tiểu luận đại học bách khoa Các hướng nghiên cứu và một số thành tựu trong lĩnh vực tạo thực vật chuyển gen

Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thuđược giống mới nhanh hơnvà vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giốngtruyền thống.. Các nghiên cứu vềchuyển gen trên đ

MỤC LỤC

Lời Mở Đầu 3

Chương I: Giới Thiệu 5

Chương II: Các phương pháp chuyển gen 10

I DEAE-dextran 10

II Chuyển gen qua liposome 11

III Chuyển gen bằng súng bắn gen 14

IV.Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 17

Chương III Các hướng nghiên cứu và một số thành tựu trong lĩnh vực tạo thực vật chuyển gen 23

I Cây trồng chuyển gen kháng các nấm gây bệnh 23

II Cây trồng chuyển gen kháng các vi khuẩn gây bệnh 23

III Làm sạch đất ô nhiễm 23

IV Một số thành tựu 24

Kết luận 26

Tài Liệu Tham Khảo 27

Lời Mở Đầu

Trước đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụngphương pháp truyền thống để tổ hợp lại các gen giữa hai cá thể thực vật tạo racon lai mang những tính trạng mong muốn Phương pháp này được thực hiệnbằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sang nhụy hoa của cây khác Tuy nhiên,phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện được giữa các cá thểcùng loài (lai gần), lai giữa những các thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ

do đó không thể tạo ra con lai được

Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưavào một loài cây trồng những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thểsống khác nhau, không chỉ giữa các loài có họ gần nhau mà còn ở những loàirất xa nhau Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật thuđược giống mới nhanh hơnvà vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giốngtruyền thống

Nghiên cứu tạo giống bằng các phương pháp chuyển gen hiện đã thu đượcrất nhiều thành công ở các phòng thí nghiệm trên thế giới Một số nghiên cứu

về chuyển gen đã được triển khai nghiên cứu ở nước ta Tuy nhiên, hầu hết cácnghiên cứu đều tập trung vào một số đối tượng cây thực phẩm hoặc cây côngnghiệp như:lúa, ngô, cà chua, bắp cải, đu đủ, bông vải… Các nghiên cứu vềchuyển gen trên đối tượng hoa cây cảnh

Các phương pháp chuyển gen ở thực vật đã được nghiên cứu từ nhữngnăm cuối 1970 đầu 1980 hiện nay nó đã được sử dụng rộng rãi trong nôngnghiệp đem lại nhiều thành tựu to lớn

Chương I: Giới Thiệu

Kỹ thuật chuyển gen, ghép gen là kỹ thuật đưa một gen lạ (một đoạnDNA, RNA) vào tế bào vật chủ làm cho gen lạ tồn tại ở các plasmid trong tếbào chủ hoặc gắn bộ gen tế bào chủ, tồn tại và tái bản cùng với bộ gen của tếbào chủ Gen lạ trong tế bào chủ hoạt động tổng hợp các protein đặc hiệu, gâybiến đổi các đặc điểm đã có hoặc làm xuất hiện những đặc điểm mới của các cơthế chuyển gen Ngày nay việc ứng dụng các giống cây trồng và cật nuôichuyển gen càng trở nên phổ biến Người ta ước tính hiện nay trên thế giới cókhoảng hơn mộtnửa đậu tương và khoảng một phần ba ngũ cốc được trồng từnhững hạt giống có chuyển gen

Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyểngen gián tiếp

1 Chuyển gen trực tiếp bao gồm các phương pháp sau:

- Kỹ thuật siêu âm

- Kỹ thuật điện xung

- Kỹ thuật PEG

- Kỹ thuật vi tiêm

- Kỹ thuật bắn gen

- Kỹ thuật chuyển gen bằng sốc nhiệt

2 Chuyển gen gián tiếp

- Chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens

- Chuyển gen nhờ virus và phage

Tại sao phải tạo cây chuyển gen?

Theo phương pháp truyền thống, nhà tạo giống tìm cách tổ hợp lại các gengiữa hai cá thể thực vật nhằm tạo ra con lai mang những tính trạng mong muốn.Phương pháp này được thực hiện bằng cách chuyển hạt phấn từ cây này sangnhuỵ hoa của cây khác

Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ có thể thực hiện đượcgiữa các cá thể cùng loài hoặc có họ hàng gần Phải mất nhiều thời gian mớithu được những kết quả mong muốn và thường là những đặc tính quan tâm lạikhông tồn tại trong những loài có họ hàng gần

Kỹ thuật chuyển gen cho phép nhà tạo giống cùng lúc đưa vào một thựcvật những gen mong muốn từ những sinh vật sống khác nhau, không chỉ giữacác loài cây lương thực hay những loài có họ gần

Phương pháp hữu hiệu này cho phép các nhà tạo giống thực vật đưa ragiống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của tạo giống truyền thống

Ai tạo ra cây chuyển gen?

Hầu hết những nghiên cứu về cây chuyển gen đều được tiến hành ở cácnước phát triển, chủ yếu là Bắc Mỹ và Tây âu

Tuy nhiên gần đây nhiều nước đang phát triển cũng đang bắt đầu nhữngnghiên cứu về kỹ thuật di truyền ở các nước phát triển, các công ty Công nghệsinh học đã đi đầu trong việc ứng dụng kỹ thuật chuyển gen vào nông nghiệp.Các Công ty này gồm Aventis, Dow AgroSciences, DuPont/Pioneer, Monsanto

và Syngenta

Thế nào là một cây chuyển gen?

Cây chuyển gen là một thực vật mang một hoặc nhiều gen được đưa vàonhân toạ thay vì thông qua lai tạo

Những gen được tạo đưa vào (gen chuyển) có thể được phân lập từ nhữngloài thực vật có quan hệ họ hàng hoặc từ những loài khác biệt hoàn toàn

Thực vật tạo ra được gọi là “chuyển gen” mặc dù trên thực tế tất cả thựcvật đều được “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại của chúng bởi quá trình thuầnhoá, chọn lọc và lai giống có kiểm soát trong một thời gian dài

Cây chuyển gen được trồng ở đâu?

Năm 1994, giống cà chua Calgene chuyển gen chín chem trở thành câychuyển gen đầu tiên được sản xuất và tiêu thụ ở các nước công nghiệp Từ đó

tới nay đã có thêm một số quốc gia trồng cây chuyển gen làm tăng hơn 20 lầndiện tích cây chuyển gen trên toàn thế giới tăng hơn 47 lần.

Diện tích trồng cây chuyển gen tăng từ 1,7 triệu ha năm 1996 lên 90 triệu

ha trong năm 2005, có 14 nước được coi là có diện tích trồng cây chuyển genthuộc loại lớn (mega-countries) với diện tích trồng từ 50.000 ha trở lên, trong

đó có 10 nước đang phát triển và 4 nước công nghiệp các nước có diện tíchtrồng lớn xếp theo thứ tự từ lớn tới bé là Hoa Kỳ,Achentina, Brazil,Canada, Trung Quốc, Paraguay, Ấn độ, Nam Phi, Urugoay, Ôxtralia, Mexico, Rumani,Philippine và Tây Ban Nha (Theo James, 2005)

Những lợi ích tiềm tàng của cây chuyển gen là gì?

Ở các nước phát triển việc ứng dụng cây chuyển gen đã có những lợi ích

rõ rệt Bao gồm:

Tăng sản lượng

Giảm chi phí sản xuất

Tăng lợi nhuận nông nghiệp

Cải thiện môi trường

Những cây chuyển gen thế hệ thứ nhất đã làm giảm chi phí sản xuất Ngàynay, các nhà khoa học đang hướng dẫn tạo ra những cây chuyển gen thế hệ thứhai có đặc điểm tăng giá trị dinh dưỡng hoặc có những tính trạng thích hợp chocông nghiệp chế biến

Lợi ích của những cây trồng này hướng trực tiếp hơn vào người tiêu dùng.Một số ví dụ như:

Lúa gạo giầu vitamin A và sắt

Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột

Vacxin ăn được ở ngô và khoai tây

Những giống ngô có thể trồng được trong điều kiện nghèo dinh dưỡng

Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ hơn từ đậu nành và cải dầu

Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen là gì?

Bao giờ cũng có những nguy cơ tiềm ẩn trong việc phát triển những kỹthuật mới Bao gồm:

Mối nguy hiểm trong việc vô tình đưa những chất gây dị ứng hoặc làmgiảm dinh dưỡng vào thực phẩm

Khả năng phát tán những gen biến nạp trong cây trồng sang họ hànghoang dại

Sâu bệnh có nguy cơ tăng cường tính kháng với các chất độc tiết ra từcây chuyển gen

Nguy cơ những chất độc này tác động tới sinh vật không phải sinh vậtcần diệt

Cây chuyển gen được tạo ra như thế nào?

Cây chuyển gen được tạo ra thông qua một quá trình được gọi là kỹ thuật

di truyền Các gen quan tâm được chuyển từ cá thể này sang cá thể khác Hiện

có hai phương pháp chính để chuyển một gen vào bộ gen thực vật Phươngpháp thứ nhất cần dùng một dụng cụ có tên là “súng bắn gen” Gen chuyểnđược bao bọc ra ngoài những hạt kim loại vô cùng nhỏ, những hạt này sau đóđược đưa vào tế bào thực vật theo phương pháp lí học Một vài gen có thể bịthải loại và không gắn vào bộ gen của cây được biến nạp Phương pháp thứ hai

là sử dụng một loại vi khuẩn để đưa gen mong muốn vào bộ gen của thực vật

Liệu cây chuyển gen có phù hợp với những quốc gia đang phát triển không?

Trong khi hầu hết những cuộc tranh luận chống vây chuyển gen diễn rachủ yếu tại các quốc gia phát triển ở bắc bán cầu, nam bán cầu vẫn giữ vữngquan điển qngs dụng bất kỳ công nghệ nào làm tăng sản lượng lương thực ởcác quốc gia thường xuyên không đủ lương thực để phân phối và giá lươngthực ảnh hưởng trực tiếp tới thu nhập của đại bộ phận dân chúng thì lợi íchtiềm tàng của cây chuyển gen là không thể phủ nhận được Thực tế là nhữngloại lương thực được tăng cường hàm lượng dinh dưỡng có thể không cần thiết

ở các nước phát triển nhưng lại giữ vai trò thiết yếu trong việc giảm nạn đói ởnhững nước đang phát triển

Mặc dù tiềm năng về cây chuyển gen ở các nước đang phát triển là rất lớn,nhưng họ phải cần được đầu tư Hầu hết các nước đang phát triển không có khảnăng để đánh giá an toàn sinh học của cây chuyển gen một cách khoa học, thiếuchuyên gia kinh tế để đánh giá giá trị, thiếu khả năng điều chỉnh theo địnhhướng triển khai an toàn và hệ thống luật pháp để khuyến khích hoặc trừngphạt những ai phạm luật Rất may mắn là có một số tổ chức đang hoạt độngnhằm tạo những tiềm năng tại chỗ để quản lý thành quả thu được, triển khai vàđánh giá chất lượng cây chuyển gen

Một khi luật pháp và những thể chế điều chỉnh được ban hành thì sẽ cónhững đường lối chính xác để loại bỏ hoàn toàn hoặc hạn chế những nguy cơnày Đó là nghĩa vụ của những nhà cải cách công nghệ (chẳng hạn như nhữngnhà khoa học), các nhà sản xuất và chính phủ nhằm đảm bảo với công chúng về

độ an toàn cũng như ảnh hưởng tốt tới môi trường của những thực phẩm mớinày

Cũng có thể xảy ra một số nguy cơ mà bản thân công nghệ không gây rahoặc không thể ngăn chặn được Chẳng hạn như sự phân cách sâu sắc hơn vềkinh tế giữa các nước phát triển (người sử dụng công nghệ) và các nước đangphát triển (người không sử dụng) Tuy nhiên người ta có thể hạn chế nhữngnguy cơ này bằng cách tăng cường những chuyên gia công nghệ được đào tạophù hợp với nhu cầu của các nước nghèo và bằng cách lập các tiêu chuẩn đểcác nước nghèo có thể đánh giá được công nghệ mới

Chương II:Các phương pháp chuyển gen

Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát minh để đưa gen ở tế bào và

mô động vật và thực vật Kỹ thuật đơn giản nhất là chuyển DNA trần bằng vitiêm (microinjection), xung điện (electroporation), súng bắn gen Các phươngpháp phức tạp và hiệu quả hơn bao gồm sử dụng các phức hợp lipid-DNA(liposome),

vector virus, tế bào gốc phôi, chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn

Agrobacterium, chuyển gen bằng súng bắn gen Tuỳ thuộc vào đối tượng

chuyển gen mà người ta lựa chọn phương pháp chuyển gen phù hợp

I DEAE-dextran

DEAE-dextran là một polycation Ðây là tác nhân hóa học đầu tiên được

sử dụng để chuyển DNA vào tế bào động vật nuôi cấy Trong phương phápnày, DNA ngoại lai được cho vào một trường nuôi cấy với sự có mặt củaDEAE-dextran DEAE-dextran sẽ kết hợp với DNA tích điện âm (Hình 2.1)

Sự dư thừa điện tích dương trong phức hợp DNA-polycation do sự đóng gópcủa polycation, cho phép phức hợp này đi đến kết hợp chặt chẽ hơn với màng

tế bào tích điện âm Sự xâm nhập của phức hợp có thể đạt được nhờ sự nhậpbào (endocytosis)

Sự kết hợp giữa DEAE-dextran và DNA

Phức hợp DNA-calcium phosphat

Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứuchuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều đểchuyển các dòng genome vào tế bào đích Tỉ lệ các tế bào được biến nạp ổnđịnh của kỹ thuật này là tương đương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với

vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một lần Hơn nữa, biến nạp DNAtách chiết từ các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấyđây là phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư.Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản, protocol dễ thựchiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen cóthể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổhợp Tuy nhiên hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp

II Chuyển gen qua liposome

Vào thập niên 1980, liposome nhân tạo đã được sử dụng để đưa DNA vào

tế bào Lipid với toàn bộ lưới tích điện dương ở pH sinh lý là thành phần lipidtổng hợp phổ biến nhất của liposome được phát triển cho chuyển gen (Hình

2.3) Thường thì lipid cation được trộn với một lipid trung tính như L-dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) (Hình 2.4) Phần cation của phân tử lipidkết hợp với DNA tích điện âm và kết quả là chứa đầy DNA trong phức hợpliposome-DNA (Hình 2.5) Ðối với các tế bào nuôi cấy, toàn bộ lưới tích điệndương của phức hợp liposome-DNA nói chung là gây ra hiệu quả chuyển gencao hơn bởi vì nó cho phép phức hợp này kết hợpvới màng tế bào tích điện âmbền hơn Nhờ cơ chế nhập bào, các phức hợp xuất hiện trong endosome và sau

đó đi vào nhân Chưa rõ DNA được phóng thích từ endosome và đi qua màngnhân như thế nào DOPE được xem là một lipid kích thích sự dung hợp và vaitrò của nó là phóng thích các phức hợp này từ endosome cũng như làm cho sựdung hợp của màng tế bào phía ngoài với phức hợp liposome-DNA xảy ra dễdàng Trong phương pháp này, các đại phân tử trước hết được đưa vào trongcác túi phospholipid Các loại túi khác nhau đã được mô tả, nhưng túi một lớpmỏng là thích hợp nhất cho chuyển gen vì chúng có tỉ lệ khoảng trống chứanước ở bên trong tương đối cao đối với mỗi đơn vị lipid và bởi vì chúng có tỉ lệphân phối cao hơn Sự dung hợp của liposome với màng plasma là một sự kiệnhiếm Hiệu quả biến nạp của phương pháp này thấp hơn so với phương pháp vitiêm vào tiền nhân Các nổ lực nghiên cứu đang được tiến hành để tìm ra cácđiều kiện thí nghiệm mà có thể làm tăng sự phóng thích các phân tử đã kếtnang từ con đường ẩm bào

Sơ đồ hoạt động của vector liposome

Lippsome đã đ ược sử dụng để đ ưa protein, lipit và cac phân tử nhỏ vàonhiều loại tế baof nuôi cấytiêm đối với RNA hoặc protein Cũng như thế,chuyển gen qua liposome và sự biểu hiện của gen chuyển là không vượt quađược các phương pháp chuyển gen thông thường (như hệ thống virus), sự biểuhiện gen chuyển thường nhất thời, sự ức chế bởi các thành phần của huyếtthanh có thể xảy ra Bên cạnh đó, kỹ thuật này có nhiều ưu điểm là gen chuyển

sẽ không hợp nhất vào genome chủ, có hiệu quả tốt đối với cả tế bào in vitro và

in vivo, có thể mang được các DNA có kích thước rất lớn, độ tinh khiết cao,

không gây miễn dịch, có thể sử dụng với các tế bào mà biến nạp bằng kỹ thuậtcalcium phosphat không có hiệu quả Ứng dụng trong tương lai của kỹ thuậtnày chủ yếu sẽ là khả năng phân phối thuốc vào các tế bào của cơ thể sống

Hiện nay kỹ thuật này đang được phát triển để cải tiến sự phân phối đặc hiệucủa liposome bằng cách ghép các kháng thể đặc hiệu với bề mặt của liposomeđích

III Chuyển gen bằng súng bắn gen

Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin ditruyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bàothực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ởÐại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell NanofabricationFacility, Newyork, USA Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990.Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọcDNA Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạtbiolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọimột cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinhhọc) và ballistics (sự bắn tung)) Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhaunhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khíhelium để gai tốc các hạt

Súng bắn gen (Hãng Biorad)