Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 195 NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ GENOME MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG CỦA VIỆT NAM Khuất Hữu Trung, Lê Huy Hàm và cộng sự Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Sequencing the genomes of a number of native Vietnamese rice lines Eight hundred and thirty seven rice varieties/lines have been investigated and collected following 6 groups of good quality, salinity tolerance, drought tolerance, planthopper resistance, rice blast resistance and bacteria blight resistance. Thirty-six varieties with typical samples and high diversity have been selected for for genome sequencing. The databases of phenotype and genotype of those varieties have been supplied precious informations for screening of functional genes; building SNPs map; and designing CAPS, dCAPS and SSLP marker supporting precise selection of individuals that contain target genes. The results of the studies will effectively support rice breeding programs to produce new rice varieties with good quality, high productivity, abiotic and biotic resistance capability. Keywords: Cleaved Amplified Polymorphic sequence (CAPs), Derived Cleaved Amplifi ed Polymorphic sequence (dCAPS), Single Nucleotide Polymorphism (SNPs), Simple Sequence Length Polymorphism (SSLP) I. ĐẶT VẤN ĐỀ * Tập đoàn giống lúa bản địa của Việt Nam vô cùng phong phú. Nhằm xây dựng được cơ sở dữ liệu genome bên cạnh cơ sở dữ liệu hình thái và ngân hàng gen hạt, nhóm tác giả Viện Di truyền Nông nghiệp đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam” nhằm ứng dụng khai thác nguồn gen lúa hiệu quả phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo ra những giống lúa mới đáp ứng yêu cầu sản xuất. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu - Các tập đoàn giống lúa bản địa (chất lượng, chịu hạn, chịu mặn, kháng rầy nâu, kháng đạo ôn, kháng bạc lá) được cung cấp bởi Ngân hàng gen hạt của Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long và được thu thập từ các địa phương của Việt Nam. - Các hóa chất thông dụng, các mồi SSR, ORF100 dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử được cung cấp từ các hãng Sigma, Merck… - Các thiết bị máy móc, máy tính và các phần mềm chuy ên dụng (RTA version 1.7 và Người phản biện: GS.TSKH. Trần Duy Quý. CASAVA version 1.7, NextGene, MEGA5, dCAPS Finder 2.0, VectorNTI v11 ) 2.2. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp đánh giá mô tả đặc điểm hình thái; đặc tính nông học theo phương pháp của IRRI, 1997. - Phương pháp tách chiết ADN tổng số (với lượng mẫu lớn, chất lượng cao). - Phương pháp phân loại loài phụ Indica và Japonica dựa trên ADN lục lạp (Theo phương pháp của Kanno, 1993 và Chen, 1994). - Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR: Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB của Obara và Kako (1998) có cải tiến; kiểm tra nồng độ tinh sạch của ADN; sử dụng các mồi SSR thích hợp (30-50 mồi cho mỗi tập đoàn), thiết kế các điều kiện tối ưu cho các phản ứng PCR để nhân những đoạn ADN của genome; điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide và nhuộm gel bằng Ethidium bromide; phân tích, xử lí kết quả bằng các chương trình phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2000). - Phương pháp giải trình tự genome bằng hệ thống Illumina: Các mẫu ADN sẽ bị cắt thành các phân mảnh có kích thước thích hợp (trung bình ~ 800bp) bằng cách sử dụng một thiết bị khí nén được gọi là máy phun sương. Tạo một VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 196 thư viện các phân mảnh đại diện cho mẫu genome cần giải trình tự. Các đầu tận cùng của các phân mảnh ADN được làm bằng và hai trình tự adapter đặc hiệu được gắn vào các phân mảnh theo quy trình của hãng (Genomic DNA Sample Prep Kit). Trình tự genome của các giống lúa được giải mã theo phương pháp ngẫu nhiên (Shortgun). Các đoạn trình tự riêng biệt được sắp xếp và lắp ráp thành một trình tự thống nhất của hệ gen bằng phần mềm RTA version 1.7 và CASAVA ve rsion 1.7. - Lập bản đồ SNPs và thiết kế các cặp mồi dCAPS, SSLP bằng các phần mềm: Bam seek 2011, CLC Genomic Workbench V6.0, MEGA V5.0, NextGENe ® software V2.3.3, Vector NTI v.11 và dCAPs Finder 2.0 III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Điều tra, thu thập và xây dựng các tập đoàn giống lúa bản địa của Việt Nam (tập trung các giống chất lượng tốt, có khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi sinh học và phi sinh học) Tổng số 837 mẫu giống lúa ở các vùng sinh thái khác nhau đã được điều tra (chất lượng tốt - 233 mẫu; chịu hạn - 134 mẫu; chịu mặn - 63 mẫu, kháng rầy nâu - 113 mẫu, kháng đạo ôn - 161 mẫu, kháng bạc lá - 133 mẫu để chọn lọc và xây dựng thành 6 tập đoàn với các mẫu giống lúa điển hình có độ đa dạng cao phục vụ công tác giải mã genome. Cụ thể: Tập đoàn giống lúa chất lượng (50 mẫu); tập đoàn giống lúa có khả năng chịu hạn (40 mẫu); tập đoàn giống lúa có khả năng chịu mặn (38 mẫu); tập đoàn giống lúa có khả năng k háng rầy nâu (35 mẫu); tập đoàn giống lúa có khả năng kháng đạo ôn (34 mẫu); tập đoàn giống lúa có khả năng kháng bạc lá (38 mẫu). 3.2. Đánh giá đa dạng di truyền của 6 tập đoàn giống lúa có khả năng chịu hạn, chịu mặn, chất lượng, kháng rầy nâu, kháng bạc lá, kháng đạo ôn bằng chỉ thị phân tử SSR Kết quả phân tích đa dạng di truyền của các tập đoàn giống lúa dựa trên các cặp mồi SSR được tổng hợp ở bảng 1. Từ kết quả số liệu đánh giá đa dạng di truyền 6 tập đoàn giống lúa bản địa của Việt Nam, chúng tôi tuyển chọn được 36 giống lúa điển hình phân bố ở các vùng miền khác nhau, có độ đa dạng cao, phục vụ cho quá trình giải mã genome: - Nhóm lúa chất lượng: Tám xoan Bắc Ninh, Tám xoan Hải Hậu, Nàng thơm Chợ Đào, Tẻ nương, Thơm lài, Nếp ông táo và OM3536. - Nhóm lúa chịu hạn: Nếp bồ hóng Hải dương, Tan ngần, Ba chơ K’tê, Blào sinh sái, Nàng quớt biển và Lúa gốc đỏ. - Nhóm lúa chịu mặn: Nếp mặn, Chiêm đỏ, Lúa ngoi, Một bụi đỏ, Nàng cờ đỏ 2 và Chiêm đá. - Nhóm lúa kháng rầy nâu: Chấn thơm, Khâu giáng, Xương gà, Coi ba đất, OM5629, Khẩu liến và IS1.2. - Nhóm lúa kháng đạo ôn: Ble te lo, Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2, Nếp lùn, Kháu mặc buộc và OM6377. - Nhóm lúa kháng bạc lá: Tép Thái Bình, Kháu điển lư, Nếp mèo nương, Tốc lùn và Hom râu. Bảng 1. Kết quả đánh giá đa dạng di truyền của 6 tập đoàn giống lúa của Việt Nam Nhóm lúa Các thông số Chất lượng Chịu hạn Chịu mặn Kháng rầy nâu Kháng đạo ôn Kháng bạc lá Số lượng cặp mồi 31 23 30 31 29 31 Số alen (TB) 3,87 3,57 5,2 3,84 5,58 3,43 Hệ số PIC (TB) 0,52 0,56 0,66 0,59 0,71 0,68 Tỷ lệ khuyết số liệu (TB) 1,94 1,85 1,05 2,12 3,24 2,00 Tỷ lệ dị hợp tử (TB) 2,32 3,45 1,50 0,47 1,57 1,43 Hệ số tương đồng 0,11 - 0,87 0,02 - 0,91 0,02 - 0,83 0,05 - 0,82 0 - 0,69 0,07 - 0,87 Phân nhóm 6 4 3 5 6 7 Ghi chú: TB - Trung bình; PIC - Polymorphic Information Content. Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 197 3.3. Phối hợp giải mã genome, xây dựng cơ sở dữ liệu genotype của 36 giống lúa bản địa ưu tú được tuyển chọn Hình 1. Sản phẩm ADN của các mẫu giống lúa (M: Marker DNA 50 g/µl; giếng 1-36: 36 mẫu giống lúa) Sau khi tách chiết, ADN được hòa tan bằng nước cất vô trùng khử Ion và kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch trên gel agarose 1% (hình 1). Kết quả điện di cho thấy, các băng ADN tổng số của các giống lúa thu được sáng đồng đều, không đứt gẫy hay lẫn tạp. Nồng độ DNA cao hơn so với Marker (50 g/µl). Tổng số 36 mẫu ADN của các giống lúa nghiên cứu sau quá trình tách chiết được thiết lập thư viện hệ gen và tiến hà nh giải trình tự tự động trên máy Illumina. Sau đó, số liệu được tập hợp và xử lý bằng các phần mềm: NextGENe ® software V2.3.3; CLC Genomic Workbench V6.0; MEGA V5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis). Cơ sở dữ liệu trình tự genome của 36 mẫu giống lúa nghiên cứu đã giải mã được tổng hợp ở bảng 2. Bảng 2. Thống kê số lượng file đọc, contigs và độ dài các contigs của 36 giống lúa TT Tên giống lúa Số file Read (file đọc) Chiều dài (bp) Số contigs sau lắp ráp (đoạn) Chiều dài TB (bp) Contigs dài nhất (bp) Contigs ngắn nhất (bp) Tên CSDL 66 764 181 100 168 345 1 462 39 403 99 1_1 1 Tám xoan Bắc Ninh 66 764 181 100 170 097 1 446 38 223 112 1_2 77 282 587 100 168 912 1 467 33 453 119 2_1 2 Tám xoan Hải Hậu 77 282 587 100 158 500 1 592 34 981 111 2_2 60 665 371 100 177 777 1 374 34 925 114 3_1 3 Tẻ nương 60 665 371 100 195 484 1 244 24 754 110 3_2 58 565 580 100 189 992 1 374 27 442 141 4_1 4 Nàng thơm Chợ Đào 58 565 580 100 192 893 1 253 32 926 108 4_2 130 034 563 100 158 431 1 619 35 748 96 5_1 5 Thơm lài 130 034 563 100 148 838 1 747 34 832 100 5_2 64 207 073 100 174 251 1 402 32 807 125 6_1 6 Nếp mặn 63 829 573 100 173 560 1 417 33 380 112 6_2 7 Chiêm đỏ 149 221 060 100 193 353 1 344 31 551 102 7_1 23 570 568 100 305 651 570 20 047 117 8_1 8 Lúa ngoi 21 458 890 100 338 605 459 8 880 122 8_2 93 386 596 100 139 405 1 900 45 657 93 9_1 9 Một bụi đỏ 93 386 596 100 138 852 1 910 46 370 99 9_2 25 356 215 100 264 870 706 36 961 112 10_1 10 Nàng cờ đỏ 2 25 397 926 100 270 457 704 36 961 100 10_2 62 318 086 100 182 312 1 336 32 542 111 11_1 11 Ble te lo 62 885 136 100 172 164 1 443 32 542 125 11_2 60 034 872 100 180 582 1 336 28 120 116 12_1 12 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 60 327 169 100 170 439 1 440 32 452 100 12_2 13 Nếp lùn 112 867 848 100 167 972 1 474 31 471 105 13_1 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 198 TT Tên giống lúa Số file Read (file đọc) Chiều dài (bp) Số contigs sau lắp ráp (đoạn) Chiều dài TB (bp) Contigs dài nhất (bp) Contigs ngắn nhất (bp) Tên CSDL 14 Kháu mặc buộc 161 141 506 100 163 108 1 602 36 477 93 14_1 15 OM6377 151 576 950 100 160 618 1 618 36 911 118 15_1 16 Chấn thơm 124 807 138 100 133 728 1 982 55 255 98 16_1 54 917 406 100 165 903 1 518 35 123 100 17_1 17 Xương gà 54 917 406 100 165 691 1 522 32 961 119 17_2 18 Khâu giáng 144 984 058 100 160 100 1 588 34 709 107 18_1 50 386 232 100 312 711 650 42 742 100 19_1 19 Coi ba đất 20 526 283 100 327 307 415 32 337 108 19_2 20 OM5629 110 278 876 100 145 196 1819 44 379 101 20_1 87 082 333 100 145 017 1822 45 145 114 21_1 21 Nếp bồ hóng HD 87 082 333 100 143 972 1 836 41 495 118 21_2 22 Tan ngần 124 251 178 100 166 005 1 509 37 314 102 22_1 23 Ba chơ K’te 86 675 902 100 278 396 799 18 323 108 23_1 24 Blào sinh sái 143 027 028 100 172 738 1 488 34 078 90 24_1 90 575 290 100 202 060 1 231 32 461 118 25_1 25 Nàng quớt biển 90 575 290 100 196 455 1 288 32 432 103 25_2 57 444 605 100 220 236 1 011 20 612 113 26_1 26 Tép Thái Bình 57 444 605 100 246 254 895 23 072 131 26_2 73 065 806 100 170 507 1 452 39 702 116 27_1 27 Kháu điển lư 73 065 806 100 159 413 1 579 42 744 122 27_2 64 484 391 100 152 517 1 693 44 872 100 28_1 28 Nếp mèo nương 64 484 391 100 153 725 1 680 48 203 102 28_2 29 Tốc lùn 77 210 566 100 320 152 677 33 403 103 29_1 78 841 921 100 173 968 1 437 32 864 101 30_1 30 Hom râu 78 841 921 100 163 869 1 551 34 312 90 30_2 31 Nếp ông táo 106200872 100 174764 1485 34689 97 31-1 46 589 297 100 193 628 1 241 33 640 119 33_1 32 OM3536 46 589 297 100 197 033 1 216 31 842 120 33_2 33 Khẩu liến 163389194 100 150517 1748 40389 159 34-1 75 462 036 100 193 739 1 220 32 694 115 36_1 34 Lúa gốc đỏ 75 462 036 100 180 682 1 348 32 458 112 36_2 35 Chiêm đá 131 230 830 100 188 511 1 392 42 513 95 37_1 36 IS1.2 112 318 078 100 149 578 1 738 36 496 99 39_1 Số liệu ở bảng 2 cho thấy: Giống Thơm lài có số file đọc lớn nhất là 260 069 126. Giống lúa ngoi có số file đọc nhỏ nhất là 44 029 458. Kết quả thống kê số lượng các contigs của 36 giống lúa sau khi lắp ráp chỉ ra rằng: Giống lúa ngoi có số lượng contigs lớn nhất là 644 256 contigs. Giống Chấn thơm có số contigs sau lắp ráp ít nhất là 133 728 contigs. Contigs dài nhất là 48 203bp ở giống Nếp mèo nương, contigs ngắn nhất là 90bp ở giống Blào s inh sái. Chiều dài trung bình của các contigs dao động từ 415bp (giống Coi ba đất) đến 1910bp (giống Một bụi đỏ). Cơ sở dữ liệu genotype (ở mức trình tự genome) của 36 giống lúa bản địa ưu tú lưu trên website: tgac/browser.tgac.ac.uk (hình 2). Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 199 Hình 2. Giao diện đăng nhập vào CSDL tại website: tgac/browser.tgac.ac.uk 3.4. Đánh giá bổ sung các tính trạng hình thái nông học chính, xây dựng cơ sở dữ liệu phenotype của 36 giống lúa đã được giải mã Sử dụng cặp mồi đặc hiệu ORF100 và so sánh với hai giống đối chứng Nipponbare (lúa Japonica) và Kasalath (lúa Indica). Kết quả phân loại dưới loài của 36 mẫu giống lúa được thể hiện ở hình 3 và bảng 3. Hình 3. Sản phẩm PCR của 36 giống lúa với cặp mồi ORF100 (K: Kasalath; N: Nipponbare; M: Marker 1kb; giếng 1 - 36: Các mẫu lúa) Số liệu ở bảng 3 cho thấy, trong số 36 mẫu giống nghiên cứu, có 15 mẫu giống lúa cho sản phẩm khuếch đại là băng ADN giống với đối chứng Kasalath (kiểu ADN lục lạp khuyết thiếu của lúa Indica). Có 20 mẫu giống lúa cho sản phẩm khuếch đại là băng ADN giống với đối chứng Nipponbare (kiểu ADN lục lạp không khuyết thiếu của Japonica). Duy nhất có giống lúa Nàng quớt biển t hể hiện ở cả hai kiểu ADN lục lạp (với kiểu ADN lục lạp khuyết thiếu của lúa Indica và kiểu ADN lục lạp không khuyết thiếu của Japonica). Điều này cho thấy, mẫu giống này đã có sự lai tạo tự nhiên giữa lúa Indica và lúa Japonica. Bảng 3. Kết quả phân loại dưới loài của 36 giống lúa ORF 100 ( 1000bp) TT Tên giống lúa Japonica Indica 1 Tám xoan Bắc Ninh Japonica 2 Tám xoan Hải Hậu Japonica 3 Tẻ nương Japonica 4 Nàng thơm Chợ Đào Japonica 5 Thơm lài Indica VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 200 ORF 100 ( 1000bp) TT Tên giống lúa Japonica Indica 6 Nếp mặn Indica 7 Chiêm đỏ Indica 8 Lúa ngoi Japonica 9 Một bụi đỏ Japonica 10 Nàng cờ đỏ 2 Indica 11 Ble te lo Japonica 12 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 Indica 13 Nếp lùn Indica 14 Kháu mặc buộc Japonica 15 OM6377 Indica 16 Chấn thơm Japonica 17 Xương gà Indica 18 Khâu giáng Japonica 19 Coi ba đất Japonica 20 OM5629 Japonica 21 Nếp bồ hóng Hải Dương Indica 22 Tan ngần Japonica 23 Ba chơ K’tê Japonica 24 Blào sinh sái Japonica 25 Nàng quớt biển Japonica Indica 26 Tép Thái Bình Indica 27 Kháu điển lư Japonica 28 Nếp mèo nương Japonica 29 Tốc lùn Indica 30 Hom râu Japonica 32 Nếp ông táo Japonica 33 OM3536 Indica 34 Khẩu liến Japonica 36 Lúa gốc đỏ Indica 37 Chiêm đá Indica 39 IS1.2 Indica Sau khi tiến hành thu thập và đánh giá bổ sung các đặc điểm hình thái, sâu bệnh hại và đặc tính nông học (theo tiêu chuẩn IRRI - 1996) của 36 giống lúa đã được giải mã. Các số liệu được xử lý, tổng số 50 chỉ tiêu đánh giá được tổng hợp theo từng giống lúa, nhóm giống và nhập CSDL lên phần mềm, lưu trên website và đĩa CD của đề tài (www.riceagi.org.vn) (hình 4). Hình 4. Giao diện trang chủ của website và đĩa CD lưu CSDL Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 201 3.5. Lập bản đồ các SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms); thiết kế các marker CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) phục vụ công tác nghiên cứu và chọn tạo giống lúa Hình 5. SNPs giống Tẻ nương (vị trí: 8159 (C/T), 8160 (G/A) và 8182 (T/C)) Sử dụng phần mềm NextGENe ® software V32.3.3 để dò tìm các SNPs trên trình tự genome của các giống lúa. So sánh các vùng gen đích (liên quan đến tính trạng chất lượng, kháng sâu bệnh) để dò tìm SNPs cho các giống lúa. Kết quả đã xác định được tổng số 783 SNPs và InDels có ý nghĩa (nằm trong vùng gen đích), làm cơ sở để thiết kế các markers chức năng cho phép xác định chính xác các alen của các giống lúa nghiên cứu phục vụ công tác lai tạo giống. Trong tổng số 783 SNPs và InDels được tìm thấy, số lượng SNPs dò tìm được ở nhóm chất lượng cao nhất (499), sau đó là nhóm giống lúa kháng đạo ôn (77), nhóm giống lúa chịu mặn (77), nhóm giống lúa kháng bạc lá (68), nhóm kháng rầy nâu (41) và nhóm chịu hạn có số lượng SNPs dò tìm được là 21. Sau khi dò tìm được các SNPs và các InDels có ý nghĩa nằm trong vùng gen chức năng, ở các SNPs không có vị trí cắt enzyme giới hạn, chúng tôi đã sử dụng phần mềm dCAPS Finder 2.0 để thiết kế các cặp mồi nhân các đoạn gen có trình tự enzyme cắt giới hạn (dCAPs); ở các InDels dài 5-15bp, chúng tôi sẽ thiết kế các cặp mồi SSLP. Kết quả đã thiết kế được tổng số 35 cặp mồi dCAPS và SSLP để nhân các đoạn gen ở mỗi giống lúa tương ứng (bảng 4). Bảng 4. Thông tin về các cặp mồi dCAPS và SSLP TT Gen Tên cặp mồi/trình tự Marker Enzyme Tm 1 BAD CL3 EcoRIF: GCGAGACGAATTTATTAAGCCTAATG AA CL3 EcoRIR:TGCGAACTGGACTCTATGTTGTATG dCAPs EcoRI 63 2 BAD CL3.1 Bsp1407I F: GCTTAAAAGATTCGTCTCGCAATG TA CL3.1 Bsp1407I R:GAGCTCTCCCAGGTCGGTCT dCAPs Bsp1407I 63 3 BAD CL5 BcefI F: TTGAGCAGATCTTGTACTGGTTGAA CL5BcefI R: CAGAATTCATAATCAGCTAGAATTGCC dCAPs BcefI 61 4 BAD CL2 BscGI F: GTATCGGCTTGTGGTGTTTCAC CC CL2 BscGI R: TGAAGAAGTCGTTTGGTGATGAGAAA dCAPs BscGI 65 5 BAD CL1 BsmAI F: TTTATCTTACAGATGAAATCAAATCCG CL1 BsmAI I R: GAAAACCCAGCTTTTCCAGAG TCT dCAPs BsmAI 61 6 BAD CL4 HpaI F: AACCGCGAGACGAATTTATTAAGCCTAG TTAA CL4 HpaI R: GGATATTGTGGATTCTGGATTGTAGAATCA dCAPs HpaI 66 7 BAD CL511F:GCTGCCTACCTCATGTATAAATAGA CL511R:TCTCGACTAAACTCGAAACCCTAAC SSLP 56 8 DREB2A CH21 TspEIR: AAAGCGATGGCCCTGATT CH21 TspEIF: CATGAAAAAGAAAAGAAGTATTTA A dCAPs TspEI 53 9 DREB2A CH23 HphI F: GTAATTCTTGTTATGAACATGGT CH23 HphI R: TAACACATGAAAGCTACTAGACGCC dCAPs HphI 65 10 SRWD2 CM SRWD2 Eco31IR: TAAGCACTGAATAGTGAATACCATG CM SRWD2 Eco31IF: CAATCATATAAGTCCAATTGTTAG GT dCAPs Eco31I 56 VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM 202 TT Gen Tên cặp mồi/trình tự Marker Enzyme Tm 11 SRWD2 CM7 EcoRIR: GGTCGGAAACTTTCAAGAA TT CM7 EcoRIF: TTTCTAGAAATTCCGAGGAAATCTT dCAPs EcoRI 58 12 SRWD2 CM6 BbvI R: CTGCATTGGGATTTATCAG CA CM6 BbvI F: CGGAATCGAATATTATCGAAACC dCAPs BbvI 59 13 SRWD2 CM8 BsmAIF: TTAAGAGAGTAATGCTGTTGATAAG TC CM8 BsmAIR: TTAAGCACTGAATAGTGAATACCAT dCAPs BsmAI 55 14 SRWD2 CM9 EciI F: GACCGATTCCGAGTTCCGG CG CM9 EciI R: ACGGTACGGAAACTTTCCAGATTCC dCAPs EciI 64 15 bph14-2 RN16MseIF: GGGAAATGATCAATGAGTATTA RN16MseIR: AATTTAGTGATATCTCCAGTAGCCA dCAPs MseI 56 16 BPH14 RN19 AceIIIR: CCCCTAGTCAACCATTAATATGATT RN19 AceIIIF: TTCAAAGTAGAAGGGAATC AG dCAPs AceIII 56 17 BPH14 RN18 BsrDI R: TAGATGCCTGCTATGAAGGTAAT RN18 BsrDI F: GAAGAGATCATCATATATAAGGAC T dCAPs BsrDI 51 18 Pita DO11MseIF: CCTTTTATACCGCAGTTACTT DO11MseIR: AACCGCCTAGAAAAATGACCATA dCAPs MseI 59 19 pib DO5ClaIR: GAAGATGAAGAAAATAGTCGGC DO5ClaIF: CGCTATTGACTGGATCATCGA dCAPs ClaI 56 20 Pi15 DO14-13ClaIF: TGAAATATGTAACAGATCATGACTTGGG DO14-13ClaIR: TGAATCCGCCGGGTGTAGTATCGA dCAPs ClaI 63 21 pib DO11 BccI R: AGTATTGGGCATACGCCATGC DO11 BccI F: TCTAGGCGGTTGGTAAATCCAT dCAPs BccI 62 22 Pid2 DO15 MfeIF TTTACAAAGCAGTCGGTATATCAA T DO15 MfeIR AACCAAGCATATAGTCAAGGAATAA dCAPs MfeI 56 23 Pi15 DO14 MaeII F AAGTCCTGATTCGATAATATTGTAAC DO14 MaeII R AGTATAGACCTGACGATCAGGTTGT dCAPs MaeII 55 24 Pi15 Pi151713F: GAAGGTGATGATCTGGAGGATTAGG Pi151713R: CTACGCAGCGGAAAATAAAACAAAC SSLP 62 25 Pib Pib1412F: CTATATGGACTCTAGACTCGTCTTT Pib1412R: AGAAGAGCCTAGAGCCTATATCTAT SSLP 53 26 NBS-LRR NBS-LRR136F: TCGTACTTATAAACTACATGGGCCA NBS-LRR136R: AACTCCTTTGTATGCCACAGGAATT SSLP 59 27 Pib Pib143F: AATATTTCTTTTTTTAATTCCGAAT Pib143R: AAATTCAGAAWTAAAAATAAATAAT SSLP 55 28 Pib Pib156F: TATATGGACTCTAGACTCGTCTTTY Pib156R: AGAGCMTAGAGTCTATATAGAAATA SSLP 52 29 Xa27 BL30ScaIR: CTGTATTTAGACACTAATTTAGAG BL30ScaIF: AAACCCATCTATAATCTAGTA dCAPs ScaI 50 30 Xa5 BL28 MaeI R: CCAGCGAAATCTACCTTGCTG BL28 MaeI F: AGAGGACTGCCAGCAGATAACT dCAPs MaeI 58 31 Xa5 BL30 MseI F: TTAATCCATGATTAGCCTATGTGATGCTT BL30 MseI R: AGAAAACCTTAGGTGGCGTTTGGAT dCAPs MseI 63 32 Xa5 BL30 MaeIII F: TTAATCCATGATTAGCCTATGTGATGT TA BL30 MaeIII R: AGAAAACCTTAGGTGGCGTTTGGAT dCAPs MaeIII 61 33 Xa21 BL26 MseIR: GTAAGTCCAGTTTATGACTGATAAAACC BL26 MseIF: GTCTTCGTTTATCACAAAACTACAGGTATTTA dCAPs MseI 61 34 Xa27 BL29 BsrI R: CATCAAATACAGGTCTGTTCGAC BL29 BsrI F: AAGTACCTGTAGTTTTGTGATAAACT G dCAPs BsrI 55 35 Xa1 Xa1-27F: GAAGAACTGGTTATCGTAGATTGCA Xa1-27R: GCCAGTTTGGGCAGGTGGAAA SSLP 60 IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Đã đánh giá đa dạng di truyền của 6 tập đoàn giống lúa bản địa nghiên cứu, qua đó tuyển chọn được 36 giống lúa điển hình phân bố ở các vùng miền khác nhau, có độ đa dạng cao, để phục vụ cho quá trình giải mã genome (07 mẫu giống chất lượng; 06 mẫu giống chịu hạn; 06 mẫu giống chịu mặn; 07 mẫu giống kháng rầy nâu; Hội thảo Quốc gia về Khoa học Cây trồng lần thứ nhất 203 05 mẫu giống kháng đạo ôn và 05 mẫu giống kháng bạc lá). Đã giải mã thành công genome của 36 giống lúa bản địa ưu tú. Xây dựng được cơ sở dữ liệu genotype và phenotype (các đặc tính nông học, chất lượng, chống chịu sâu bệnh, đặc tính lý hóa và các đặc điểm hình thái) của 36 giống lúa nghiên cứu. Đã xác định được tổng số 783 SNPs và InDels có ý nghĩa (các SNPs và InDels nằm trong vùng gen liên quan đến các tính trạng nông sinh học quan trọng) của 36 mẫu lúa ng hiên cứu. Đã thiết kế được 35 markers (CAPs, dCAPs và SSLP) là những marker chức năng liên kết với các gen đích để xác định chính xác các alen/gen giúp qui tụ nhanh, chính xác các gen đích trong lai tạo giống. Đã xây dựng được 01 website của đề tài: www.riceagi.org.vn để chia sẻ thông ti n, cơ sở dữ liệu của Đề tài với các Viện, Trường và cơ sở nghiên cứu chọn tạo giống lúa. 4.2. Kiến nghị Để tiếp tục và kế thừa kết quả nghiên cứu theo phương pháp tiên tiến, công nghệ hiện đại và định hướng ứng dụng khai thác nguồn gen lúa của Việt Nam, chúng tôi kiến nghị được thực hiện tiếp pha II của đề tài: “Giải mã và khai thác đa dạng di truyền nguồn gen lúa bản địa của Việt Nam phục vụ các chương trình nghiên cứu và chọn tạo giống lúa” nhằm xây dựng được CSDL genome với sự đa dạng tối đa (maximize genetic diversity) bên cạnh CSDL về hình thái và ngân hàng gen hạt các giống lúa bản địa của Việt Nam để phục vụ nghiên cứu, chọn tạo giống lúa. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trần Danh Sửu, Nguyễn Thị Lan Hoa, Hà Minh Loan, Ngô Kim Hoài, Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Mạnh Hải (2011). Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa nếp địa phương ở các tỉnh đồng bằng Bắc Bộ bằng chỉ thị SSR. Tạp chí Công nghệ sinh học. 2. Alavi M., Ahmadikhah A., Kamkar B. and Kalateh M. (2009). Mapping Rf3 locus in rice by SSR and CAPS markers. International Journal of Genetics and Molecular Biology, 1 (7), pp. 121-126. 3. Andersen J. R. and Lübberstedt T. (2003). Functional markers in plants. Trends in Plant Science, 8, pp. 554-560. 4. Fukuoka S. and Okuno K. (2001). QTL analysis and mapping of pi21, a recessive gene for field resistance to rice blast in Japanese upland rice. Theor Appl Genet, 103, pp. 185-90. 5. Girija R. M. and Adilakshmi D. (2011). Genetic Analysis of Blast Resistance in Rice with Simple Sequence Repeats (SSR). Journal of Crop Improvement, 25 (3), pp. 232-238, 2011. 6. Goff S. A., Ricke D. and Lan T. H. (2002). A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. japonica). Science, 296 (5565), pp. 92-100. 7. Hs ia A. P., Wen, T. J., Chen H. D., Liu Z., Yandeau- Nelson M. D., Wei Y., Guo L. and Schnable P. S. (2005). Temperature gradient capillary electrophoresis (TGCE) - a tool for the high- throughput discovery and mapping of SNPs and IDPs. Theoretical and Applied Genetics, 111, pp. 218-225. 8. Jairin J., Teangdeerith S., Leelagud P., Phengrat K., Vanavichit A. and Toojinda T. (2007b). Detection of brown planthopper resistance genes from different rice mapping populations in the same geno- mic location. Sci. Asia, 33, pp. 347-352. 9. Jena K. K., Jeung J. U., Lee J. H., Choi H. C. and Brar D. S. (2006).High-resolution mapping of a new brown planthopper (BPH) resistance gene, Bph18(t), and marker-assisted selection for BPH resistance in rice (Oryza sativaL.). Theor.Appl.Genet., 112, pp.288-297. 10. Karl V., Shale A. D. and Jacob D. D. (2009). Next Generation Sequencing: From Basic Research to Diagnostics. Clinical Chemistry, 55 (4), pp. 41-47. 11. Lee G. A., Koh H. J., Chung H. K., Dixit A., Chung J. W., Ma K. H., Lee S. Y., Lee J. R., Lee G. S., Gwag J. G., Kim T. S. and Park Y. J. (2009). Development of SNP-based CAPS and dCAPS markers in eight different genes involved in starch biosynthesis in rice. Molecular Breeding, 24 (1), pp. 93-101. 12. Lestari P. and Koh H. J. (2013). Development of new CAPS/dCAPS and SNAP markers for rice eating quality. HAYATI Journal of Biosciences, 20 (1), pp. 15-23. 13. McNally K. L., Childs K. L., Bohnert R., Davidson R. M., Zhao K., Ulat V. J., et al. (2009). Genomewide SNP variation reveals relationships among landraces and modern varieties of rice. Proc Natl Acad Sci USA, 106, pp. 12273-12278. 14. Obara O. P and Kako S. (1998). Genetic diversity and identification of Cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Euphytica, 99, pp. 95-1001. 15. Rohlf F. J. (2000). NTSYS-pc: Numerical taxonomy and multivariate analysis system. Version 2.1. Exeter Publication, New York, USA. 16. Saka N., Tsuji T., Toyama T., Yano M., Izawa T. and Sasaki T. (2006). Development of cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) markers linked to a green rice leafhopper resistance gene, Grh3(t). Plant Breeding, 125, pp. 140-143. . đề tài Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam nhằm ứng dụng khai thác nguồn gen lúa hiệu quả phục vụ cho công tác nghiên cứu chọn tạo ra những giống lúa mới. thứ nhất 195 NGHIÊN CỨU GIẢI MÃ GENOME MỘT SỐ GIỐNG LÚA ĐỊA PHƯƠNG CỦA VIỆT NAM Khuất Hữu Trung, Lê Huy Hàm và cộng sự Viện Di truyền Nông nghiệp SUMMARY Sequencing the genomes of a number. trình tự genome của 36 mẫu giống lúa nghiên cứu đã giải mã được tổng hợp ở bảng 2. Bảng 2. Thống kê số lượng file đọc, contigs và độ dài các contigs của 36 giống lúa TT Tên giống lúa Số file