác như nồng độ ion, nồng độ chất bẩn trong dung dịch, các chất hoạt hóa Do đó chỉ có nhóm serine proteases là phù hợp để sử dụng trong tẩy rửa, trong đó subtilisin vi khuẩn... hoạt động xúc tác của subtilisin bằng cách oxy hóa các cấu tử ở gần trung tâm hoạt động của subtilisin là methionine và cystein Chúng ta có thể khắc phục bằng cách là phát sinh đột biến lên những vị trí đó để thay các cấu tử nhạy đó bằng các cấu tử khác mà không ảnh hưởng đến hoạt động xúc tác ví dụ như serine hay alanin thay vào vị trí của methionin Protease đầu tiên được sử dụng là subtilisin Carlsberg . với enzym để đáp ứng theo yêu cầu của con người. SUBTILISIN 1. Giới thiệu Enzym proteases có mặt khắp mọi nơi trong tự nhiên. Subtilisin (EC.3.4.21.62) là một phân nhánh của nhóm serine proteases. khác nhau. 3.ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP CỦA CYSTEINE PROTEASE Enzym thủy phân (proteases) đóng một vai trò quan trọng trong ngành công nghệ sinh học. Cysteine proteaza của cây và những cathepsin. Công nghệ Enzyme CYSTEINE PROTEASES 1. Giới thiệu Protease cysteine (CPS) có mặt trong tất cả các sinh vật sống. Hơn hai mươi họ của protease cysteine đã được mô tả nhiều,