Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn

Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đánh giá ảnh hưởng của glucan và vitamin C

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ĐẶNG TRẦN QUÂN ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ****0O0**** ỨNG DỤNG MÔ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN ĐÁNH GIÁ ẢNH HƢỞNG CỦA β-1,3/1,6-GLUCAN VÀ VITAMIN C LÊN ĐỘ MẪN CẢM ĐỐI VỚI VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (White spot syndrome virus-WSSV) CỦA TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. NGUYỄN VĂN HẢO ĐẶNG TRẦN QUÂN ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN KHÓA: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh -Tháng 9/2006- MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  APPLICATION OF STANDARDIZIED CHALLENGE MODEL TO TEST THE EFFICACY OF β-1,3/1,6-GLUCAN AND VITAMIN C ON THE SUCCEPTIBILITY OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) TO WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV) GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. NGUYEN VAN HAO DANG TRAN QUAN MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn quý thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã truyền đạt cho tôi kiến thức trong những năm học vừa qua. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp này, tôi đã nhận sự giúp rất nhiều từ các thầy cô và các anh chị công tác ở Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Trong đó tôi xin chân thành cảm ơn: - TS. Nguyễn Văn Hảo đã tận tình giải đáp những vƣớng mắc trong quá trình thực tập, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - ThS. Ngô Xuân Tuyến là ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn về phƣơng pháp nghiên cứu, tài liệu khoa học, giúp tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp. - Kỹ sƣ Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn tôi về mặt thao tác trong phòng thí nghiệm, giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực tập. - Các anh chị ở phòng Mô, các anh chị ở trại thực nghiệm Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập vừa qua. Cuối cùng là cảm ơn các bạn lớp Công nghệ sinh học 28 thân mến đã cùng tôi đồng hành trên suốt chặng đƣờng đại học. Tp.Hồ Chí Minh, ngày…tháng…năm 2006 Sinh viên Đặng Trần Quân v TÓM TẮT Trong công nghệ nuôi tôm hiện nay, đặc biệt là các mô hình nuôi tôm mật độ cao, việc áp dụng các giải pháp, phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng hiệu quả sản xuất đóng góp đáng kể vào năng suất nuôi. Giải pháp quản lý sử sụng các sản phẩm sinh học tăng cƣờng sức khỏe cho tôm thông qua việc tăng cƣờng hiệu quả đáp ứng miễn dịch của tôm với mầm bệnh, nhất là với mầm bệnh virus, đƣợc xem là giải pháp khá quan trọng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi đánh giá sự thay đổi tính mẫn cảm của tôm sú tiền trƣởng thành Penaeus monodon đối với virus đốm trắng (WSSV) sau khi ứng dụng các giải pháp bổ sung các chất kích thích miễn dịch, vitamin C và β- 1,3/1,6-glucan vào thức ăn nuôi tôm trong khoảng thời gian nhất định. Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn dịch và phƣơng pháp tiêm mô dịch gốc virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) đã đƣợc tinh sạch và xác định độc lực thông qua chuẩn độ để xác định sự thay đổi độ mẫn cảm đối với virus của tôm. Thí nghiệm đƣợc tiến hành với hai liều tiêm cao và thấp của độ chuẩn SID 50 của dịch gốc WSSV-VN cho tôm sú tiền trƣởng thành sau khi đã nuôi với 3 nghiệm thức thức ăn có bổ sung β-1,3/1,6-glucan (10g/kg thức ăn), bổ sung vitamin C (5g/kg thức ăn) và không bổ sung trong thời gian 15 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm cho tôm ở liều thấp (10 1,5 SID 50 ) và liều cao (10 4 SID 50 ) của dịch virus WSSV-VN cho 3 nhóm tôm thuộc 3 nghiệm thức trên. Thu mẫu tôm ở các thời điểm khác nhau sau gây nhiễm: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giờ, để khảo sát sự thay đổi độ mẫn cảm thông qua đánh giá sự biến đổi tình trạng sức khỏe tôm và tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm giữa các nghiệm thức. Kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 4,12, 3,49 và 4,94%. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm giữa 3 nghiệm thức này không có ý nghĩa (P>0,05). Các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. Chƣa thấy rõ sự khác biệt giữa nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thí nghiệm gây nhiễm với liều cao, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức β-1,3/1,6- glucan, vitamin C và đối chứng lần lƣợt là 3,04, 3,69 và 4,49%. Chỉ có sự khác biệt có ý nghĩa (P<0,05) về tỷ lệ này giữa nghiệm thức đối chứng với β-1,3/1,6-glucan. Các vi dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm hơn ở nghiệm thức đối chứng so với 2 nghiệm thức còn lại. β-1,3/1,6-glucan thể hiện rõ tác dụng làm giảm độ mẫn cảm với WSSV của tôm sú. Trong từng phƣơng thức quản lý, tỷ lệ tế bào nhiễm ở 2 liều tiêm không có sự khác biệt (P>0,05). Ở nhóm tiêm với liều cao, các dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đến sớm hơn nhóm tiêm liều thấp. vii MỤC LỤC Trang tựa i Lời cảm ơn . iii Tóm tắt . iv Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt vii Danh sách các bảng . ix Danh sách các hình . x PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Nội dung 1 1.3 Mục tiêu 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 3 2.1 Hệ miễn dịch của tôm sú . 3 2.2 Bệnh đốm trắng trên tôm sú 5 2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng . 5 2.2.2 Tác nhân gây bệnh 5 2.2.3 Dấu hiệu bệnh lý . 6 2.2.4 Phƣơng thức lan truyền 6 2.3 Các phƣơng thức quản lý nhằm tăng cƣờng sức chịu đựng của tôm đối với bệnh đốm trắng . 7 2.3.1 Chất kích thích miễn dịch . 7 2.3.2 Vaccin . 10 2.3.3 Vitamin . 11 2.3.4 Fucoidan . 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm . 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn . 13 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 14 2.5 Sơ lƣợc về hóa mô miễn dịch . 15 2.5.1 Nguyên lý . 15 2.5.2 Các phƣơng pháp nhuộm 15 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIỆN CỨU 16 3.1 Thời gian và địa điểm . 16 3.2 Vật liệu nghiên cứu . 16 3.2.1 Vật liệu sinh học . 16 3.2.2 Dụng cụ và hóa chất . 16 3.2.2.1 Dụng cụ . 16 3.2.2.2 Hoa chất 17 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch huyền phù virus . 19 3.3.2 Phƣơng pháp gây nhiễm WSSV trên tôm sú 19 3.3.3 Phƣơng pháp thu mẫu cho IHC 19 3.3.4 Phƣơng pháp xác định WSSV trên tôm bằng kỹ thuật IHC . 19 3.3.5 Phƣơng pháp tính tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm thí nghiệm20 3.3.6 Phƣơng pháp đo một số yếu tố môi trƣờng nƣớc . 20 3.3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu 20 viii 3.4 Bố trí thí nghiệm . 21 3.4.1 Chuẩn bị vật liệu cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn . 21 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (10 5,2 SID 50 /ml) . 21 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Đáng giá vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn 23 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm đối với WSSV 24 4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều thấp (10 1,5 SID 50 /ml) 24 4.2.2 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm trên tôm sú với liều cao (10 1,5 SID 50 /ml) 28 4.2.3 Kết quả so sánh độ mẫn cảm với 2 liều gây nhiễm của tôm ở từng phƣơng thức quản lý 32 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận . 35 5.2 Đề nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO …37 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSD: White spot disease. WSSV: White spot syndrome Virus. WSSV-VN: White spot syndrome virus Vietnam IHC: Immunohistochemistry. proPO: prophenoloxidase LPS: Lipopolysaccharide BGBP: Beta-glucan biding protein VP19: envelope protein (19 kDa). VP28: envelope protein (28 kDa). DNA: Deoxiribonucleotide acid. RNA: Ribonucleotide acid. MBV: Monodon Baculovirus YHV: Yellow Head Vius. IHHNV: Infectious hypodermal hemotopoietic necrosis virus. PCR: Polymerase chain reaction. PAP: peroxidase anti peroxidase ABC: avidin-biotin complex LSAB: labelled streptavidin-biotin BPS: Buffer phosphate saline DAB: 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride. SID 50 /ml: Shrimp infectious dose 50% enpoint x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm nuôi tôm sú với các phƣơng thức quản lý khác nhau . 20 Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm 21 Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình thí nghiệm . 23 Bảng 4.2 Kết quả tăng trọng của tôm sau 15 ngày nuôi . 23 Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp…………………………………………… 24 Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp 25 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp………………………………………26 Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều cao 28 Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ nhiễm WSSV của tôm ở 3 nghiệm thức ở liều cao 30 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở các thời điểm thu mẫu ở liều cao…… ………………………………………30 Bảng 4.9 So sánh kết quả theo dõi thực nghiệm và phân tích tỷ lệ cảm nhiễm (IHC) giữa 2 liều tiêm……………………………………………… 32 Bảng 4.10 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở từng phƣơng thức quản lý đƣợc gây nhiễm với 2 liều tiêm………………………………………………33 [...]... (Bonilla và ctv, 2005) Tuy nhiên, để ứng dụng vào thực tiễn sản xuất tôm thƣơng phẩm thì cần có những công trình nghiên cứu nhằm đánh giá một cách chính xác và khoa học hiệu quả của tất cả các phƣơng đánh thức này 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm: 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn: WSSV nhiễm trên một vài loài tôm nuôi và gây ra thiệt hại nghiêm trọng do tỷ lệ tôm chết... lƣợng virus gây nhiễm cho mỗi tôm thì không đƣợc biết Hơn nữa phƣơng thức này thì không đảm bảo đƣợc mỗi tôm đều nhận đƣợc một lƣợng virus nhƣ nhau Theo Bonilla và ctv (2005) mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn sử dụng một dịch huyền phù virus đã đƣợc chuẩn độ để đánh giá hiệu quả các chiến lƣợc nhằm làm giảm tác động của WSSV Theo đó, một mô hình gây nhiễm chuẩn cần 2 yếu tố chính: Động vật thí nghiệm. .. thí nghiệm về tỷ lệ và cƣờng độ cảm nhiễm của WSSV bằng IHC cho thấy, ở cả ba nghiệm thức tôm đã bị nhiễm WSSV ở thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm Ở thời điểm 24 giờ đã quan sát thấy tế bào tôm bị nhiễm WSSV đƣợc thu mẫu từ tôm ở cả 3 nghiệm thức (Hình 4.2) 25 Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang của tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV A: Nghiệm thức -1,3/1,6-glucan, B: Nghiệm. .. virus theo công thức của Reed – Muench (1938) 2.4.2 Ứng dụng của mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn: Với những đặc điểm nêu trên, mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn có nhiều ứng dụng quan trọng: Đánh giá sự khác nhau về độ mẫn cảm của vật chủ ở các giai đoạn sống khác nhau hay giữa các loài có quan hệ gần gũi với cùng một tác nhân gây bệnh (Plumb và Zilberg, 1999) Cụ thể ở tôm, có sự khác biệt về... kiềm tổng: 120 mg/L Chỉ tiêu môi trƣờng nƣớc đƣợc theo dõi: + Trong ngày: pH, oxy hòa tan (DO) ở 8 giờ và 14 giờ + Trong tuần: Amoniac ở 8 giờ ngày đầu tuần Tôm đƣợc nuôi và cho ăn 15 ngày và chuyển sang bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn WSSV 22 3.4.2 Bố trí thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với dịch virus WSSV-VN đã chuẩn độ (105,2SID50/ml) Tiến hành 2 thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với 2 nồng độ... lƣợng virus sẽ gây nhiễm cho 50% tôm thí nghiệm Cho đến nay, trên thế giới vẫn chƣa tìm ra môi trƣờng nuôi cấy tế bào tôm do đó việc chuẩn độ chỉ đƣợc thực hiện trên môi trƣờng in vivo Một dãy các độ pha loãng theo cơ số 10 của dịch WSSV gốc đƣợc gây nhiễm cho tôm thí nghiệm bằng cách tiêm vào cơ hay qua đƣờng miệng Dựa vào tỷ lệ tôm nhiễm ở mỗi độ pha loãng sẽ tính đƣợc hiệu giá gây nhiễm SID50 /ml... cho các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn tiếp theo Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn 24 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm sú đối với WSSV 4.2.1 Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm WSSV trên tôm sú với liều thấp (101,5SID50) Kết quả theo dõi thực nghiệm cho thấy, tôm ở nghiệm thức đối chứng có biểu hiện bất thƣờng xuất hiện sớm nhất sau gây nhiễm WSSV... 20 Hình 3.2 Hình bố trí thí nghiệm cảm nhiễm WSSV cho tôm 21 Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn 23 Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV 25 Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp 26 Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều thấp 26 Hình 4.3...DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Sơ đồ sự kích hoạt của β-glucan và Lipopolysaccharide lên các tế bào máu cùa giáp xác 4 Hình 2.2 Virus hội chứng đốm trắng 6 Hình 2.3 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV 6 Hình 2.4 Cấu trúc hóa học của -1,3/1,6-glucan 9 Hình 2.5 Cấu trúc hóa học của vitamin C 12 Hình 3.1 Gây nhiễm WSSV cho tôm bằng cách tiêm... chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV 29 Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang ở tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao 29 Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao 30 Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều cao 31 Hình 4.5 Tôm đƣợc bổ sung β-1,3/1,6-glucan ở 120 giờ sau gây nhiễm 32 xi 1 PHẦN 1 MỞ . ............................................................................................. 12 2.4 Mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn WSSV trên tôm ........................... 13 2.4.1 Sơ lƣợc về mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn ............................ Sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng bởi Phòng thí nghiệm virus - Đại học Gent, Vƣơng Quốc Bỉ, kỹ thuật xét nghiệm hóa mô miễn