Ứng dụng kĩ thuật PCR-RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con

PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Trong chăn nuôi heo, vấn đề quan trọng là heo phải mắn đẻ, sai con, tốc độ tăng trưởng nhanh, ít tiêu tốn thức ăn và phẩm chất quày thịt tốt Vì vậy các nhà chọn giống

đã không ngừng nghiên cứu, chọn lọc và cải tạo giống nhằm đem lại năng suất và hiệu quả cao nhất Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của việc chăn nuôi heo như: phẩm chất con giống, dinh dưỡng, trình độ chăm sóc quản lý,

vệ sinh phòng bệnh…Trong đó phẩm chất con giống là yếu tố đặc biệt quan trọng

Để cải thiện năng suất sinh sản trên heo nái, đặc biệt là số con trên ổ, tỉ lệ sống sót của các heo con sau khi sinh các nhà chọn giống ở các nước đã áp dụng nhiều chương trình chọn giống mới kết hợp với phương pháp chọn lọc truyền thống Người ta đã tiến hành chọn giống heo dựa vào gen đánh dấu (Marker assisted selection – MAS) Theo các nghiên cứu của Vincent và cộng sự (1998), Drogemuller và cộng sự (2000), Rothchild và cộng sự (1996, 2000) cho thấy gen thụ thể prolactin (PRLR), gen thụ thể estrogen (ESR) và retinol binding protein 4 (RBP4) có mối liên hệ với năng suất sinh sản của nái Trong nước đã có một số tác giả đã áp dụng kỹ thuật PCR trong việc phát hiện sự hiện diện của các gen có liên quan đến sự sinh sản của heo (Lê Thị Thúy và cộng sự, 2002; Nguyễn Ngọc Tuân và cộng sự, 2001; Võ Thị Tuyết và cộng sự, 2005) Công nghệ sinh học đã bắt đầu đi vào giải quyết các vấn đề thực tiễn của nghành chăn nuôi Được sự đồng ý của Ban chủ nhiệm Bộ môn công nghệ sinh học, dưới sự

hướng dẫn của TS Võ Thị Tuyết chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire” 1.2 Mục đích - yêu cầu

Xác định qui trình phản ứng PCR phù hợp nhất

Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu ly trích đƣợc

Xử lý enzyme các mẫu có sự hiện diện của gen PRLR

Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR trên các mẫu

PHẦN 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ lược về giống heo Yorkshire

Đây là giống heo lai giữa giống Large White và giống khác ở vùng Yorkshire của Anh Quốc, nên lấy tên gọi là giống Yorkshire Giống heo này hiện nay được nuôi rộng rãi khắp nơi trên thế giới, và hầu hết các trại giống ở Việt Nam do những ưu điểm thích nghi rộng và năng suất cao Về hình dáng bề ngoài giống Yorkshire có những đặc điểm như thân hình dài, trông dáng vẻ nặng nề, đầu to, trán rộng, bụng gọn Ngực rộng và sâu Hai chân dài chắc khỏe, đùi to Hai tai lớn hình tam giác, dựng đứng, sắc trắng Sáu tháng tuổi đạt 90 – 100 kg, khi trưởng thành nặng khoảng 250 – 300 kg Mỗi năm đẻ từ 1.8 – 2.2 lứa, mỗi lứa khoảng 8 – 9 con, trọng lượng heo con sơ sinh 1.8 kg / con Giống Yorkshire có đặc điểm nuôi con giỏi, là giống đứng đầu trong tổng đàn ngoại nhập ở nước ta

2.2 Prolactin

2.2.1 Nguồn gốc, cấu tạo

Prolactin còn gọi là LTH (Luteo tropic hormone) Ở người và các loài động vật hưu nhủ prolactin được tổng hợp và phân tiết ở tế bào ưa acid của tuyến não thùy Nó

là một polypeptide gồm mười chín cấu tử amino acid và trọng lượng phân tử khoảng

23000 Da

2.2.2 Tác dụng của prolactin

Prolactin có tác động sinh học lên sự phát triển của tuyến vú, sự tiết sữa của người

và thú cái trong thời gian mang thai và nuôi con Trên một số loài động hữu nhũ, prolactin còn tác động đến hoàng thể kích thích sự phân tiết hormone progesterone Prolactin được phân tiết từ các tế bào ưa acid của tuyến não thùy theo máu di chuyển đến cơ quan đích, ở đây xảy ra sự tiếp nhận prolactin Sự tiếp nhận này được quyết định bởi các thụ thể có tại các cơ quan đích Bình thường bất cứ heo mẹ, heo bố hay heo con nào cũng phân tiết được prolactin, nhưng chỉ những cá thể có thụ thể tiếp nhận prolactin (prolactin receptor) thì mới chịu ảnh hưởng của hormone này Sự xuất hiện của thụ thể prolactin chịu kiểm soát chủ yếu bởi yếu tố di truyền (prolactin receptor gene)

2.2.3 Cơ chế tác động của prolactin

Prolactin khi đến tế bào mục tiêu sẽ kết hợp với các protein chuyên biệt (receptor) tạo thành phức hợp hormone – receptor ở màng tế bào, phức hợp này hoạt hóa enzyme adenylcyclase định vị ở màng tế bào xúc tác phản ứng thành lập c.AMP từ ATP c.AMP trực tiếp gây hiệu ứng sinh học trong tế bào chất và trong nhân, như tác động vào đơn vị ức chế trong protein kinase, giúp cho protein kinase hoạt động và xúc tác phản ứng phosphoryl hóa các cấu tử serine trong các protein ở tế bào mục tiêu dẫn đến hoạt hóa enzyme, tăng phân tiết tế bào, tăng vận chuyển cơ chất qua màng và cả hoạt tác gen

Nguồn gốc: Hình scan từ Giáo trình sinh hoá học - Phần I: Sinh hoá học tĩnh, NXB

Đại học quốc gia TP HCM của PGS TS Nguyễn Phước Nhuận

Hình 2.1: Cơ chế tác động của hormone tại tế bào mục tiêu

Hoạt tác gen

Kích hoạt các

enzyme,

hormone

2.2.4 Gen thụ thể prolactin

Cùng với sự phát hiện ra gen thụ thể estrogen, gen halothan Người ta cũng đã phát hiện ra gen thụ thể prolactin Gen này được nghiên cứu như gen dự tuyển trong công tác chọn giống ở các dòng heo: Large White, Landrace, Duroc Theo các nghiên cứu của Vincent (1998), Linville, Drogemuler (2001), Hamann (2001) nếu trên các cá thể heo có sự xuất hiện của gen thụ thể prolactin thì số con trên ổ đẻ nhiều, tỉ lệ sống sót của các heo con cao Đặc biệt, trọng lượng heo con sinh ra vẫn duy trì ở mức bình thường không có chênh lệch đáng kể so với các ổ đẻ có số con ít Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng thấy sự tăng khối lượng trên ngày của các cá thể heo con có sự hiện diện của gen thụ thể prolactin cao hơn các cá thể không có sự hiện diện của gen này Các nghiên cứu về gen thụ thể prolactin chỉ dừng lại ở mức xác định mối tương quan giữa sự hiện diện của gen thụ thể prolactin với sự tăng năng suất sinh sản và tăng trọng của cơ thể heo chứ không xác định rõ cơ chế của gen này lên sự tăng năng suất sinh sản hay tăng trọng cơ thể Có nhiều giả thuyết cho rằng sự xuất hiện của gen này kèm theo xuất hiện của một gen khác kiểm soát các tính trạng về năng suất của heo (Vincent, 1998)

Ở heo gen PRLR được định vị trên nhiễm sắc thể 16 Gen này liên kết khá chặt chẽ với ba marker nằm tại các locus: S0006 (LOD – 10,29), GHR (6,35), S0077 (3,23) Để xác định được tính đa hình của gen PRLR, Vincent và cộng sự đã dùng kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction – restriction fragment length polymorphism) Trước ông dùng kỹ thuật PCR để phân lập một đoạn DNA của gen PRLR, sau đó dùng

enzyme AluI phân cắt đoạn DNA này Với cách này thì ông đã xác định được kích

thước của các băng cắt DNA như sau: 124, 110, 90, 79 và 76 bp Trong đó, băng 110

và 90 bp được xác định là đa hình Những sản phẩm PCR nào có hiện diện băng 90 bp được xác định là alen A, băng 110 bp được xác định là alen B Gen PRLR có tính đa

hình rất cao Ở các dòng heo khác nhau khi xử lý enzyme AluI gen PRLR thì các đoạn

cắt cũng có nhiều kích thước khác nhau Hai alen A và B tạo thành các kiểu gen AA,

AB, BB Trong ba kiểu gen này thì trên các giống heo Large White, Meishan, Landrace kiểu gen AA có năng suất sinh sản cao hơn, kích thước heo con sinh ra đồng đều và số con trên ổ đẻ nhiều hơn kiểu gen AB, BB

Bảng 2.1: Các thông số của gen thụ thể prolactin lấy từ genbank

Sinh vật Người và các động vật hữu nhủ

Tác giả Vincent A.L., Wang L., Tuggle C.K., Robic A., Rothschild M.F Trình tự 1- agcaggagaa cggcgaccgg ccggagaagg ctggcgcccc tgaaaccagc

aaggaatacg cccaggtgtc ccgggtgatg gataaccaca tcctggtgtt agtgcaggat ccgcgagctc gaaacgtggc tccgtttgaa gaaccaacca aggagacccc gccatcccgg ccgcagaatc cagctgcgaa agacctggcc agcttcacca cggccccggg ccactgcaga cacccgctgg gtgggctgga ttacctcgat cccgcaggct ttatgcactc ctttcagtga gagcttggtt catgggatga tgggttacaa ggtggggttt ttttcaggtc gcactacgtg aaatgcactc taccagagaa agctcgaaaa tggggttaga atgacactac ccagactcac agttcactcc tcttcatgct ccattttcaa ccacttgcc- 449 bp

2.3 Giới thiệu về DNA (Deoxyribonucleotide acid)

Acid nucleic là vật chất mang thông tin di truyền của cơ thể sống Acid nucleic được cấu tạo từ các đơn phân (monomer) là các nucleotide Mỗi nucleotide gồm có ba thành phần: nhóm phosphate, đường pentose, và nhóm bazơ hữu cơ Bazơ hữu cơ gồm

có hai nhóm: nhóm bazơ purin và nhóm bazơ pyrimidine Nhóm purin gồm có: adenine (A) và guanine (G) Nhóm pyrimydine gồm có: thymine (T) và cytosine (C) Bốn loại bazơ hữu cơ này kết hợp với nhóm phosphate và đường pentose tạo thành bốn loại nucleotide, người ta viết tắt chúng là A, T, G, C Các nucleotide này nối với nhau thành một chuỗi dài hay mạch DNA

Phân tử DNA có cấu trúc xoắn kép gồm hai mạch đơn, mỗi mạch đơn là một chuỗi nucleotide Hai mạch đơn liên kết với nhau bằng liên kết hidro, liên kết được hình thành giữa các bazơ bổ sung A với T và G với C A liên kết với T bằng hai liên kết hidro, G liên kết với C bằng ba liên kết hidro Mỗi mạch đơn có một đầu OH tự do và một gốc phosphate tự do Người ta qui ước là đầu chứa gốc phosphate tự do là đầu 5’, đầu chứa gốc OH tự do là đầu 3’

Một đặc điểm có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu phân tử DNA đó là khả năng hồi tính và biến tính của DNA:

Sự biến tính là hiện tượng hai mạch DNA tách rời nhau do đứt gãy các liên kết hidro bởi nhiều yếu tố vật lý và hoá học như: nhiệt độ, dung dịch kiềm, formaline, urea…Hiện tượng biến tính do nhiệt độ xảy ra khi nhiệt độ nóng chảy (melting temperature, Tm) của DNA thấp hơn nhiệt độ của môi trường

Tm cao hay thấp tuỳ thuộc vào thành phần của DNA DNA chứa càng nhiều

G, C thì nhiệt độ nóng chảy càng cao do G liên kết với C bằng ba liên kết hidro tương đối bền vững nên cần nhiều nhiệt lượng hơn để phá huỷ liên kết này

Hồi tính là hiện tượng hai mạch đơn DNA sau khi tách rời ban đầu gắn với nhau theo nguyên tác bổ sung hình thành nên phân tử DNA mạch kép Đặc điểm hồi tính và biến tính của DNA là cơ sở để thực hiện phản ứng PCR (polymerase chain reaction)

N

NNH

N

NH2

N

NHNH

NH2

NHO

O

C

H3

Hình 2.2: Cấu trúc của các loại bazơ hữu cơ

Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide như sau:

Hình 2.3: Cấu trúc tổng quát của 4 loại nucleotide

OH O O

OH

O H OH

O

2.3.1 Cơ chế tự nhân đôi của DNA

DNA được xem là vật chất sống vì nó có khả năng tự nhân đôi Đặc điểm

cơ bản của sự tái bản này là sự tái bản theo nguyên tắc bán bảo toàn (semiconservative replication) Khi bắt đầu quá trình sao chép có sự tách rời của chuỗi xoắn kép DNA tạo thành hai mạch đơn Mỗi mạch đơn được dùng làm khuôn để tổng hợp mạch mới Kết quả từ một phân tử DNA ban đầu sẽ tạo ra hai phân tử DNA con giống hệt nhau và giống với DNA mẹ, mỗi phân

tử DNA con được hình thành từ một mạch mới và một mạch cũ

Ở mỗi một lần tái bản, có sự tháo xoắn chuỗi DNA mẹ nhờ enzyme topoisomerase và protein DNA A Trong quá trình sao chép các chuỗi tách rời nhau dưới dạng mạch đơn nhờ enzyme helicase, enzyme này phá vỡ các liên kết hidro giữa các nucleotide Nhiều loại helicase cùng họat động đồng thời, một số gắn lên mạch 3’ – 5’, một số gắn trên mạch 5’ – 3’ Các mạch tách rời sẽ được ổn định dưới dạng mạch đơn nhờ các protein SSB (single strand binding) gắn lên khắp các mạch đơn làm các mạch này không thể gắn lại với nhau Sự tái bản được khởi đầu bằng việc kéo dài một đoạn mồi có bản chất là RNA (ribonucleotide acid) đã bắt cặp sẵn trên mạch khuôn nhờ các DNA polymerase Sự thêm các nucleotide luôn theo hướng 5’– 3’ Tức

là trên hai mạch DNA có một mạch sự tái bản diễn ra theo chiều thuận và mạch còn lại sự tái bản diễn ra theo chiều nghịch Trên mạch khuôn 3’ - 5’

sự tái bản theo chiều 5’- 3’ cùng hướng với chiều tháo xoắn sự tái bản trên mạch này diễn ra một cách liên tục và được gọi là sợi tiến nhanh Trên mạch còn lại sự tái bản diễn ra ngược với chiều tháo xoắn Sự tổng hợp mạch mới

ở đây không diễn ra liên tục mà dưới dạng những đoạn ngắn gọi là những đoạn Okazaki

Sự tái bản bán bảo thủ có vai trò rất quan trọng vì qua đó khi tế bào phân chia có thể truyền sang tế bào con bản sao nguyên vẹn toàn bộ cơ cấu di truyền của nó Trong sự phân bào bình thường thì DNA được nhân đôi khi các nhiễm sắc thể tách rời nhau

Bảng 2.2: Các yếu tố cần thiết cho sự tự nhân đôi của DNA

Mạch đƣợc tổng hợp

từ các đoạn Okazaki

2.3.2 Gen, allen và sự đa hình của gen

2.3.2.1 Gen

Gen là một đoạn DNA có khả năng kiểm soát một chức năng hoặc một tính trạng nào đó của cơ thể sống Đoạn DNA có khả năng sao mã tạo ra mRNA (RNA thông tin) Từ mRNA thông tin này có thể được mã hóa tạo ra protein Protein là đơn vị cấu tạo nên sự sống, mọi thành phần của cơ thể sống hầu hết được cấu tạo từ protein như các men tiêu hóa, các hormone, các thành phần cấu tạo của tế bào… Có nhiều gen không tham gia tổng hợp protein nhưng nó có khả năng ức chế hoạt động của một gen hay một tổ hợp gen khác Những loại gen này rất phổ biến ở động vật và người

Cấu trúc tổng quát của một gen động vật được phân chia thành hai vùng như sau: vùng mã hoá và vùng điều hoà ở đầu 5’(Lê Đức Trình, 2001; Bùi Trang Việt, 2002) Vùng mã hoá bao gồm một chuỗi lần lượt các exon và intron Các exon là các vùng gen mã hoá protein Theo qui ước người ta gọi nucleotide thứ nhất nơi khởi sự sao chép là +1, nucleotide trước đó là -1 Còn các intron là các vùng gen không mã hoá acid amin Hiện nay, người ta vẫn chưa tìm ra rõ chức năng của vùng này trong quá trình biểu hiện gen

Vùng điều hoà gồm các enhancer và promotor Các enhancer là nơi chứa các trình

tự nhận biết chuyên biệt của nhiều yếu tố điều hoà Các promotor bao gồm các trình tự

từ 6 – 8 nucleotide (đôi khi đến 20 nucleotide), nhận biết một cách gián tiếp RNA polymerase, thường nhất là : TATA box (trình tự giàu T và A, ví dụ TATAAA), GC box, CCAAT box

Sự biểu hiện của gen hay sự điều hoà hoạt động của gen

Sự biểu hiện gen ở động vật rất phức tạp Sự biểu hiện này bị tác động bởi các yếu

tố điều hoà có bản chất là protein, steroid, DNA Trên cấu trúc của gen, các enhancer

có các vùng trình tự nhận biết được các yếu tố này và có thể dẫn đến hiện tượng sao chép DNA tạo ra mRNA Nếu xảy ra sự sao chép thì mRNA tạo ra ban đầu sẽ trải qua quá trình trưởng thành Cả exon và intron đều được sao chép thành mRNA, nhưng trước khi rời khỏi nhân, các đoạn tương ứng với intron bị loại đi, các đoạn exon còn lại nối lại với nhau tạo thành mRNA có trình tự liên tục mã hoá acid amin

Sự liên kết giữa gen và marker

Marker là một đoạn DNA liên kết với gen (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2000) Khi phát ra những đoạn DNA mới kiểm soát một chức năng nào đó của cơ thể sống, người ta cố gắng tìm kiếm một sự liên kết giữa marker và gen định vị trên nhiễm sắc thể nào đó Điều này hoàn toàn có thể thực hiện được nhờ công trình có tính lịch sử của Morgan về liên kết gen và khoảng cách di truyền (tính bằng centi Morgan, viết tắt

là cM) Bản đồ di truyền của ruồi giấm được phát hiện rất sớm vào năm 1925 Những tính trạng di truyền chung với nhau được xếp chung vào một nhóm liên kết gen, trên cùng một nhiễm sắc thể Những tính trạng này được xác định trên nhiễm sắc thể tùy mức độ liên kết của nó Sự sắp xếp độc lập của các nhiễm sắc thể giúp cho việc xác định vị trí các locus trong các nhóm liên kết gen Sự xuất hiện của hiện tượng quấn chéo (crossing over) trong gián phân giảm nhiễm giúp cho việc xác định thứ tự các locus trong nhiễm sắc thể Khoảng cách di truyền được đo bằng tần suất tái tổ hợp gen Gen thể hiện bản chất di truyền sẽ liên kết với một tính trạng hình thái nào đó, mà người ta có thể đo đếm được – gen đó có thể xem là marker gen

Việc lập bản đồ gen và việc chọn lọc marker hình thái như vậy tốn rất nhiều thời gian, thậm chí hàng chục năm trời Số lượng marker thu được theo kiểu chọn lọc này rất ít và chỉ có ở qui mô hình thái Do vậy người ta đã sử dụng marker isozyme đã làm cho vấn đề thay đổi theo chiều hướng tốt hơn, nhưng số lượng marker thu được cũng rất ít không thỏa mãn cho nhu cầu nghiên cứu Trong tình hình này thì DNA marker được đề xuất (Tankley và ctv, 1980) Về căn bản thì bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể xem như một DNA marker Nhưng nó phải đảm bảo về tính ổn định, sự xuất hiện của nó phải luôn luôn có sự xuất hiện của gen quan tâm

2.3.2.2 Allen và sự đa hình của gen

Gregor Mendel (1856) định nghĩa allen như sau: “ Allen là các dạng khác nhau của một gen cùng qui định một tính trạng”, các đối tượng được ông khảo sát ở đây là đậu Hòa Lan Từ năm 1925 trở đi, sau khi Morgan thành công trong việc lập bản đồ di truyền của ruồi giấm, các khái niệm về nhiễm sắc thể, khoảng cách di truyền

và locus được hình thành thì allen được định nghĩa lại như sau: “ Allen là

các dạng khác nhau của cùng một gen định vị trên một locus của cùng một nhiễm sắc thể cùng qui định một tính trạng nào đó ở cơ thể sinh vật”

Allen là cơ sở để xác định tính đa hình của gen Gen có càng nhiều allen thì tính đa hình càng cao Mỗi allen được hình thành từ sự đột biến đoạn mã

di truyền của gen gốc do các yếu tố môi trường sống, các tác nhân vật lý, hóa học hay các sai sót trong quá trình sao chép Các đột biến này nếu tạo thuận lợi cho sự sống sót, sinh sản của cá thể sẽ được duy trì và lan truyền trong quần thể Như vậy, gen là đơn vị có tính chất đột biến ( Bùi Chí Bữu

và Nguyễn Thị Lang, 1999) Trong tự nhiên hai cá thể cùng một loài mang cùng một gen chưa hẳn là có đoạn trình tự chuỗi mã di truyền của gen giống nhau, giữa những cá thể khác nhau thì luôn xuất hiện đột biến khác nhau nhưng hiếm khi biểu hiện thành các đặc điểm hình thái Tính đa hình của gen trong trường hợp này chỉ được xác định bằng các phương pháp phân tích

ở mức phân tử

2.3.3 Phương pháp chiết tách DNA từ mô động vật

DNA được chiết tách từ mô và các cơ quan của động thực vật Ở động vật DNA được chiết tách từ da, cơ vân, mô mỡ và từ máu

Qui trình này cơ bản gồm 3 bước:

Bước 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân Tiến hành nghiền mô, tế bào trong dung dịch SDS (sodium dodecyl sulphate) và proteinase (proteinase K) Hỗn hợp sẽ phá hủy màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trường, đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA

Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong dung dịch chứa DNA bằng hổn hợp dung dịch phenol và chloroform kết hợp với phương pháp ly tâm

Bước 3: Tủa dung dịch acid nucleic, thu nhận acid nucleic dạng cô đặc trong ethanol hoặc isopropanol

2.3.4 Phương pháp định tính và định lượng cho DNA

2.3.4.1 Định lượng bằng phương pháp đo OD (optical density)

Phương pháp này không thật chính xác, chỉ ước lượng tương đối nồng độ acid nucleic có trong mẫu Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hấp phụ ánh sáng tử ngoại có bước sóng λ = 260 nm

Một đơn vị OD tương ứng với nồng độ là:

- 50 μg / ml cho một dung dịch sợi đôi

- 40 μg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn

Ví dụ: một OD260 nm= 0,9 sẽ tương ứng với:

- Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi bằng 0,9*50 = 4,5 μg

- Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA bằng 0,9*40 = 3,6 μg

Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với dung dịch có độ tinh sạch cao Để kiểm tra

độ tinh sạch của DNA thu được người ta đo thêm giá trị OD 280 nm, ở bước sóng này protein có mức hấp thụ cao nhất Nhưng các protein cũng hấp thụ ở bước sóng 260

nm, do đó làm sai giá trị thật của acid nucleic có trong mẫu Một dung dịch acid nucleid được xem là sạch nếu có tỉ số OD260 nm / OD280 nm nằm trong khoảng 1,8 – 2 Nồng độ DNA trong mẫu được tính bằng công thức sau:

Nồng độ (ng / μl) = OD260 nm*62,9 - OD280 nm*36

2.3.4.2 Định tính DNA bằng phương pháp điện di

Phương pháp điện di là phương pháp cho phép xác định kích thước của các đoạn DNA DNA được cho vào một bản gel agarose và đặt trong điện trường Do DNA tích điện âm nên trong môi trường điện trường nó sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương Agarose là một trong các dạng của polysacharide Agarose sẽ tạo thành hạt agarose sau khi tan (melting) ở nhiệt độ cao, hoặc đun sôi vài phút Khi nguội lại những hạt agarose sẽ kết tụ lại với nhau (gelling) Giữa những hạt như vật có những lỗ rất nhỏ Tùy theo nồng độ của gel mà kích thước của các lỗ nhỏ này khác nhau Nồng độ gel càng cao thì kích thước của các lỗ càng nhỏ và ngược lại Khi DNA đi qua các lỗ nhỏ này sự cọ sát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tạo lực trở kháng làm ngăn cản sự dịch chuyển này DNA có kích thước càng lớn thì lực trở kháng càng mạnh do đó sự di chuyển càng chậm và ngược lại Các DNA cùng kích thước sẽ di chuyển về cùng vị trí

và tạo thành các băng, các băng này có thể quan sát được sau khi nhuộm chúng trong dung dịch ethium bromide và đặt dưới tia tử ngoại

2.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)

2.4.1 Giới thiệu về phản ứng PCR

Là phản ứng nhân nhanh số lượng mẫu DNA nhờ thực hiện cơ chế tự nhân đôi DNA invitro Quá trình này được tiến hành nhờ enzyme DNA polymerase

Nguyên tắc phản ứng PCR Phản ứng PCR gồm các bước chủ yếu sau:

Bước 1: Biến tính mẫu DNA thành chuỗi đơn ở nhiệt độ 94 - 95oC

Bước 2: Giai đoạn bắt cặp giữa primer và mạch khuôn, nhiệt độ bắt cặp tùy thuộc vào trình tự của primer, thông thường khoảng 40 – 50oC

Bước 3: Giai đoạn kéo dài tổng hợp bản sao DNA được tiến hành ở 72oC

Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên được lập lại nhiều lần

Hình 2.5: Các chu kỳ của phản ứng PCR 2.4.2 Các yếu tố tham gia vào phản ứng PCR

2.4.2.1 Taq polymerase

Taq polymerase là enzyme chính tham gia vào quá trình tổng hợp các

mạch DNA Enzyme này còn có khả năng phân hủy primer bắt cặp vào mạch

DNA tạo điều kiện cho việc bổ sung các nucleotide vào mạch DNA mới Taq polymerase được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus

45-56 o C

Enzyme này có tính chịu nhiệt rất cao, nó chịu được nhiệt độ biến tính DNA khoảng 94o C Nhiệt độ tối ưu cho sự hoạt động của Taq polymerase khoảng

70 – 72o C Trong phản ứng PCR nếu nồng độ enzyme này quá thấp không

đủ lượng enzyme xúc tác cho phản ứng sẽ tạo ra sản phẩm PCR không mong muốn

2.4.2.2 Các nucleotid

dNTP – deoxyribonucleotide-5-triphosphate Đây là hổn hợp 4 loại nucleotide dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp mạch DNA mới Nồng độ nucleotide trong phản ứng PCR mất cân bằng

sẽ làm cho phát sinh các lỗi sao chép của Taq polymerase

2.4.2.3 Primer (mồi)

Primer (mồi) là những đoạn oligoribonucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung với trình tự của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA Chiều dài của mồi thường từ 10 – 35 nucleotide Mồi khởi đầu cho

quá trình tổng hợp mạch mới Khi mồi bắt cặp vào mạch khuôn thì Taq

polymeresa bắt đầu kéo dài chuỗi DNA

2.4.2.4 Dung dịch đệm

Thành phần quan trọng nhất trong dung dịch đệm là ion Mg2 + Nó rất cần

thiết cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase,

làm tăng nhiệt độ nóng chảy của các DNA mạch kép Nồng độ MgCl2 tối ưu

là 1.5 mM

Môi trường đệm KCl đã và đang áp dụng rộng rãi, cũng có thể là chất đệm hữu dụng cho phản ứng PCR Tuy nhiên trong nhiều trường hợp môi trường này không hiệu quả nên người ta vẫn lựa chọn sử dụng Mg2 +

Những đoạn DNA giàu G, C người ta thường dùng dung dịch đệm amonium sulphate làm giảm những sản phẩm được phát triển một cách không hoàn

toàn trong PCR với Taq Phương pháp này dùng phát hiện những đoạn gen

có kích thước nhỏ chạy trên gel acrylamide

2.4.2.5 DNA khuôn

Phản ứng PCR tối ưu trên DNA thật tinh sạch Tuy nhiên có nhiều nghiên cứu cho thấy PCR vẫn tốt trên DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào, các vết máu, mẫu khảo cổ, vi khuẩn bị hấp khử trùng…Lượng DNA khuôn mẫu sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 µg xuống khoảng 20 ng nhằm giảm việc tạo các sản phẩm phụ không mong muốn

2.4.2.6 Số chu kỳ phản ứng

Số lượng chu kỳ phản ứng PCR trong thực tế không vượt qua 40 chu kỳ Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc vào số lượng DNA mẫu ban đầu Nếu ít chu kỳ thì sản phẩm PCR thu được ít Nếu kéo dài tiến trình PCR thì hiệu quả khuyếch đại giảm hẳn do: sự cạn kiệt các thành phần phản ứng, sự mỏi mệt của các enzyme dùng trong phản ứng

2.4.2.7 Nhiệt độ và pH

Những enzyme được sử dụng rất mẫn cảm với nhiệt độ Sự thay đổi nhiệt độ có ảnh hưởng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt của sản phẩm PCR Để biến tính thì khoảng nhiệt độ từ 94 – 95o

C là thích hợp nhất, nếu nhiệt độ cao hơn sẽ làm mất hoạt

lực của Taq polymerase Để kéo dài chuỗi người ta sử dụng 72o C, đây là nhiệt độ tối

ưu cho Taq polymerase hoạt động Khoảng nhiệt độ dùng để bắt cặp là khó xác định

nhất, khoảng nhiệt độ này được xác định tùy từng loại primer Primer có trình tự càng nhiều G, C thì nhiệt độ bắt cặp càng cao Thông thường nhiệt độ bắt cặp từ 50 – 56o C Hầu hết các enzyme, mẫu DNA được đệm trong môi trường tối ưu có pH = 8 Ở

pH này DNA rất ổn định Trong môi trường acid các bazơ purin rất dể bị tách khỏi sợi DNA, cầu nối phosphodiester bị phá vỡ Tuy nhiên theo chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR thì pH có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8

2.4.2.8 Các vấn đề thường gặp trong PCR và phương pháp khắc phục

Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR chúng ta thường gặp những hiện tượng không mong muốn như: không có hiện diện sản phẩm PCR, sản phẩm PCR ít, xuất hiện các băng phụ Dưới đây là bảng trình bày các hiện tượng không mong muốn xảy

ra khi thực hiện phản ứng PCR và cách khắc phục nó

Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 mM, nhƣng giữ nguyên nồng độ dNTP

Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn

Giảm lƣợng tap polymerase

2 Có nhiều sản phẩm chuỗi dài

không đặc trƣng

Giảm thời gian ủ bắt cặp Gia tăng nhiệt độ ủ bắt cặp Giảm thời gian kéo dài Giảm nhiệt độ kéo dài xuống còn 62 – 68o C Gia tăng nồng độ KCl buffer lên 1,2 – 2 X, vẫn giữ nồng độ MgCl2 ở mức 1,5 – 2 mM

Gia tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,5 nM, nhƣng vẫn giữ nguyên nồng độ dNTP

Giảm lƣợng mồi Giảm lƣợng DNA khuôn

Giảm lƣợng Taq polymerase

3 Không có sản phẩm nào cả Đảm bảo rằng các thành phần PCR đã cho vào

phản ứng Đổi dung dịch dNTP do dNTP rất nhạy cảm với việc cấp rã đông

Gia tăng hàm lượng mồi Gia tăng hàm lượng DNA khuôn mẫu Giảm nhiệt độ bắt cặp xuống 6 – 10o C

Y khoa: dùng chẩn đoán bệnh do các tác nhân là vi khuẩn hoặc virus

Nông nghiệp: dùng trong chọn giống và xác định các yếu tố gây bệnh trên cây trồng Dùng chuẩn đoán bệnh trong công tác chăn nuôi, chọn giống Dùng phát hiện ra các gen dự tuyển về năng suất sinh sản trong chăn nuôi heo như việc xác định gen thụ thể estrogen, gen halothan, gen thụ thể prolactin

Thực phẩm: Xác định các tác nhân gây bệnh do vi khuẩn vius có trong mẫu thực phẩm Dùng chứng nhận sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên hay là sản phẩm chuyển gen…

2.5 Giới thiệu về kỹ thuật RFLP và kỹ thuật PCR – RFLP

2.5.1 Kỹ thuật RFLP ( restriction fragment length polymorphism)

Đây là phương pháp so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt mẫu bằng một enzyme giới hạn (restriction endonuclease) nhằm tìm hiểu xem có hay không đột

biến điểm (làm mất hay xuất hiện một vị trí giới hạn mới) hoặc có hay không sự thay đổi một trình tự DNA

Trường hợp trình tự DNA của hai cá thể cùng loài hoàn toàn giống nhau về số lượng và kích thước thì sẽ có sự giống nhau về các băng DNA Ngược lại, nếu có xuất hiện đột biến điểm hoặc thay đổi một trình tự đoạn DNA trên sợi DNA thì sẽ có sự khác nhau về các băng DNA

Các bước để tiến hành kỹ thuật RFLP:

Tiến hành phân lập DNA của sinh vật muốn kiểm tra sự đa hình của DNA Xác định enzyme cắt phù hợp nhất với genome của sinh vật kiểm tra

Tiến hành phân cắt mẫu DNA thu được với enzyme cắt

Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose hoặc polyarylamid

Tiến hành lai Southern blot với mẫu dò thích hợp

Xác định kích thước của các đoạn đa hình trên phim sau khi thực hiện Southern blot và đưa ra kết luận

Quá trình phân tích RFLP trên nhiễm sắc thể gặp rất nhiều khó khăn Việc xử lý enzyme giới hạn của DNA này sẽ tạo ra hàng triệu mảnh DNA có kích thước rất khó phân biệt Nếu chạy điện di trên gel agarose và nhuộm bằng ethium bromide thì không

dễ gì phát hiện ra được sự khác biệt giữa chúng Kết quả ta nhận được hình ảnh là một dải liên tục gồm nhiều vệt đậm Do đó việc thiết kế probe (mẫu dò) để xác định sự đa hình trong kỹ thuật Southern blot là vô cùng quan trọng

2.5.2 Kỹ thuật PCR – RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism)

Nhằm khắc phục hiện tượng tạo ra quá nhiều băng DNA khi phân cắt genome bằng một enzyme giới hạn và phải thiết kế probe thích hợp trong việc phân tích sự đa hình DNA của kỹ thuật RFLP người ta đưa ra kỹ thuật PCR – RFLP PCR – RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuyếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR trước Sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA này bằng một enzyme thích hợp Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di và nhuộm ethium bromide cho ta biết được sự

đa hình của đoạn DNA Như vậy quá trình thực hiện kỹ thuật PCR – RFLP gồm các giai đoạn sau:

Tiến hành phản ứng PCR với cặp primer thích hợp để phân lập đoạn DNA cần phân tích sự đa hình

Tiến hành phân cắt đoạn DNA này với một enzyme cắt thích hợp Chạy điện di xác định sự khác nhau của các băng DNA và đưa ra kết luận

2.6 Các enzyme giới hạn

Các enzyme giới hạn được khám phá cuối năm 1960, có khả năng cắt DNA ở những vị trí rất là chính xác, nó đóng vai trò rất quan trọng trong phân tích gen Người ta phân ra làm ba loại enzyme:

Loại 1: Khi enzyme nhận biết được trình tự , nó sẽ di chuyển một đoạn

khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng khoảng vài chục nucleotide

Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự ngay tại vị trí đó

Loại 3: Enzyme nhận biết trình tự cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20

nucleotide

Loại 2 là nhóm duy nhất được sử dụng trong công nghệ sinh học phân tử Mỗi enzyme nhận biết một trình tự cắt từ 4 – 6 nucleotide Có hai kiểu cắt chính của enzyme là cắt theo đầu dính và cắt theo đầu bằng:

PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT 3.1 Thời gian, địa điểm

3.2 Đối tượng khảo sát

Gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire ở trại giống

3.3 Nội dung thực hiện

Chọn quy trình ly trích DNA thích hợp từ mẫu máu, da tai

Thực hiện phản ứng PCR trên các mẫu được lấy từ trại giống

Phân tích kiểu gen của các heo giống

Xác định tần số xuất hiện của kiểu gen thụ thể prolactin

3.4 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Vật liệu, dụng cụ, máy móc và thiết bị làm thí nghiệm

Mỗi con heo thì lấy đồng thời mẫu máu và mẫu da tai

Cách thu thập và bảo quản mẫu

Mẫu máu: lấy khoảng 1-1.5 ml máu ở mỗi cá thể heo Máu đƣợc cho vô ống nghiệm vô trùng chứa sẵn 4mg Na2ETDA

Mẫu da: lấy khoảng 20 g mẫu da tai cho vào túi vô trùng

Tất cả các loại mẫu lấy đƣợc mang về Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh bảo quản Mẫu da đƣợc bảo quản ở - 70o C, mẫu máu đƣợc bảo quản ở - 20o

C khi nào dùng thì tiến hành rã đông và phân tích

3.4.2.2 Ly trích DNA

Ly trích DNA từ mẫu máu (dựa theo qui trình ly trích DNA từ máu của Roe và ctv, 1998)

1 Rã đông hoàn toàn mẫu máu, hút 500 l máu vào eppendorf 1.5 ml sau đó thêm

400 l TE 1X, trộn đều, ly tâm 12000 vòng / phút trong 1 phút ở 10o C, lấy cặn

2 Cho vào 500 l TE 1X, vortex cho tan cặn, ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút, ở

10oC, lấy cặn

Lặp lại bước này cho đến khi phần cặn trở nên trắng

3 Cho vào 200 l natri acetate 0.2 M, vortex trong 10 giây; sau đó thêm 15 µl SDS

10 %; 3 µl proteinase K (20 mg / ml), ủ hỗn hợp gần 1 giờ trong tủ ấm ở 55o C

4 Cho vào 60 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ,

ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C

5 Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào tube 1.5 ml mới, sau đó cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ - 20o C trong 2 giờ

6 Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, bỏ phần nổi lấy phần cặn, làm ráo

7 Cho vào 100 l TE 1X, vortex, ủ 55o C trong 15 phút

8 Cho vào 10 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 250 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20o C trong 15 phút Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở

10oC, bỏ phần nổi, lấy phần cặn

9 Rửa cặn bằng 500 l ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn

10 Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55o C

11 Hòa tan cặn bằng 100 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn

Sản phẩm sau khi ly trích được trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay

Ly trích DNA từ da (dựa theo quy trình của Saner và ctv, 2000 được

Lê Thị Thu Phương (2004) điều chỉnh)

1 Cho khoảng 5 mm3 da vào eppendorf 1.5 ml Dùng chày nghiền nhuyễn mẫu

2 Cho 60 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl, 20mM NaCl, 1mM EDTA và 1% SDS,

pH = 8) và 3 l proteinase K (20 mg / ml) Ủ hổn hợp ở 55oC trong 1 giờ

3 Cho vào 375 l natri acetate 0,2 M, vortex trong 10 giây

4 Cho vào 200 l hổn hợp phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), vortex nhẹ, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C

5 Lấy phần nước nổi bên trên chuyển vào tube 1,5 ml mới, sau đó cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều, ủ ở - 20oC trong 2 giờ

6 Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn, làm ráo

7 Cho vào 180 l TE 1X, vortex, ủ ở 55oC trong 15 phút

8 Cho vào 20 l natri acetate 2 M, trộn đều, tiếp tục cho vào 500 l ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều , ủ ở - 20o C trong 15 phút Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, bỏ phần nổi, lấy phần cặn

9 Rửa cặn bằng 1ml ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10o C, lấy cặn

10 Làm khô cặn trong tủ ấm 55o

C

11 Hòa tan cặn bằng 200 l TE 1X, ủ 55o C qua đêm, vortex cho tan cặn

Sản phẩm sau khi ly trích được trữ ở - 20o C hoặc sử dụng ngay

Phản ứng PCR được thực hiện bởi máy luân nhiệt (Thermal cycler version 2.11.32) trên mẫu máu và mẫu da sau khi ly trích với cặp primer:

Forward primer: 5’-CCC AAA ACA GCA GGA GAA CG- 3’

Reverse primer: 5’-GGC AAG TGG TTG AAA ATG GA- 3’

Hai primer F và R có nhiệt độ bắt cặp khác nhau chênh lệch nhau khoảng

4oC Vincent (1998) đã đưa ra khoảng nhiệt độ trung bình giữa hai nhiệt độ này

để thực hiện phản ứng PCR Với các điều kiện máy móc thiết bị ở phòng thí nghiệm của nước ta khác với điều kiện tại nơi Vincent tiến hành nên chúng tôi tiến hành 2 qui trình phản ứng PCR theo hai nhiệt độ bắt cặp khác nhau (Bảng

đại học Nông Lâm TP HCM

o Xác định nồng độ primer tham gia phản ứng PCR

Một trong những khái niệm quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tối hảo giữa primer và DNA mẫu Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer – dimer sẽ xuất hiện, tương tự như trường hợp DNA mẫu quá ít Do đó việc xác định tỉ lệ giữa nồng độ primer và DNA mẫu trong phản ứng PCR là vô cùng quan trọng Để xác định nồng độ thích hợp của primer trong phản ứng PCR phát hiện gen PRLR chúng tôi tiến hành thực hiện ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau ở (bảng 3.2)

Bảng 3.2: Nồng độ cuối của 3 qui trình thực hiện phản ứng PCR theo qui trình nhiệt 2

Xác nồng độ các hoá chất cắt enzyme giới hạn AluI

Thể tích của các chất tham gia trong việc xử lý enzyme giới hạn được trình bày như bảng 3.3 sau: