Tiến hành 2 thí nghiệm gây nhiễm chuẩn cho tôm với 2 nồng độ của dịch virus WSSV-VN đã đƣợc chuẩn độ xác định liều gây nhiễm 50% tôm thí nghiệm (105,32SID50/ml) là: liều thấp (101.5SID50) và liều cao (104SID50).
Mỗi thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD), 3 nghiệm thức (β-1,3/1,6-glucan, vitamin C và đối chứng) Mỗi nghiệm thức bố trí 11 bể gây nhiễm cho 11 đợt thu mẫu + 1 bể đối chứng tiêm PBS. Số tôm ở mỗi bể là 3 con cho 3 lần lặp lại.
Thời gian thu mẫu tôm:
Bảng 3.2 Các thời điểm thu mẫu ở mỗi đợt thí nghiệm.
0 giờ 12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ 60 giờ 72 giờ 84 giờ 96 giờ 108 giờ 120 giờ
Ghi chú: Thu ở 0 giờ là để xem hiệu quả tiêm.
Các nghiệm thức đƣợc cho ăn ngày 3 lần: 8, 13 và 18 giờ. Chỉ tiêu đƣợc duy trì ổn định:
+ Nhiệt độ: 27oC + Độ mặn: 20o/oo + Độ kiềm tổng: 120 mg/L
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Đánh giá nguồn vật liệu phục vụ cho thí nghiệm gây nhiễm chuẩn
Nhìn chung, trong suốt 15 ngày nuôi, qua các chỉ tiêu theo dõi, nhận thấy điều kiện môi trƣờng nuôi là phù hợp cho tôm nuôi ở cả 3 phƣơng thức quản lý.
Bảng 4.1 Kết quả theo dõi các chỉ tiêu môi trƣờng trong quá trình nuôi (Phụ lục 1)
Tốc độ tăng trọng của tôm:
Bảng 4.2 Tốc độ tăng trọng trung bình của tôm sau 15 ngày nuôi
Phƣơng thức Tăng trọng trung bình (g/ngày)
β-1,3/1,6-glucan 0,078
Vitamin C 0,138
Đối chứng 0,094
Trong quá trình nuôi, tôm ở 3 phƣơng thức quản lý có biểu hiện bình thƣờng. Tôm chết trong quá trình nuôi là do ăn nhau khi ở giai đọan lột xác. Đến cuối đợt, số tôm còn lại ở mỗi bể:
-1,3/1,6-glucan: 98 con (98% số tôm ban đầu).
Vitamin C: 98 con (98% số tôm ban đầu).
Đối chứng: 95 con (95% số tôm đầu)
Nhìn chung đã tạo đƣợc nguồn tôm phù hợp cho các thí nghiệm gây nhiễm chuẩn tiếp theo.
Hình 4.1 Bể nuôi tôm với hệ thống lọc tuần hoàn
Phƣơng thức Khoảng dao động pH Nhiệt độ Amoniac Oxy hòa tan β-1,3/1,6 -glucan 7,35 – 7,72
28oC <1mg/L > 6 mg/L
Vitamin C 7,37 – 7,69
4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của các phƣơng thức quản lý khác nhau lên độ mẫn cảm của tôm sú đối với WSSV của tôm sú đối với WSSV
4.2.1. Kết quả ở thí nghiệm gây nhiễm WSSV trên tôm sú với liều thấp (101,5SID50)
Kết quả theo dõi thực nghiệm cho thấy, tôm ở nghiệm thức đối chứng có biểu hiện bất thƣờng xuất hiện sớm nhất sau gây nhiễm WSSV so với 2 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Cụ thể, tôm ở nghiệm thức này có dấu hiệu đỏ đuôi ở 20 giờ, đỏ thân ở 24 giờ sau gây nhiễm, trong khi hai nghiệm thức còn lại dấu hiệu đỏ thân xuất hiện trễ hơn (Bảng 4.3). Dấu hiệu điển hình của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (33 giờ). Tôm bị chết sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (49 giờ sau gây nhiễm) và trễ nhất là ở nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan (83 giờ sau gây nhiễm). Kết thúc thí nghiệm gây nhiễm với liều thấp, số tôm chết đƣợc ghi nhận ở cả 3 nghiệm thức đối chứng, vitamin C và β-1,3/1,6-glucan lần lƣợt là 7, 6 và 5 con đều cho kết quả IHC dƣơng tính với WSSV. Tôm đối chứng tiêm PBS vẫn khỏe đến cuối đợt thí nghiệm.
Bảng 4.3 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều thấp
Nghiệm thức
Thời điểm xuất hiện đỏ thân (giờ)
Thời điểm xuất hiện đốm trắng (giờ)
Thời điểm tôm bị chết (giờ) Tổng số tôm chết β-1,3/1,6-glucan 27 44 83 5 Vitamin C 33 49 68 6 Đối chứng 24 33 49 7
Kết quả phân tích tại phòng thí nghiệm về tỷ lệ và cƣờng độ cảm nhiễm của WSSV bằng IHC cho thấy, ở cả ba nghiệm thức tôm đã bị nhiễm WSSV ở thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm. Ở thời điểm 24 giờ đã quan sát thấy tế bào tôm bị nhiễm WSSV đƣợc thu mẫu từ tôm ở cả 3 nghiệm thức (Hình 4.2).
Hình 4.2 Hình chụp mẫu mô mang của tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 40X) thời điểm 24 giờ sau gây nhiễm WSSV
A: Nghiệm thức -1,3/1,6-glucan, B: Nghiệm thức vitamin C, D: Đối chứng ( chỉ tế bào nhiễm WSSV)
Kết quả ghi nhận về cƣờng độ nhiễm WSSV bằng IHC, đƣợc đánh giá thông qua tỷ lệ (%) tế bào nhiễm trên tổng số tế bào không nhiễm trong một thị trƣờng tại vùng có mật độ tế bào nhiễm WSSV cao nhất của mô mang, cho thấy tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên lô đối chứng là cao nhất (Bảng 4.4), tỷ lệ tế bào nhiễm trung bình trên vùng khảo sát là 4,94%, kế đến là nghiệm thức cho ăn thức ăn trộn β-1,3/1,6- glucan (4,12%) và thấp nhất là nghiệm thức cho ăn thức trộn vitamin C (3,49%). Tuy nhiên, khi xử lý thống kê trên toàn bộ dữ liệu ghi nhận không có sự khác biệt có ý nghĩa (P>0,05) về tỷ lệ tế bào nhiễm trên vùng khảo sát giữa ba nghiệm thức (Phụ lục 3)
Bảng 4.4 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm kiểm tra bằng IHC ở liều thấp Nghiệm thức Tỷ lệ nhiễm WSSV trung bình (%) -1,3/1,6-Glucan 4,12 Vitamin C 3,49 Đối chứng 4.94
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều thấp
Ở nghiệm thức đƣợc bổ sung vitamin C, qua các thời điểm thu mẫu từ 24 – 84 giờ, có thể nhận thấy tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV có khuynh hƣớng thấp hơn nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan và đối chứng. Tuy nhiên ở các thời điểm thu mẫu tiếp theo 96, 108, 120 giờ, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV của nghiệm thức này tăng lên cao hơn nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và không cách biệt lắm so với đối chứng (Biểu đồ 4.2).
Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) trên tôm bằng IHC theo thời gian thu mẫu ở liều thấp
Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trung bình (%)
Nghiệm
Thức 0giờ 12giờ 24giờ 36giờ 48giờ 60giờ 72giờ 84giờ 96giờ 108giờ 120giờ
B 0 0 1,94 5,75 4,53 9 5,48 13,57 1,59 2,28 1,19
V 0 0 0,37 3,47 3,98 6,34 2,23 3,06 4,75 8,09 6,16
Đ 0 0 0,8 5,49 7,82 6,93 11,51 6,03 4,91 4,19 6,7
Ghi chú:
B: β-1,3/1,6-glucan, V:vitamin C, Đ: đối chứng
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian ở liều thấp
Biểu đồ tỷ lệ tế bào nhiễm WS S V (%) của tôm ở liều thấp 4,12 3,49 4,94 0 1 2 3 4 5 6 β-1,3/1,6- glucan Vitamin C Đối chứng Nghiệm thức Tỷ l ệ tế b ào n h iễ m WS S V (%) β-1,3/1,6- glucan Vitamin C Đối chứng
Biểu đồ tỷ lệ tế bào nhiễm WS S V (%) của tôm theo thời gian ở liều thâp
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120
Thời gian thu mẫu (giờ)
Tỷ l ệ n hi ễm WS SV (%) β-1,3/1,6- glucan Vit amin C Đối chứng
Trái lại, ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan, nhìn chung tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV có chiều hƣớng cao hơn nghiệm thức bổ sung vitamin C và không cách biệt lắm với nghiệm thức đối chứng ở các thời điểm thu mẫu từ 24 – 84 giờ. Ở các thời điểm 96, 108, 120 giờ sau gây nhiễm, tỷ lệ nhiễm WSSV của nghiệm thức này giảm và thấp so với 2 nghiệm thức còn lại.
Nhận xét và thảo luận:
Tác động của các giải pháp quản lý đƣợc áp dụng ở đây thể hiện rất rõ qua kết quả theo dõi thực nghiệm. Thời điểm xuất hiện dấu hiệu bệnh tích đầu tiên của bệnh đốm trắng có chậm đi ở 2 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Thời điểm tôm bị chết cũng muộn hơn và số tôm chết ở 2 nghiệm thức này cũng thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng.
Ở nghiệm thức bổ sung vitamin C, tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm thấp trong thời gian đầu (24 – 84 giờ) và cao hơn ở 96, 108 và 120 giờ. Điều này có thể do tác dụng kích thích của vitamin C lên hoạt động của hệ miễn dịch giảm dần theo thời gian sau khi tôm bổ sung vitamin C đƣợc gây nhiễm WSSV. Theo López và ctv (2003) cho thấy ở tôm thẻ chân trắng (Litopeneaus vannamei) sau khi đƣợc bổ sung vitamin C, các thành phần của hệ miễn dịch nhƣ tổng lƣợng tế bào máu, số tế bào hạt (granular cells), proPO đều tăng cao hơn nghiệm thức đối chứng. Có thể ở tôm sú cũng có hiện tƣợng tƣơng tự. Theo tác giả này vitamin C có tác dụng cải thiện sức khỏe, tăng cƣờng các quá trình trao đổi chất ở tôm. Ngoài ra, vitamin C còn đƣợc chứng minh có tác dụng kích thích miễn dịch trên tôm sú (Marchie và ctv, 1998).
Ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan, tỷ lệ nhiễm WSSV cao trong thời gian đầu (24 – 84 giờ) và giảm dần ở các thời điểm thu mẫu tiếp theo. Điều này có thể do đặc điểm tác động của β-glucan. Theo López và ctv (2003), β-glucan có tác dụng kích thích hệ miễn dịch của tôm và luôn duy trì nó ở trạng thái báo động. Khi đƣợc tiếp xúc với stress, tôm có thể chịu đựng đƣợc. Tuy nhiên tác dụng này chỉ ở thời điểm đáp ứng với stress và sau đó hệ miễn dịch có hiện tƣợng mệt mỏi.Trong thí nghiệm của chúng tôi, có thể do quá trình chuyển tôm từ bể 1 m3 lên phòng thí nghiệm gây nhiễm, khi tiêm virus đã gây stress cho tôm. Đến khi WSSV bắt đầu tấn công thì hệ miễn dịch của tôm đang ở tình trạng mệt mỏi sau khi đáp ứng với stress nên tỷ lệ nhiễm WSSV cao, tuy nhiên không khác biệt lắm so với nghiệm thức đối chứng. Ở các thời điểm thu mẫu 96, 108 và 120 giờ nhận thấy tỷ lệ nhiễm WSSV giảm có thể do có hiện tƣợng phục
hồi miễn dịch. Trong một nghiên cứu của Chang và ctv (2003), sau một thời gian gây nhiễm WSSV nhất định thì các thành phần trong hệ miễn dịch của tôm có bổ sung β-glucan bắt đầu phục hồi: sau 3 ngày hoạt tính prophenoloxidase đƣợc phục hồi và sau 9 ngày thì tổng lƣợng tế bào máu, hoạt tính superoxide dismutase đƣợc phục hồi,…Trong thí nghiệm của chúng tôi sự phục hồi của hệ miễn dịch sớm hơn có thể là do ảnh hƣởng các yếu tố nhƣ độc lực virus gây nhiễm, nguồn gốc và thời gian bổ sung β-glucan, cách thức gây nhiễm, tuổi của tôm… Tuy nhiên kết quả trùng hợp là đến 120 giờ chƣa thấy sự phục hồi ở lô đối chứng. Kết quả này bƣớc đầu khẳng định hiệu quả của những chất kích thích miễn dịch sử dụng trong thí nghiệm.
Sự khác biệt về biểu hiện của tôm ở 3 nghiệm thức sau khi gây nhiễm có thể là do ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan, cơ thể tôm đã quen với tình trạng căng thẳng miễn dịch. Khi tiếp xúc với virus hiện tƣợng suy giảm khả năng đáp ứng đến chậm hơn ở nghiệm thức đối chứng. Tƣơng tự ở nghiệm thức bổ sung vitamin C, chất này ngoài tác dụng kích thích miễn dịch còn giúp tăng cƣờng các quá trình trao đổi chất trong cơ thể, giúp cải thiện tình trạng sức khỏe nên tôm đáp ứng với virus tốt hơn.
4.2.2. Kết quả thí nghiệm gây nhiễm WSSV trên tôm sú với liều cao (104SID50)
Bảng 4.6 Kết quả theo dõi thực nghiệm dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng sau khi gây nhiễm liều cao
Kết quả theo dõi thực nghiệm cho thấy, tôm ở nghiệm thức đối chứng có biểu hiện bất thƣờng xuất hiện sớm nhất sau gây nhiễm WSSV so với 2 nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan và vitamin C. Cụ thể, tôm ở nghiệm thức đối chứng có dấu hiệu đỏ thân ở 18 giờ sau gây nhiễm (trùng thời gian xuất hiện đỏ thân ở nghiệm thức vitamin C). Trong khi nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan, dấu hiệu đỏ thân xuất hiện trễ hơn (21 giờ) (Bảng 4.6). Dấu hiệu điển hình của bệnh đốm trắng xuất hiện sớm nhất là ở
Nghiệm thức
Thời điểm xuất hiện đỏ
thân (giờ)
Thời điểm xuất hiện đốm trắng (giờ) Thời điểm tôm bị chết (giờ) Tổng số tôm chết β-1,3/1,6- glucan 21 41 69 2 Vitamin C 18 41 53 4 Đối chứng 18 31 38 6
nghiệm thức đối chứng (31 giờ) và ở hai nghiệm thức còn lại là 41 giờ. Tôm bị chết sớm nhất là ở nghiệm thức đối chứng (38 giờ sau gây nhiễm) và trễ nhất là ở nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan (69 giờ sau gây nhiễm). Kết thúc thí nghiệm gây nhiễm với liều cao số tôm chết đƣợc ghi nhận ở cả 3 nghiệm thức đối chứng, vitamin C và β-1,3/1,6- glucan lần lƣợt là 6, 4 và 2 con đều cho kết quả IHC dƣơng tính với WSSV. Tôm đối chứng tiêm PBS vẫn khỏe đến cuối đợt thí nghiệm. Nghiệm thức β-1,3/1,6-glucan cho tỷ lệ chết thấp nhất.
Hình 4.3 Tôm đối chứng chết thời điểm 38 giờ sau gây nhiễm WSSV A: Dấu hiệu đỏ thân; B: Đốm trắng trên nắp carapace
Kết quả phân tích IHC tại phòng thí nghiệm về tỷ lệ tế bào nhiễm hay cƣờng độ cảm nhiễm của WSSV cho thấy, ở cả ba nghiệm thức, tôm đã bị nhiễm WSSV ở thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm. Ở thời điểm 12 giờ đã quan sát thấy tế bào tôm bị nhiễm WSSV trên mẫu mang tôm ở cả 3 nghiệm thức (Hình 4.4). Thời điểm nhiễm WSSV của tôm ở thí nghiệm này sớm hơn ở lô thí nghiệm liều thấp (24 giờ), nhƣng với số lƣợng tế bào bị nhiễm rất ít, chỉ 1 – 2 tế bào nhiễm trên cả mẫu. Thời điểm phát hiện tế bào nhiễm WSSV sớm có thể do ảnh hƣởng của nồng độ virus tiêm cho tôm lớn hơn (104SID50) so với ở thí nghiệm với liều thấp (101,5
SID50). Tuy nhiên ở thời điểm này,
tôm chƣa có dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng.
Hình 4.4 Hình chụp mẫu mô mang của tôm đƣợc nhuộm IHC (vật kính 100X) thời điểm 12 giờ sau gây nhiễm WSSV ở liều cao
A: Nghiệm thức -1,3/1,6-glucan, B: Nghiệm thức vitamin C, C: Đối chứng
C
A B
Bảng 4.7 Kết quả tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao Nghiệm thức Tỷ lệ tế bào nhiễm trung bình (%)
-1,3/1,6-Glucan 3,04
Vitamin C 3,69
Đối chứng 4,49
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm ở liều cao
Kết quả phân tích IHC cũng cho thấy cƣờng độ nhiễm WSSV trên tôm của nghiệm thức đối chứng là cao nhất với tỷ lệ tế bào nhiễm trung bình là 4,49% (Bảng 4.7), nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan là thấp hơn hai nghiệm thức còn lại (3,04%). Tuy nhiên, kết quả xử lý thống kê cho thấy chỉ có sự khác biệt giữa lô
-1,3/1,6-glucan với lô đối chứng là có ý nghĩa (P<0,05). Nghĩa là việc bổ sung -1,3/1,6-glucan có ý nghĩa trong việc kích thích hệ miễn dịch của tôm chống lại
WSSV. Không có sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV giữa nghiệm thức vitamin C với 2 nghiệm thức còn lại (P>0,05).
Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV trên tôm bằng IHC ở các thời điểm thu mẫu ở liều cao
Tỷ lệ tế bào nhiễm trung bình (%)
NT 0giờ 12giờ 24giờ 36giờ 48giờ 60giờ 72giờ 84giờ 96giờ 108giờ 120giờ
B 0 0,06 1,9 2,51 6,54 5,11 2,41 3,05 6,14 4,43 1,24
V 0 0,14 2,51 4,26 6,14 6,49 2,3 3,58 6,22 4,78 4,19
Đ 0 0,04 1,98 3,30 9,33 5,27 8,2 6,89 5,12 6,86 2,44
Ghi chú: B: Beta-1,3/1,6-glucan, V: Vitamin C, Đ: Đối chứng.
Biểu đồ tỷ lệ tế bào nhiễm WS S V (%) của tôm ở liều cao 3,04 3,69 4,49 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 β-1,3/1,6- glucan Vitamin C Đối chứng Nghiệm thức Tỷ l ệ tế b ào n hi ễm WS SV (%) β-1,3/1,6- glucan Vitamin C Đối chứng
Biểu đồ 4.4 Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV (%) của tôm theo thời gian thu mẫu ở liều cao Nhìn chung ở hầu hết các thời điểm thu mẫu, tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan có chiều hƣớng thấp hơn so với 2 nghiệm thức còn lại. Sự khác biệt về tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV giữa nghiệm thức bổ sung vitamin C với nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan và đối chứng chƣa thể hiện rõ theo thời gian (Biểu đồ 4.4).
Nhận xét và thảo luận:
Tỷ lệ tế bào nhiễm WSSV ở nghiệm thức bổ sung β-1,3/1,6-glucan thấp hơn nghiệm thức đối (P<0,05). Quan sát biểu hiện cũng cho thấy ở nghiệm thức này ít