luận văn nghiên cứu bệnh do trực khuẩn escherichia coli và clostridium perfringens gây ra ở đà điểu giai đoạn 1 18 tháng tuổi, biện pháp phòng trị

luận văn nghiên cứu bệnh do trực khuẩn escherichia coli và clostridium perfringens gây ra ở đà điểu giai đoạn 1 18 tháng tuổi, biện pháp phòng trị luận văn nghiên cứu bệnh do trực khuẩn escherichia coli và clostridium perfringens gây ra ở đà điểu giai đoạn 1 18 tháng tuổi, biện pháp phòng trị luận văn nghiên cứu bệnh do trực khuẩn escherichia coli và clostridium perfringens gây ra ở đà điểu giai đoạn 1 18 tháng tuổi, biện pháp phòng trị

Bộ giáo dục và đào tạo

Trường đại học nông nghiệp i

-

nguyễn thị liên hương

nghiên cứu bệnh do trực khuẩn Escherichia

điểu giai đoạn 1 - 18 tháng tuổi , biện pháp

phòng trị

Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: thú y

Mã số: 60.62.50

Người hướng dẫn khoa học: TS cù hữu phú

Hà nội - 2006

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đ2 được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đ2 được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Liên Hương

Lời cảm ơn

Tôi xin chân trọng cảm ơn trường ĐHNN I, Khoa Sau đại học, Khoa Chăn nuôi thú y cùng các thầy cô giáo và đặc biệt là các thầy cô trong khoa sau đại học, bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý - Khoa Chăn nuôi thú y đ6 tạo điều kiện cho tôi được tiếp cận với những kiến thức khoa học về nông nghiệp trong 2 năm học ở trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn và kính trọng tới:

Thầy hướng dẫn khoa học - TS Cù Hữu Phú - Trưởng bộ môn vi trùng - Viện thú y quốc gia đ6 tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

TS Phùng Đức Tiến - Giám đốc Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương, đ6 tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

PGS TS Trương Quang - Trưởng Khoa Chăn nuôi thú y - ĐHNNI - Hà Nội

TS Nguyễn Bá Hiên - Trưởng bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý - Khoa Chăn nuôi thú y

TS Bạch Mạnh Điều - Nguyên trại trưởng trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì, Hà Tây

ThS Nguyễn Khắc Thịnh - Trại trưởng trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì,

Hà Tây

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong bộ môn vi trùng - Viện thú y quốc gia, Ban giám đốc, bộ môn, phòng thú y, các phòng ban và cán bộ công nhân viên của Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương cùng toàn thể bạn bè đồng nghiệp và gia đình tôi đ6 nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tác giả

2.2 Điều kiện môi trường tại Việt Nam liên quan dịch tễ bệnh ở đà điểu 4

2.4 Một số đặc tính của trực khuẩn E coli và Clostridium perfringens 9

4.2.1 Phân lập vi khuẩn từ thức ăn, nước uống và chuồng nuôi đà điểu 48 4.2.2 ảnh hưởng của mức độ nhiễm vi khuẩn trong thức ăn, nước uống 50 4.3 Triệu chứng và bệnh tích đà điểu mắc bệnh do E.coli và Cl

4.3.1 Triệu chứng đà điểu mắc bệnh do E.coli và Cl perfringens 52 4.3.2 Bệnh tích của đà điểu mắc bệnh do Cl perfringens và E.coli 53 4.4 Nuôi cấy, Phân lập và xác định một số đặc tính sinh hoá của E coli

4.4.3 Kết quả thử phản ứng lên men đường của E.coli và Cl perfringens 61

4.5.1 Xác định độc lực của vi khuẩn E.coli và Cl perfringens 62 4.5.2 Kết quả xác định khả năng dung huyết của vi khuẩn E.coli và Cl

perfringens bằng phản ứng gây dung huyết trên thạch máu cừu 5% 64 4.5.3 Kết quả xác định các yếu tố gây bệnh có trong các chủng vi khuẩn

4.8.2 Trị bệnh E.coli và Cl perfringens cho đà điểu bằng kháng sinh 72

Danh mục các chữ viết tắt

CL perfringens Clostridium perfringens Cs Cộng sự

E coli Escherichia coliETEC Enterotoxigenic E.coli KHKTTY Khoa học kỹ thuật thú y KT Kiểm tra

LT Heat - labile - toxin NXB Nhà xuất bản

PCR Polymeraza Chain Reaction SĐK Sức đề kháng

SLKLTB Số l−ợng khuẩn lạc trung bình SLVK Số l−ợng vi khuẩn

ST Heat - stable - toxin VK Vi khuẩn

Danh mục bảng biểu

Trang Bảng 3.1 Tiêu chuẩn đánh giá độ mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn 42 Bảng 4.1 Tình hình phát triển chăn nuôi đà điểu sinh sản giai đoạn 2002-2005 43 Bảng 4.2 Tình hình mắc bệnh của đà điểu ở từng nhóm nguyên nhân 45 Bảng 4.3 Tình hình mắc bệnh đường tiêu hoá ở đà điểu trong các mùa 46 Bảng 4.4 Kết quả xác định bệnh ở đường tiêu hoá của đà điểu ở một số lứa tuổi 48 Bảng 4 5 Kết quả xác định mức độ nhiễm khuẩn ở các mẫu thức ăn, nước

Bảng 4.6 ảnh hưởng của mức độ nhiễm vi khuẩn trong thức ăn, môi trường

Bảng 4.7 Triệu chứng đà điểu mắc bệnh do Cl perfringens và E coli 53 Bảng 4.8 Bệnh tích của đà điểu mắc bệnh do Cl perfringens và E coli 55

Bảng 4.11 Phản ứng lên men đường của E coli và Cl perfringens 61

Bảng 4.13 Kết quả tiêm E coli và Cl perfringens trên chuột bạch 63 Bảng 4.14 Khả năng dung huyết của vi khuẩn E coli và Cl perfringens 65 Bảng 4.15 Kết quả kiểm tra các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli 66 Bảng 4.16 Mức độ mẫn cảm của E coli và Cl perfringens với một số kháng sinh 68 Bảng 4.17 Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu sau khi sử lý thuốc sát trùng 70 Bảng 4.18 Kết quả phòng bệnh do E coli và Cl perfringens cho đà điểu 71 Bảng 4.19 Tỷ lệ tiêu chảy của đà điểu sau khi phòng bằng kháng sinh 72 Bảng 4 20 Kết quả trị bệnh do E coli và Cl perfringens ở đà điểu bằng kháng sinh 73

Danh mục các sơ đồ, biểu đồ, ảnh

Trang Sơ đồ 3.1 Phân lập và giám định E coli từ phân và bệnh phẩm 33 Sơ đồ 3.2 Phân lập và giám định sơ bộ vi khuẩn Cl perfringens 34

Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ các loại vi khuẩn phân lập được từ đà điểu 57

ảnh 4.8 Khuẩn lạc Cl perfringens phân lập từ đà điểu 58

ảnh 4.10 Phản ứng lên men đường của VK E coli và Cl

ảnh4.11 Phản ứng Litmus milk của VK E coli và Cl perfringens 59

ảnh 4.12 Phản ứng sinh hoá Indol của VK E coli và Cl perfringens 59

1 mở đầu

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Đà điểu là loại chim chạy, lớn và nặng nhất trong các loài chim hiện nay, chúng có khả năng sản xuất cao Thịt đà điểu có hàm lượng dinh dưỡng cao, đặc biệt là hàm lượng cholesterol rất thấp, hàm lượng các axit amin không thay thế cao như lyzin, methionin, threonin, histidin và giàu nguyên tố vi lượng quý như

Zn So với thịt gia súc và gia cầm khác, thịt đà điểu rất tốt cho sức khoẻ của người già và trẻ nhỏ Điều kiện chăn nuôi đà điểu đơn giản, thức ăn thô xanh có thể tận dụng được các nguồn bèo tây, cỏ, rau muống, rau lấp Thức ăn tinh tương tự như của gà nên giá thành cho một đơn vị thức ăn thấp (Phùng Đức Tiến, 2004), (Trần Công Xuân và cs, 2000) [29], [30]

Chăn nuôi đà điểu hiện nay phát triển trên nhiều châu lục: châu Phi, châu

Mỹ, châu Đại Dương và châu á để đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của con người

về thực phẩm và các hàng tiêu dùng từ sản phẩm của đà điểu Hiện nay trên thế giới, các nước ở châu Phi như Nam Phi, Zimbabue đang dẫn đầu về số lượng chăn nuôi đà điểu Các nước gần Việt Nam có Trung Quốc là nước phát triển chăn nuôi đà điểu rất mạnh (Phùng Đức Tiến, 2004) [29]

ở Việt nam, chăn nuôi đà điểu được khởi xướng từ năm 1995, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đ6 giao cho Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương- Viện chăn nuôi đảm nhiệm việc nghiên cứu nuôi thích nghi và chuyển giao con giống cho sản xuất Đà điểu giống được nhập từ Zimbabue, Australia về nuôi tại trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì, Hà Tây Cho đến nay đà điểu đ6 có vai trò trong ngành chăn nuôi, đà điểu giống sản xuất ra được chuyển đến nuôi ở 30 tỉnh thành trong nước và Cộng hoà dân chủ nhân dân Lào

Trong quá trình nuôi đà điểu thích nghi và đưa vào sản xuất tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương và các cơ sở cho thấy ở đà điểu, các bệnh

đường tiêu hoá do vi khuẩn gây ra là rất nguy hiểm Những năm trước đây bệnh chủ yếu thấy ở đà điểu 2,5 - 3,5 tháng tuổi, những năm gần đây đà điểu 17 tháng tuổi vẫn mắc bệnh, gây thiệt hại kinh tế và gây hoang mang cho người chăn nuôi Kết quả nghiên cứu bước đầu xác định bệnh do trực khuẩn Escherichia coli và Clostridium perfringens gây ra là chủ yếu

Để giải quyết vấn đề đó, cần phải có nghiên cứu đầy đủ về nguyên nhân bệnh, dịch tễ và cách phòng trị bệnh do đó chúng tôi triển khai đề tài: "Nghiên cứu bệnh do trực khuẩn Escherichia coli và Clostridium perfringens gây ra ở

đà điểu giai đoạn 1 - 18 tháng tuổi, biện pháp phòng trị”

1.2 Mục tiêu của đề tài

+ Xác định vai trò gây bệnh của trực khuẩn E coli và Cl perfringens

ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi

+ Trên cơ sở những kết quả đạt được xây dựng biện pháp phòng trị bệnh do

E coli và Cl perfringens cho đà điểu từ 1 - 18 tháng tuổi

1.3 ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về ảnh hưởng của mức độ nhiễm vi khuẩn E.coli và Cl perfringens trong thức ăn, nước uống, không khí, nền chuồng nuôi đà điểu đến tình hình mắc bệnh ở đà điểu Từ việc phân lập, đếm số lượng, thử một số phản ứng sinh hoá, thử độc lực, xác định mức độ mẫn cảm của vi khuẩn E.coli và Cl perfringens với một số kháng sinh, thuốc sát trùng đến việc nghiên cứu bệnh E.coli và Cl perfringens về dịch tễ, triệu chứng, bệnh tích và xây dựng biện pháp phòng trị bệnh cho đà điểu không những có ý nghĩa khoa học mà còn phục vụ đắc lực cho ngành chăn nuôi đà điểu của nước ta

2 tổng quan tài liệu

2.1 Đặc điểm của đà điểu (Ostrich)

2.1.1 Nguồn gốc và vị trí phân loại

Đà điểu nuôi ngày nay có nguồn gốc từ đà điểu hoang dại (châu Phi) Loài chim chạy này có mặt trên trái đất từ rất sớm Theo tư liệu khảo cổ học về động vật có xương sống ở Trung Quốc (Dẫn theo Đặng Quang Huy, 2001, Trần Công Xuân và cs, 2000) [13], [30], đà điểu xuất hiện từ trước kỷ nguyên thứ 3, phân bố trên khắp các Đại lục lớn

Nhiều nghiên cứu bắt nguồn từ lục địa châu Phi Mặc dù, trước chúng có mặt ở Nam châu Phi và cả châu á Ngày nay, gia đình đà điểu chỉ còn lại duy nhất một loài, được gọi là đà điểu lạc đà (Struthiocamelus) và được chia ra làm bốn phân loài Theo Smith, 1963 (Dẫn theo Đặng Quang Huy, 2001) [13], thì bốn phân loài được chia ra đó là:

Đà điểu Bắc Phi (Struthiocamelus Linnareuos)

Đà điểu Nam Phi (Struthio australis Gurney)

Đà điểu Đông Phi (Struthio masaicus Neumann)

Đà điểu Somali (Struthio molybdophanes Reichenow)

Do sự lai tạp giữa các phân loài trên đ6 hình thành nên loài thứ năm được công nhận và được gọi là đà điểu nhà (struthiocamelus Domesticus) hiện được nuôi rất rộng r6i ở Nam Phi

Trong hệ thống phân loại động vật, đà điểu châu Phi (Ostrich) thuộc:

Đà điểu là loài chim chạy có tầm vóc lớn, đầu nhỏ, cổ dài và linh hoạt,

mắt to, sáng và tinh nhanh, mỏ dẹp và rộng Đôi chân dài, chắc chắn với cơ quan

tiếp đất gồm hai ngón trên mỗi bàn chân, đặc điểm đó giúp loài chim không biết

bay này nâng được tốc độ cao khi chạy Thân hình quả trứng, xương ức không

nhô ra phía trước như các loài chim khác và đặc biệt của loài chim chạy này là cơ

ức không phát triển, cơ tập trung chủ yếu ở hai đùi

2.1.3 Tập tính của đà điểu

Đà điểu là một loài ăn tạp, có tính bầy đàn cao, rất nhạy cảm và ưa hoạt

động Các hoạt động ăn, uống, ngủ, nghỉ và vận động của chúng diễn ra trong

ngày không liên tục mà đan xen nhau Nhu cầu hoạt động của đà điểu có xu

hướng tăng dần theo tuổi đến khi trưởng thành thì ổn định, do đó trong môi

trường nuôi đà điểu phải có sân chơi phù hợp cho chúng vận động Một tập tính

đặc biệt của đà điểu là chúng ăn phân của chúng thải ra ngoài môi trường, chính

vì vậy khi trong đàn có con mắc bệnh, khả năng lây nhiễm trong đàn là rất cao

2.2 Điều kiện môi trường tại Việt Nam liên quan đến dịch

tễ bệnh ở đà điểu

Đà điểu nhập về nước ta có nguồn gốc từ châu Phi và Australia, nơi có khí

hậu nóng và khô Trong điều kiện khí hậu nóng ẩm, mưa nhiều, có mùa đông

lạnh, mưa phùn gió Bắc ở mùa xuân, đây là khí hậu đặc trưng ở miền Bắc và

miền Trung Việt Nam, đà điểu phải dần thích nghi với môi trường mới của

chúng Vào các thời kỳ khí hậu chưa phù hợp như khi mưa kéo dài, độ ẩm cao, đ6

ảnh hưởng đến sức kháng bệnh của đà điểu, đặc biệt kết hợp chế độ chăm sóc

nuôi dưỡng không hợp lý, tạo điều kiện cho các bệnh phát sinh, ảnh hưởng đến

năng suất và chất lượng con giống

2.3 Một số nghiên cứu về bệnh của đà điểu

2.3.1 Một số nghiên cứu về dịch tễ và bệnh của đà điểu ở nước ngoài

Đà điểu mẫn cảm với nhiều loại bệnh truyền nhiễm khác nhau bao gồm cả

những bệnh của động vật có vú, bệnh nhiễm khuẩn do thức ăn (Cadman et al,

1994), (Christensen, 1997), (Hoberg et al, 1995), (Aarons, 1995), (Tully et al, 2000) [48], [51], [62], [31], [87]

Bệnh truyền nhiễm ở đà điểu gồm các loại bệnh do vi khuẩn, vi nấm, virus

và ký sinh trùng gây ra (Tully et al, 2000) [87]

Các nghiên cứu về đà điểu được ứng dụng trong công tác phòng trị bệnh cho

đà điểu như dùng thảo dược để kháng khuẩn (Johnston et al, 2002) [68], dùng men tiêu hoá cho đà điểu (Matsumoto et al, 2002) [71], hướng dẫn sử dụng thuốc

và điều trị bệnh cho đà điểu (Burroughs, 1992), (Tully et al, 2000), (Vissiennon

Theo Tully et al (2000) [87], vi khuẩn E.coli gây bệnh trên đà điểu

Khi dùng vaccine Newcastle cho đà điểu, kháng thể không đặc hiệu được sinh ra chống lại E.coli (Huang , Matsumoto, 2000) [64]

Viêm ruột non do Clostridium

Clostridium perfringens, C.chauvoei, C.sordellii và C.colinum (Shivaprasad) [83] đều có liên quan đến các bệnh Clostridium ở đà điểu Độc tố

Cl perfringens gây giảm số lượng, tốc độ phát triển của tế bào thận của đà điểu (Bormann et al, 2002) [46] Dùng PCR xác định độc tố β của Cl perfringens type

C (Vahjen et al, 2000), (Uzal et al, 2002) [89], [88] ứng dụng PCR phân tích protein tế bào và màng tế bào để định type Cl perfringens (Yang- Mingfan et al, 2002) [93] Nghiên cứu chuyển gen độc tố β của Cl perfringens type C (Goswami et al, 2002) [60] Người ta đ6 xác định 99,6% Cl perfringens có khả năng bám dính vào lớp mucin của ruột đà điểu, đó là nguy cơ gây bệnh (Matsumoto et al, 2002) [71]

Megabacteriosis

Megabacteriosis là một loại bệnh khá phổ biến ở đà điểu non trong thời kỳ nuôi dưỡng đến 2 tháng tuổi (Tully et al, 2000) [87]

Campylobacteriosis

Campylobacteriosis gây bệnh đ6 xuất hiện ở đà điểu (Tully et al, 2000) [87]

Đây là loại lây nhiễm qua đường miệng, thường do nguồn nước hay cỏ trong trường hợp dùng nước thải để tưới cỏ

2.3.1.2 Bệnh do vi nấm

Nhiễm vi nấm có lẽ nằm trong số những bệnh truyền nhiễm thường gặp nhất

ở đà điểu non Các yếu tố như nhà ấp bị ô nhiễm, điều kiện môi trường, không khí ô nhiễm nặng, chất thải hay thức ăn, stress, suy giảm miễn dịch, và điều trị kháng sinh kéo dài thường là những tiền đề cho các loại bệnh do vi nấm phát triển (Shivaprasad, 1998), (Marks et al 1994), (Katz et al, 1996), (Fitzgerald, Moisan,1995) [83], [70], [69], [55]

Candidiosis là một biến chứng sử dụng kháng sinh kéo dài thường gặp ở đà

điểu, những thay đổi về bệnh thường xảy ra ở miệng và thực quản Bệnh này có thể do ghép với aspergillus, nếu không được phát hiện và điều trị sớm thì nó có thể gây ra tỷ lệ chết cao ở con non nhiễm bệnh (Katz et al,1996) [69]

+ Zygomycosis

Nhiễm nấm Zygomycete hiếm khi xuất hiện ở họ nhà chim (Tully et al, 2000) [87]

2.3.1.3 Bệnh do virus

+ Bệnh Newcastle

Các đợt bùng phát bệnh Newcastle tự nhiên đ6 từng xảy ra ở đà điểu (Alexander, 2000), (Blignaut et al, 2000) [32], [43] Các dòng virus Paramyxovirus serotype 1 (APMV-1) có khả năng lây nhiễm và gây ra các đợt bùng phát Newcastle nguy hiểm ở những đàn đà điểu mẫn cảm Đà điểu nhiễm bệnh này có thể thông qua

đường tiêu hoá và hô hấp

+ Cúm gia cầm

Cúm gia cầm (AI) là 1 bệnh nguy hiểm ở đà điểu

ảnh hưởng của bệnh không những trên cơ sở thiệt hại trực tiếp do bệnh và tỷ

lệ chết gây ra mà còn ảnh hưởng tới việc mua, bán cũng như vận chuyển đà điểu

và sản phẩm của chúng từ nước này sang nước khác

Trong năm 1991 - 1992, các đợt bùng phát AI (H7N1) nặng nề đ6 xảy ra đối với đà điểu ở Nam Phi (Allwright , 1993) [33] Các serotype AI khác như H9N9, H9N2 và H5N2 cũng cho thấy có liên quan đến bùng nổ cúm gia cầm ở đà điểu (Allwright, 1993), ( Mutinelli , 2000) [33], [72]

2.3.1.4 Bệnh nguyên sinh bào

Đà điểu cũng gặp một số bệnh nguyên sinh bào

Các đợt bùng phát Cryptosporidium trong những trang trại chăn nuôi đà

điểu rất khó kiểm soát và tỷ lệ nhiễm bệnh có thể đến 20 - 40% (Allwright and Wessels, 1995) [36]

Đà điểu có mắc các bệnh ký sinh trùng khác như giun, sán…(Tully et al, 2000) [87]

2.3.1.5 Phòng tránh các vấn đề khác

Ngoài bệnh truyền nhiễm, bệnh có thể bắt nguồn từ di truyền, đường dẫn hay liên quan đến công tác quản lý, dinh dưỡng hoặc các tác nhân gây độc (Aarons, 1995), (Allwright, 1995), (Baldassi et al, 2002), ( Barton, Seward, 1993), (Bezuidenhout et al, 1995), (Black, 1994), (Blue-McLendon, 1993), (Bodley M và cs, 1995), (Szolgyenyi, 2000), (Van der Westhuizen, E and Earle, 1993) [31], [37], [38], [39], [41], [42], [44], [45], [86], [91]

2.3.2 Một số nghiên cứu về bệnh đà điểu ở Việt Nam

2.3.2.1 Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh do vi trùng gây ra ở đường tiêu hoá của đà điểu

Các tác giả: Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Bạch Mạnh Điều, Nguyễn

Đức Vực, Nguyễn Thị Liên Hương, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Huy Lịch (Phùng Đức Tiến, 2005) [29] đ6 theo dõi về bệnh ở đà điểu nuôi tại Việt Nam thấy rằng chúng có mắc một số bệnh, tỷ lệ mắc bệnh ở đường tiêu hoá do vi khuẩn là cao nhất

Kết quả điều tra cho thấy năm 2001, đà điểu chết do bệnh chiếm tỷ lệ 36,60% số nghiên cứu Trong đó bệnh liên quan đường tiêu hoá gây thiệt hại nhiều nhất, chiếm tỷ lệ 18,81%

Kết quả phân lập vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm: E.coli chiếm 83,81%; Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium chiếm 4,05%- 4,86%; Salmonella 2,43%; Actinobacilus 1,21%, Pseudomonas cepacia 0,4% Kết qủa thử độc lực cũng cho thấy độc lực của E.coli rất mạnh, đ6 giết chết cả 25 chuột tiêm thí nghiệm sau 48- 96 giờ

Kết quả xác định mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số kháng sinh cho thấy Neomycin, Enronofloxacin có tác dụng tốt với vi khuẩn đường tiêu hoá ở đà

điểu

2.3.2.2 Nghiên cứu phòng bệnh Newcastle cho đà điểu

Đà điểu châu Phi, châu úc, châu Mỹ đều có thể bị mắc bệnh Newcastle Đà

điểu nuôi ở Israen năm 1989 đ6 có nhiều con bị chết do bệnh Newcasstle

(Alexander, 2000), (Blignaut et al, 2000) [32], [43] Các chuyên gia thú y nghiên cứu về đà điểu cho rằng chúng mắc bệnh Newcastle có thể do lây từ gà sang Các chủng virus Newcastle có độc lực cao từ các ổ dịch gà, vương v6i, phân tán trong

tự nhiên, qua các nhân tố trung gian dễ dàng xâm nhập gây bệnh cho đà điểu

Đối với nước ta, phòng bệnh Newcastle cho đà điểu là rất cần thiết nhằm đảm bảo an toàn dịch bệnh trong chăn nuôi gia cầm

Nhưng việc xử dụng vaccine Newcastle cho đà điểu cần được khảo sát để

đưa ra quy trình phòng bệnh thích hợp Các tác giả Bạch Mạnh Điều, Nguyễn Thị Liên Hương, Nguyễn Thị Nga, Nguyễn Huy Lịch (Phùng Đức Tiến, 2004) [29]

đ6 xác định thời điểm và liều lượng thích hợp sử dụng vaccine Lasota và H1

phòng bệnh Newcastle cho đà điểu Thời điểm phòng vaccine Lasota (Medivac

ND Lasota) tốt nhất cho đà điểu con lần thứ nhất vào 7 ngày tuổi, lần thứ hai khi đà

điểu được 21 ngày tuổi Sử dụng liều (1 - 1,5 lần) liều quy định cho gà cho một đà

điểu, kết quả đáp ứng miễn dịch đạt được với hàm lượng kháng thể (3,12log2 ± 0,1log2 đến 3,92 log2 ± 0,2log2)

Vaccine (Medivac ND Emulsion) khi tiêm cho đà điểu nên sử dụng liều lượng như dùng cho gà Tiêm phòng cho đà điểu lần thứ nhất lúc 42 ngày tuổi hàm lượng kháng thể đạt 4,37log2 đến 4,70log2 và tiêm nhắc lại hàng năm ở đà

điểu sinh sản sau khi tiêm vaccine 21 ngày hàm lượng kháng thể đạt 4,72log2 đến 5,38 log2, đảm bảo phòng bệnh Newcastle cho đà điểu

2.4 Một số đặc tính của trực khuẩn Escherichia coli và Clostridium perfringens

2.4.1 Trực khuẩn Escherichia coli (E.coli)

Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc họ Enterobacteriaceae, tộc Escherichae, giống Escherichia, loài Escherichia coli Trong các vi khuẩn đường ruột, loài Escherichia coli là phổ biến nhất Escherichia coli còn có tên là

Bacterium Coli commune, Bacillus coli communis do Theodor Escherich phân lập

được lần đầu tiên năm 1885 từ phân trẻ em (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1978) [4]

Về mặt huyết thanh học, người ta chia các chủng E coli thành nhiều serotype khác nhau Cho đến nay đ6 phát hiện được 279 serotype, trong đó có 250 serotype

có độc lực và có vai trò quan trọng trong một số bệnh của gia súc, gia cầm

+ Đặc tính hình thái

E.coli là trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động được, không hình thành nha bào, giáp mô, bắt màu gram âm, kích thước 2 - 3 x 0,6 àm Trong cơ thể gia súc, gia cầm, vi khuẩn đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn Trong môi trường nuôi cấy lâu ngày có khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8

àm Vi khuẩn E.coli di động nhờ có lông ở xung quanh thân, nhưng khi nuôi cấy trong điều kiện bất lợi sẽ mất lông, không di động Vi khuẩn không sinh nha bào Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để nhuộm có thể thấy giáp mô, còn khi soi tươi sẽ không thấy được (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997) [27] Dưới kính hiển vi

điện tử, người ta còn phát hiện được cấu trúc pili, yếu tố mang kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E.coli

+ Đặc tính nuôi cấy

E.coli là trực khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 5 - 400C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4, nhưng

có thể phát triển được ở pH từ 5,5 - 8 (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997) [27]

Vi khuẩn E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số chủng có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản

- Trên môi trường thạch thường: nuôi cấy trực khuẩn E.coli ở 370C trong

24 giờ, hình thành khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng, không trong suốt, màu tro nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3 mm Nuôi lâu, khuẩn lạc chuyển màu gần như nâu nhạt

và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng nhày (M - Mucous) và dạng nhám (R - Rough)

- Trong môi trường nước thịt: sau khi nuôi cấy 370C trong 24 giờ trực khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối

- Trên môi trường thạch peptone: sau 18 - 24 giờ bồi dưỡng trong tủ ấm

vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn ướt, màu xám, kích thước trung bình, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng bóng

- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 370C hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, kích thước từ 1 - 2 mm, có khi gây dung huyết

- Trên môi trường thạch Mac Conkey: sau khi nuôi cấy 24 giờ, bồi dưỡng

tủ ấm 370C hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

- Trên môi trường Endo: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín,

Không mọc trên các môi trường Malasit và Mulerkauffmann

Bị kiềm chế khi nuôi trong các môi trường Wilson Blair

Đặc tính sinh hoá

+ Đặc tính lên men sinh hơi các loại đường

Nhóm Escherichia gồm những trực khuẩn có khả năng lên men sinh hơi các loại đường glucose, fructose, galactose, lactose, manitol, mannit, levulose,

xylose Lên men không chắc chắn với các loại đường duncitol, saccarose, salixin

Vi khuẩn E.coli lên men sinh hơi nhanh đường lactose, còn vi khuẩn Salmonella spp thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E.coli và Salmonella spp

+ Các phản ứng khác

Sữa: đông sau 24 giờ đến 72 giờ ở 370C

Genlatin: không tan chảy

Trong phân, chất độn chuồng ẩm ướt, thiếu ánh sáng mặt trời vi khuẩn có thể tồn tại trên 2 tháng E.coli có khả năng đề kháng với sự sấy khô và hun khói Những chủng E.coli trong phân có xu hướng đề kháng với nhiệt cao hơn những chủng phân lập được ở môi trường bên ngoài ở môi trường bên ngoài các chủng E.coli gây bệnh có thể tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)[21] Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn E.coli

Cấu trúc kháng nguyên của E.coli rất phức tạp, gồm các loại như sau:

+ Kháng nguyên O (Kháng nguyên thân)

Đây là thành phần chính của vi khuẩn và cũng được coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn, kháng nguyên O được coi như một ngoại độc tố Trong trạng thái chiết suất tinh khiết, nó có bản chất là Lypopolisaccharide, bao gồm 2 nhóm sau:

- Polysaccharide có nhóm hydro nằm ở thành ngoài vi khuẩn, mang tính

đặc trưng cho kháng nguyên từng giống

- Polysaccharide không có nhóm hydro nằm ở phía trong, không mang tính đặc trưng mà chỉ tạo sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang dạng R) Kháng nguyên O có những đặc tính sau: chịu được nhiệt (không bị phá huỷ khi đun nóng ở 1000C/2 giờ), các chất cồn, axit HCl nồng độ 1N chịu được 20 giờ, bị phá huỷ bởi formol 0,5%

Kháng nguyên O rất độc (chỉ cần 1/20 mg đ6 đủ giết chết chuột nhắt trắng sau 24 giờ)

Kháng nguyên O được cấu trúc bởi các phân tử lớn với thành phần các phân

tử gồm:

Protein: làm cho phức hợp có tính kháng nguyên

Polyosit: tạo ra tính đặc hiệu của kháng nguyên

Lipit: kết hợp với Polyosit và là cơ sở của độc tính

Theo Medearis, 1968 (Dẫn theo Nguyễn Thị Nội,1989) [18], khi làm mất dần từng phần tử đường của chuỗi Polysaccharide hoặc thay đổi vị trí của các phần tử này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn Tất cả kháng nguyên O

đều cư trú ở bề mặt do đó nó có liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch Bằng phản ứng ngưng kết, các nhà khoa học đ6 tìm được 250 serotype O (Calderwood

et al, 1996) [49] Kháng nguyên O khi gặp kháng huyết thanh tương ứng sẽ xảy

ra phản ứng ngưng kết gọi là "Hiện tượng ngưng kết O" Ngưng kết kháng nguyên O tạo thành những hạt khô, rất khó tan khi lắc

+ Kháng nguyên H (kháng nguyên lông- Hauch)

Kháng nguyên H được cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn, có bản chất là protein giống như chất myosin của cơ và mang các đặc tính sau:

Bị phá huỷ ở 600C trong 1 giờ

Bị phá huỷ bởi cồn 50% và các enzym phân giải protein

Kháng nguyên H vẫn tồn tại khi xử lý bằng formol 0,5%

Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết, trong đó các vi khuẩn được ngưng kết lại với nhau nhờ lông dính lông Các kháng thể kháng H cố định trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh Kết quả tạo nên những hạt ngưng kết giống như những cục bông nhỏ Các hạt ngưng kết rất dễ tan khi lắc vì lông rất nhỏ và dài dễ đứt Các vi khuẩn di động khi cho tiếp xúc với kháng thể tương ứng sẽ trở thành không di động

Kháng nguyên H bảo vệ vi khuẩn khỏi bị tiêu diệt trong tế bào đại thực bào, giúp vi khuẩn sống lâu hơn trong tế bào đại thực bào

Kháng nguyên H của vi khuẩn E.coli không có độc lực, đồng thời không có vai trò trong đáp ứng miễn dịch nên ít được quan tâm nghiên cứu (Orskov, 1978) [78] + Kháng nguyên K (Kapsular - kháng nguyên bề mặt)

Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên bề mặt, chúng bao quanh tế bào

vi khuẩn và có bản chất hoá học là polysaccharide Vai trò của kháng nguyên K chưa được thống nhất lắm, có người cho rằng nó không có ý nghĩa về độc lực, vì vậy chủng E.coli có kháng nguyên K cũng như chủng không có kháng nguyên K (Orskov, 1978) [78] Cũng có ý kiến khác cho rằng kháng nguyên K có ý nghĩa

về độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể (Evan et al, 1981) [52] Phần lớn các ý kiến cho rằng kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ chính:

Hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O

Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại lai và hiện tượng thực bào, yếu tố phòng vệ của vật chủ

+ Kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ bọc - outermembrane protein - OMP)

Một số vi khuẩn trong quá trình phát triển tiết ra một chất nhày có khả năng tan vào nước ở một mức độ nhất định, những chất này bao xung quanh bên ngoài vách vi khuẩn, giúp vi khuẩn chống lại tác động của môi trường ngoại

cảnh, có thể quan sát được ở trạng thái ướt, dễ bị mất đi khi thay đổi điều kiện phát triển gọi là giáp mô

+ Kháng nguyên Fimbriae (kháng nguyên pili)

Ngoài lông ra, ở nhiều vi khuẩn Gram âm nói chung và vi khuẩn E.coli nói riêng còn có những bộ phận khác hình sợi gọi là pili Pili hay Fimbriae có bản chất là protein bao phủ trên toàn bộ bề mặt tế bào vi khuẩn Dưới kính hiển

vi điện tử, chúng có hình ảnh giống một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn Pili của vi khuẩn đường ruột khác lông ở chỗ nó cứng hơn, không lượn sóng và không liên quan đến chuyển động Trước đây kí hiệu là K, nay đổi là F ( như F4, F5, F41…) Một số kháng nguyên pili chính thường gặp ở các chủng E.coli phân lập từ gia súc ỉa chảy bao gồm F4, F5, F41 và 987p Kháng nguyên bám dính được phân loại bởi phản ứng huyết thanh, thụ thể đặc hiệu hoặc bằng khả năng ngưng kết hồng cầu với các loài động vật khác nhau và bằng phản ứng PCR (Cater et al, 1995) [50]

+ Kháng nguyên F4 (K88)

Trước đây ký hiệu là K88 có khả năng ngưng kết hồng cầu, kháng nguyên F4 được sản sinh ở nhiệt độ 37oC, trong khi ở nhiệt độ 18oC, vi khuẩn không có khả năng tạo kháng nguyên này Thông tin di truyền m6 hoá cho tổng hợp kháng nguyên nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid (Gyles, 1988) [61]

Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển được ở thành ruột non

+ Kháng nguyên F5 (K99)

Giống như F4, F5 có bản chất là một protein thực hiện chức năng gắn tế bào vi khuẩn vào các receptor đặc hiệu trên tế bào biểu mô nhung mao ruột non, vì vậy vi khuẩn chống lại nhu động ruột và đây là giai đoạn cần thiết để vi khuẩn tấn công tế bào vật chủ, rồi sản sinh độc tố Enterotoxin Các nhóm vi khuẩn có kháng nguyên O8,O9,O20,O26,O102,O149 có khả năng sản sinh F5 Vi khuẩn không sản sinh F5 trên một số môi alanine và glucose nồng độ cao (Isaacson, 1983),

(van Verseveld et al, 1985) [65] [90] Các gen m6 hóa cho sự tổng hợp K99 nằm trong ADN của plasmid Plasmid này có khối lượng phân tử là 87,8 KDa (Isaacson et al, 1992) [66]

+ Kháng nguyên F41

Cùng với F5, F41 thường có mặt ở các chủng ETEC phân lập được từ bê nghé, dê, cừu non, lợn con, đặc biệt các vi khuẩn có kháng nguyên O9, O101, O149 Quá trình tổng hợp F41 cũng bị ức chế bởi nhiệt độ thấp và alanine, glucose nồng

độ cao

+ Kháng nguyên F6 (987P)

Giống như F4, F5, kháng nguyên 987p thường có mặt ở các nhóm có kháng nguyên O9, O20, O101, O149 Vật liệu di truyền m6 hoá quá trình tổng hợp kháng nguyên pili F6 cũng nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid của tế bào vi khuẩn F6 nằm trong số các fimbriae phát hiện thường xuyên nhất được sản xuất bởi ETEC ở lợn Fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC nhờ việc gắn kết vi khuẩn với các tế bào biểu mô ruột và cải thiện sự bám dính ở màng nhày để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ (Shin et al, 1994) [82]

+ Kháng nguyên F17

F17 chủ yếu được phát hiện ở chủng E.coli gây tiêu chảy hay nhiễm trùng máu trên bò Một vài nghiên cứu cũng cho thấy sự xuất hiện của F17 ở các chủng E.coli phân lập từ bò tiêu chảy ở Pháp và Bỉ chiếm tới 46% (Bertin et al, 1996), [40] Các chủng E.coli có F17 được phân lập từ các chất chứa trong ruột bò cũng được gọi

là chủng ETEC, khi F41, F5 hoặc cả hai cùng xuất hiện ở trên bề mặt tế bào vi khuẩn F17cũng được tìm thấy ở các chủng E.coli gây tiêu chảy ở lợn (Osek, 1999) [79] + Kháng nguyên F18

Để xác định các đặc tính sinh học điển hình của pilus 2134P và để làm rõ các mối liên hệ với các yếu tố bám dính khác, một kháng thể đơn dòng chống pili

đ6 được dùng để phát hiện Trái lại, dùng kháng thể đa dòng của F107 lại phát

hiện được cả F107 và 2134P pilus Qua các nghiên cứu về DNA, kết quả cho thấy các yếu tố bám dính F107, 2134P và 8813 có mối liên hệ chặt chẽ với nhau có thể trong cùng một loại fimbriae với 2 dòng khác nhau Trung tâm quốc tế nghiên cứu về Escherichia coli và Klebsiella ở Copenhagen đ6 đặt tên F18 cho nhân tố bám dính 8813 (Salajka et al, 1992) [80] Bởi vậy, một loại fimbriae mới

đ6 được đề nghị công nhận là F18ab và F18ac Một nghiên cứu của Nagy et al

(1997) [75] thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học

Gần đây, với mục đích tìm các vị trí trong plasmid của các gen m6 hóa choF18ab và F18ac của ETEC và VTEC ở lợn và để xác định các bản sao của các plasmid F18ab và F18ac này, Fekete et al (2002) [56] thấy rằng không có sự khác nhau giữa plasmid F18ac của ETEC và plasmid F18ab của VTEC ở dạng bản sao

Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy et al, 1992) [83], cũng không tập trung ở lớp màng nhày của ruột ở lợn con mới sinh Điều này ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột Khả năng bám này ở con non nhiều hơn so với con lớn Lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa

được làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor đặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thểgiải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC

và ETEC ở lợn cai sữa (Nagy et al, 1999) [76]

Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn đường ruột nói chung hay vi khuẩn E.coli nói riêng đều bao gồm các yếu tố gây bệnh quan trọng sau:

+ Yếu tố bám dính của vi khuẩn

Khả năng bám dính của vi khuẩn là yếu tố gây bệnh vô cùng quan trọng

để thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh của vi khuẩn đường ruột Đó là một quá trình liên kết vững chắc thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn với bề mặt tế

bào vật chủ Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất hoá học vừa mang tính chất sinh học

Hầu hết các chủng ETEC (Enterotoxigenic E coli) đều có các yếu tố bám dính bao gồm: K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F17, F18, F41, F42 và F165 Fimbriae là sự tập hợp của các đơn vị protein nhỏ, được sắp xếp thành những sợi dây nhỏ gắn vào tế bào và có tính miễn dịch cao (Fairbrother et al, 1992), (Nagy et

al, 1990), [53], [73] Các sợi bám dính và độc tố đường ruột của các chủng ETEC nhìn chung được di truyền bởi plasmid ngoại trừ F41 và F17 (Nagy et al, 1999) [76] + Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn

Yếu tố xâm nhập vi khuẩn đường ruột là một khái niệm để chỉ quá trình vi khuẩn đường ruột qua được hàng rào bảo vệ của lớp mucos trên bề mặt niêm mạc

để xâm nhập vào tế bào biểu mô (Ephitel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này Trong khi đó những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ lớp mucos hoặc khi qua được lớp hàng rào này sẽ bị vây bắt bởi tế bào đại thực bào của tổ chức hạ niêm mạc (Giannella et

al, 1976) [59]

+ Vai trò gây bệnh của các loại kháng nguyên

Theo ý kiến của nhiều tác giả, mặc dù vi khuẩn đường ruột chứa đựng nhiều loại kháng nguyên, trong đó có loại tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ, có loại không tạo miễn dịch phòng vệ cho vật chủ nhưng đều tham gia vào quá trình gây bệnh bằng cách tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào vật chủ Các loại phòng vệ tự nhiên phải kể đến là kháng nguyên O, kháng nguyên K và kháng nguyên F (Garten et al, 1974) [58]

+ Yếu tố dung huyết

Vi khuẩn đường ruột phát triển, sắt được cung cấp cho sự dinh dưỡng phụ thuộc vào chất Siderofor do vi khuẩn sản sinh ra Chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức vật chủ thông qua sự phá vỡ hồng cầu để vi khuẩn sử dụng dạng hợp chất HEM Vì vậy việc sản sinh ra Haemolyzin của vi khuẩn có

thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn Có 4 kiểu dung huyết của E.coli nhưng quan trọng nhất là kiểu α và β Trong đó kiểu β gắn với tế bào vi khuẩn,

được giải phóng vào môi trường nuôi cấy ở pha logarit của chu trình phát triển vi khuẩn và được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn

Theo Smith (1963) [84] các Serotype E.coli gây bệnh cho lợn thường có khả năng sản sinh Haemolyzin, chủ yếu các Serotype kháng nguyên O như:

O8,O138,O141,O147

+ Yếu tố kháng khuẩn Colicin V của vi khuẩn E.coli (Colv)

Trong quá trình phát triển và cư trú ở đường ruột, vi khuẩn E.coli phát triển và tồn tại cộng sinh với nhiều loại vi khuẩn đường ruột khác: Salmonella, Staphylococcus, Proteus, họ Clostridium, Vibriocholerae Để tạo thuận lợi cho quá trình phát triển của mình trở thành vi khuẩn chiếm ưu thế trong đường ruột,

vi khuẩn E.coli thường sản sinh ra một loại chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác gọi là Colv Vì vậy yếu tố này cũng được coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn E.coli gây bệnh (Smith et al,1967) [85]

Khả năng sản sinh Colv của E.coli được di truyền bằng Plasmid Colv Plasmid đ6 được tìm thấy không chỉ ở vi khuẩn E.coli gây bệnh mà còn tìm thấy

ở các loại vi khuẩn đường ruột gây bệnh khác

+ Độc tố

Vi khuẩn E coli tạo ra hai loại độc tố: ngoại độc tố và nội độc tố

- Ngoại độc tố

Là một chất không chịu được nhiệt, dễ bị phá huỷ ở 560C trong vòng 10

-30 phút Dưới tác dụng của formol và nhiệt độ, ngoại độc tố chuyển thành giải

độc tố Ngoại độc tố có tính hướng thần kinh và gây hoại tử Hiện nay việc chiết xuất ngoại độc tố chưa thành công mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập được (Đào Trọng Đạt và cộng sự, 1996) [5]

- Nội độc tố: là yếu tố chủ yếu của trực khuẩn đường ruột Chúng có trong

tế bào vi khuẩn và gắn với tế bào vi khuẩn rất chặt Nội độc tố có thể chiết xuất

bằng nhiều phương pháp: phá vỡ vỏ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng axit Trichoaxetic, Phenol dưới tác dụng của enzym Nội độc tố có cấu trúc polysaccharide thuộc về kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các chủng của mỗi serotype

Vi khuẩn E.coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra

- Nhóm độc tố đường ruột (Enterotoxin):

Độc tố chịu nhiệt (ST = Heat-stable-toxin): chịu được nhiệt độ 1000C trong vòng 15 phút xử lý Độc tố ST chia thành 2 nhóm STa và STb dựa trên tính hoà tan trong methanol và hoạt tính sinh học (Robichaud và cs, 1978, Dẫn theo Nguyễn Thị Nội,1989) [18] Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây ỉa chảy do các chủng E.coli gây bệnh ở trẻ sơ sinh, bê nghé, dê, cừu và lợn con

Độc tố không chịu nhiệt ( LT = Heat - labile - toxin ): độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 600C trong vòng 15 phút (Guerant và cs, 1985 - Dẫn theo Nguyễn Thị Nội,1989) [18] Độc tố LT có trọng lượng phân tử cao, nó gồm 5 nhóm B có khả năng bám dính lên mặt biểu bì của bề mặt ruột và nhóm A có hoạt tính sinh học cao Chỉ có các chủng E.coli gây bệnh cho người và lợn là có khả năng sản sinh LT

Cả 2 loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở

-200C Giải thích như sau: STa kích thích hệ thống men Guanylate cyclase có mặt trên các tế bào biểu mô ruột vật chủ và do vậy chuyển GTP thành cGMP Đến lượt mình cGMP hoạt hoá 86 - Kpa Proteinkinase dẫn đến phosphoryl hoá phosphatiglycilinositol và do vậy hình thành diaxyglyxerol, inositol 1, 4, 5 triphotphate, từ đó kích hoạt men C - Kinase, ba sản phẩm trên gây tăng hàm lượng Ca++ bên trong tế bào và Ca++ ngăn cản quá trình hấp thu Na+, Cl- và nước

từ trong xoang ruột vào đồng thời kích thích thải Na+, Cl- từ tế bào vào xoang ruột, hiện tượng này gây nên tình trạng ỉa chảy

Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli

Để điều trị bệnh đường ruột người ta sử dụng nhiều loại kháng sinh, ngoài ra còn trộn chúng vào thức ăn với tỷ lệ thấp để phòng bệnh và kích thích tăng trọng, vì vậy khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn ngày càng tăng

Phạm Khắc Hiếu và cs (1995),(1999) [9], [11] đ6 tìm thấy chủng E.coli kháng lại 11 loại kháng sinh đồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc giữa E.coli và Salmonella spp qua plasmid

Sở dĩ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và E.coli nói riêng tăng nhanh, lan rộng vì gen sản sinh yếu tố kháng kháng sinh nằm trong plasmid R (Resistance) Plasmid này có thể di truyền dọc và di truyền ngang cho tất cả quần thể vi khuẩn thích hợp (Falkow, 1975) [54] Để xác định khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn, người ta thường dùng phương pháp kháng sinh đồ Bằng phương pháp này Lê Văn Tạo (1993) [23] đ6 xác định khả năng kháng kháng sinh của các chủng E.coli phân lập từ bệnh phân trắng lợn con Từ đó đi đến kết luận khả năng này vi khuẩn E.coli nhận được bằng di truyền dọc và di truyền ngang qua plasmid Với những ý nghĩa trên, ngày nay việc nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn không còn đơn thuần là việc lựa chọn kháng sinh mẫn cảm để điều trị bệnh do E.coli gây ra mà là nghiên cứu một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn này

Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E coli

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn đường ruột tạo ra hội chứng ỉa chảy, viêm ruột, chảy máu đường ruột đ6 trở thành mối lo về sức khỏe không chỉ ở con người mà cả ở gia súc trên toàn thế giới Trong đó vai trò gây bệnh của E.coli rất lớn, nó có khả năng gây bệnh cho tất cả các động vật máu nóng

E.coli tồn tại bình thường trong ống tiêu hóa của gia súc, gia cầm Dưới ảnh hưởng của một số yếu tố nhất định, các chủng E.coli có độc lực gây bệnh liên quan đến tình trạng ỉa chảy và nhiễm trùng huyết ở gia súc non hoặc bệnh đường hô hấp của gia cầm Cơ chế gây ỉa chảy tuỳ theo nhóm vi khuẩn ở những nơi cư

trú tương ứng, chúng sẽ tiến hành sinh sản, phát triển và phá huỷ tế bào và làm biến đổi tổ chức tạo ra các phản ứng giữa các vi khuẩn và vật chủ Nhờ những

độc tố, chúng làm thay đổi sự cân bằng của sự trao đổi muối, nước, chất điện giải làm rút nước vào lòng ruột và gây ra tiêu chảy Sau khi đ6 gây ra tiêu chảy và thay đổi về tổ chức bệnh lý ở hệ thống tiêu hoá thì tuỳ theo khả năng gây bệnh của từng loại vi khuẩn và sức đề kháng của vật chủ mà vi khuẩn tiếp tục xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn gây dung huyết hay vào cơ quan nội tạng gây bệnh toàn thân hoặc chỉ cư trú tại ruột và gây bệnh ở đường tiêu hoá

Các chủng khác không gây ỉa chảy có thể trở thành căn bệnh cơ hội khi điều kiện thuận lợi, chúng thường tấn công vào bầu vú, tử cung và đường tiết niệu

Những serotype gây bệnh ở lợn thường thấy là: O149,O8, O138, O147,

O141…Nhìn chung lợn con mắc bệnh thường thấy tập trung vào 6 serotype sau:

O149, O141, O147, O139, O138 và O117 (Đào Trọng Đạt và cộng sự, 1996) [5]

Vi khuẩn E coli gây bệnh do nhiều yếu tố như: khả năng bám dính của vi khuẩn, khả năng xâm nhập, các loại kháng nguyên, yếu tố dung huyết, yếu tố kháng khuẩn, khả năng kháng kháng sinh và sinh độc tố Nhưng khả năng gây bệnh của E coli phụ thuộc vào 2 yếu tố độc lực chính là kháng nguyên pili và độc tố

đường ruột

+ Kháng nguyên pili

Cho phép vi khuẩn bám dính trên tế bào biểu mô nhung mao ruột non để

từ đó gây nên các biến đổi bệnh lý kèm theo

+ Độc tố đường ruột (Enterotoxin)

Do vi khuẩn sản sinh ra độc tố đường ruột gắn vào receptors trên tế bào ruột non vật chủ gây nên các biến đổi chức năng sinh lý màng tế bào dẫn đến việc tăng cường bài xuất nước và các chất điện giải ra khỏi màng tế bào Cuối cùng gây chết gia súc do mất nước, rối loạn trao đổi điện giải và trúng độc toan (Hồ Văn Nam, Trương quang, Phạm Ngọc Thạch và cs,1997), (Hồ Văn Nam, 1997) [16], [17], đặc tính gây bệnh của E.coli được thể hiện qua các giai đoạn sau:

- Xâm nhập vào ruột non: với số lượng vừa đủ gây bệnh

- Tăng nhanh số lượng bám dính: trên tế bào biểu mô nhung mao ruột non

- Sản sinh độc tố đường ruột tác động trên màng tế bào ruột non của vật chủ dẫn đến các quá trình bệnh lý

2.4.2 Vi khuẩn Clostridium perfringens

Clostridium perfingens (Cl perfingens) còn có tên là Clostridium welchic

được Oen và Natan phân lập từ năm 1982 trong tổ chức xác hơi của xác người chết (Nguyễn Lân Dũng và cs, 1998) [4]

Vi khuẩn Cl perfringens thuộc họ Bacillaceae, giống Clostridia, là vi khuẩn yếm khí sinh nha bào và sinh H2S Vi khuẩn này phân bố rộng r6i trong tự nhiên (đất, nước, phân, không khí) do đó dễ nhiễm vào thức ăn và gây ngộ độc

Qua nghiên cứu, người ta xác định được Cl perfringens có khả năng sản sinh ra nhiều độc tố và các enzim khác Mỗi loại độc tố do chúng sinh ra có vai trò xác định các chủng gây bệnh của Cl perfringens (Bormann et al, 2002), (Cadman, 1994), (Garmory, 2000) [46], [48], [57]

Đặc tính hình thái

Cl perfringens là trực khuẩn thẳng, hai đầu tròn, kích thước 0,8 - 1,5 x 3 - 8àm

Trong tổ chức bệnh, trong canh khuẩn non thấy vi khuẩn ngắn mập, đứng riêng lẻ hoặc ghép đôi thành song trực khuẩn Trong canh khuẩn già có hình dài, uốn cong hoặc sợi dài

Vi khuẩn không có lông, không di động có hình thành giáp mô, có khả năng hình thành nha bào trong môi trường trung tính hoặc kiềm, kích thước nha bào lớn hơn chiều ngang thân vi khuẩn nên thường làm biến dạng vi khuẩn, thường nằm ở giữa hoặc gần ở 1 đầu (Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương, 1997) [27]

Vi khuẩn bắt màu Gram (+), trong canh khuẩn già có thể bắt màu Gram (-)

Đặc tính nuôi cấy

Cl perfringens là vi khuẩn yếm khí triệt để, mọc tốt trên các môi trường yếm khí thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp là 7,2 - 7.6 (Lê Thị Thiều Hoa, 1991) [12]

Trong môi trường nước thịt gan yếm khí thì vi khuẩn phát triển nhanh chóng làm đục môi trường và sinh nhiều hơi, môi trường chuyển sang màu vàng rơm và có mùi đặc trưng

Trên môi trường đặc, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S tròn ẩm hơi nhô lên, ở giữa mờ đục, đường kính 2 - 3 mm Khi môi trường già, khuẩn lạc chuyển sang dạng dạng R

Trong môi trường thạch máu và Glucoza 2%, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc hình tròn hoặc bầu dục, có vùng dung huyết đúp ở xung quanh do tác

động của các độc tố β, λ, θ, độ rộng hẹp của vùng dung huyết phụ thuộc độc tố của vi khuẩn và hồng cầu pha môi trường (hồng cầu cừu, bò gây dung huyết mạnh hơn hồng cầu ngựa)

Trên môi trường Gelatin, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc hình hạt đậu nhỏ, làm tan chảy gelatin chậm bởi độc tố K, λ nhưng trong môi trường huyết thanh

đông lại không làm tan chảy và nha bào hình thành nhiều

Khi nuôi cấy trong môi trường đặc biệt có huyết thanh người hoặc lòng đỏ trứng gà, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu trắng sữa do tác động của độc tố λ

có hoạt tính men lexitilaza, đây là cơ sở của phản ứng Nagler để bước đầu xác

định Cl perfringens

Đặc tính sinh hóa

Trên thạch lòng đỏ trứng, vi khuẩn có hoạt động Lexitinaza gây ra sự biến

đổi óng ánh nhiều màu có thể phủ lên khuẩn lạc và thạch xung quanh

Cl perfringens cấy trên môi trường sữa quỳ Litmus milk gây ra phản ứng

cổ điển đông vón casein và biến màu từ xanh sang hồng do Cl perfringens lên men lactoza và sinh axit Môi trường Gelatin, vi khuẩn phát triển làm tan chảy Gelatin

Vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi đường Glucose, Mantase, không lên men Manitol, salicin

Type A gây bệnh hoại thư sinh hơi, gây ngộ độc thức ăn ở người, thỉnh thoảng gây bệnh nhiễm độc huyết cho bê và thỏ do độc tố chủ yếu là α

Type B gây bệnh cho dê, bê, ngựa con do độc tố α, β

Type C gây bệnh độc huyết cho cừu trưởng thành gọi là bệnh "Struck hay Strike"

Type D gây bệnh "thận mền nhuyễn" và bệnh tràng độc huyết truyền nhiễm ở cừu

Type E gây bệnh lỵ

Type F, các chủng type F chỉ khác các chủng type C ở một số độc tố thứ yếu còn các độc tố chủ yếu gây chết thì hoàn toàn giống nhau nên bây giờ các chủng type F được xem như các chủng type C

Kháng nguyên và độc tố của Cl perfringens

Cl perfringens có một số kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô, tuy nhiên các kháng nguyên này không có vai trò quan trọng trong việc phân biệt các chủng của Cl perfringens

Trong những năm gần đây, với sự ra đời của kháng thể huỳnh quang, đ6

được áp dụng để phân biệt các chủng khác nhau của Cl perfringens nhưng mỗi nhóm vi khuẩn có nhiều type huyết thanh khác nhau nên phương pháp này không chính xác trong việc chẩn đoán hàng ngày

Cl perfringens sản sinh ra các loại độc tố gồm:

+ Độc tố α (α- toxin)

Chủ yếu là một enzym lexitinaza sinh ra bởi tất cả các Cl perfringens type

A Khi tiêm độc tố này vào máu cho con vật sẽ gây chết ngay, tiêm nội bì sẽ gây hoại tử và làm tan hồng cầu

+ Độc tố β (β- toxin)

Độc tố này gây hoại tử và chết chủ yếu được sinh ra bởi Cl perfringens type B, C, là một protein, yếu tố chính gây độc cho người và vật, nó có thể bị phá huỷ bởi tripsin Khi tiêm độc tố vào da sẽ gây hoại tử từng mảng như hoại tử ở

ruột con bệnh, giữa mảng hoại tử màu vàng nhạt, xung quanh là vùng xuất huyết Khi tiêm tĩnh mạch sẽ gây chết chuột với liều 1microgam trong 10 phút đến 2 giờ Nếu con vật đ−ợc tiêm kháng độc tố vào tĩnh mạch sau khi tiêm độc tố trong vòng

10 phút thì con vật đ−ợc bảo vệ vì độc tố này phát huy tác dụng rất nhanh

+ Độc tố Epsilon (ε- toxin)

Độc tố này tác động gây hoại tử tổ chức ruột, chúng đ−ợc hoạt hoá bởi men tripsin hoặc chúng có thể tự hoạt hoá khi có mặt độc tố K, λ, chúng đ−ợc sinh bởi Cl perfringens type B, D

+ Độc tố Iota (I- toxin)

Độc tố gây độc và chết là chủ yếu, đ−ợc hoạt hoá bởi men tripsin hoặc tự hoạt hoá khi có mặt của độc tố λ Độc tố này đ−ợc Cl perfringens type E sinh

ra, khi đ−ợc hấp thụ vào ruột, làm gi6n các mao mạch gây xuất huyết

Cl perfringens còn có các độc tố khác nh−:

+ Độc tố Gamma (γ- toxin)

Độc tố này không có vai trò chủ yếu gây chết vật chủ, không gây hoại tử

và tan máu, chúng đ−ợc sinh bởi Cl perfringens type B, C

+ Độc tố Mu

Là enzym có đặc tính của men hyaluronidaza, bị phá huỷ khi gặp Hyaluronic (polysacharide) trong mô liên kết, được sinh ra bởi Cl perfringens type B và một số từ type A, C, D, E

+ Độc tố Nu ( V-toxin)

Là enzym deoxyribonucleaza, có nhiều tác động khác nhau đến hồng cầu,

được sinh ra bởi Cl perfringens type A, B, C, D, E

Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn Cl perfringens

Cl perfringens là vi khuẩn thường có mặt trong đường ruột của người và

động vật, khi có sự thay đổi, chúng tăng nhanh về số lượng, sinh độc tố và gây bệnh Phần lớn bệnh do Cl perfringens gây ra chỉ trong vài phút hoặc vài giờ, gây thương tổn ở ruột non (hồi và không tràng) Vi khuẩn thường xâm nhập vào biểu mô của lông nhung và tăng sinh khắp màng nhày ruột, gây hoại tử, xuất huyết tại đó Vùng hoại tử lan dần và tổn thương sâu vào niêm mạc, dưới niêm mạc, thậm chí sâu đến lớp cơ

Cùng với nhiều vi khuẩn gây bệnh đường ruột, hiện tượng bám dính của

Cl perfringens vào lông mao được xem là mấu chốt trong cơ chế gây bệnh

Cl perfringens có sẵn trong đường tiêu hoá hoặc từ ngoài vào, gặp điều kiện thuận lợi chúng tăng nhanh về số lượng và sinh nhiều độc tố, độc tố xuyên qua thành mạch vào máu gây trúng độc toàn thân, và giết chết con vật Chúng sinh độc tố thần kinh gây bại liệt và co giật, độc tố dung huyết gây hoại tử và chết Trong tự nhiên Cl perfringens gây bệnh tràng độc huyết ở người và động vật Trong phòng thí nghiệm, chuột lang, chuột bạch, bồ câu dễ cảm nhiễm Theo Trần Thị Hạnh và cs (1996) [6] các trường hợp gây viêm ruột hoại tử trên hươu, nai ở nuớc ta chủ yếu là do Cl perfringens type C gây ra Bệnh diễn ra hầu hết ở thể cấp tính, bệnh súc chết sau 24 - 48 giờ sau khi có triệu chứng tiêu chảy phân

có máu, con vật biểu hiện đau đớn vật v6 Bệnh tích điển hình: ruột non xuất

huyết nặng có khi cả ruột già, dịch ruột đỏ thẫm, thành ruột phù nặng, phổi xung huyết, tim rải rác các chấm xuất huyết, gan, lách xung huyết

Trong phòng thí nghiệm, chuột lang, chuột bạch, bồ câu dễ cảm nhiễm Tiêm vào bắp thịt chuột lang từ 0,5 - 1ml (chuột bạch từ 0,2 - 0,5ml) canh trùng

Cl Perfringens đ6 nuôi cấy trong điều kiện yếm khí/37oC/24 giờ, chuột sẽ chết sau 12 - 48 giờ, với bệnh tích thuỷ thũng ác tính , ở nơi tiêm, da căng, kêu lạo xạo khi ấn ngón tay vào, thuỷ thũng màu hồng nhạt, chứa bọt khí lan rộng xung quanh vị trí tiêm Khi tiêm vào bắp thịt 0,05 - 0,1ml canh trùng, bồ câu chết sau

16 - 20 giờ Thỏ ít cảm nhiễm hơn, chỉ sinh apxe hơi to và thường khỏi bệnh Phương pháp thử nghịêm độc tố của vi khuẩn

Thử nghiệm tìm độc tố trong các chất chứa ở ruột

+ Khi con vật chết, thu các chất chứa trong ruột càng sớm càng tốt

+ Nếu chất chứa qúa nhiều dịch nhày thì pha lo6ng với một lượng nước sinh lí vô trùng tương đương

+ Lắc kỹ hoặc trộn trong cối sứ đến khi thành huyễn dịch đồng nhất + Ly tâm 3000 vòng/phút trong lạnh khoảng 30 phút, lấy phần nước trong

ở trên (nếu cần thì li tâm lại lần nữa)

+ Có thể cho thêm penicillin và streptomycin để ức chế các vi khuẩn khác khi thử nghiệm độc tính trong môi trường nuôi cấy cũng thực hiện như trên

+ Dùng 2 con chuột bạch , tiêm cho mỗi con 0,2ml (0,4ml nếu chất chứa pha lo6ng) dịch li tâm Nếu độc tố nhiều thì chuột chết thường xảy ra trong vòng

10 giờ, chuột chết trong 5 phút thường xác định là do sốc

2.5 Cơ chế tác dụng của một số kháng sinh

Theo Trần Nguyên Hữu và cs (1988), Nguyễn Đức Lưu, Nguyễn Hữu Vũ( 2000) [14], [15], cơ chế tác dụng của một số loại kháng sinh như sau:

+ Amikacin

Là kháng sinh bán tổng hợp nhóm aminoglycoside, dẫn xuất từ Kanamicin, có phổ kháng khuẩn rộng, đặc biệt tốt với vi khuẩn Gram (-)

+ Gentamicin

Là kháng sinh nhóm aminoglycoside, tác dụng mạnh với vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) Khi uống, thuốc nằm tại đường tiêu hoá nên tác dụng tại chỗ, khi tiêm, thuốc hấp phụ nhanh, sau 30 phút

+ Nofloxacin

Là kháng sinh tổng hợp nhóm Fluoroquinolone thế hệ II có hoạt phổ tác dụng mạnh với các vi khuẩn Gram (-) và Gram (+) như Ecoli, Staphylococcus, Streptococcus, Clostridium.v.v

Vào cơ thể động vật, Nofloxacin hấp thụ nhanh và đạt nồng độ chữa bệnh trong huyết tương và các cơ quan trong khoảng thời gian ngắn nhất, đồng thời cũng được thải trừ nhanh ra khỏi cơ thể Thuốc có tác dụng ức chế men DNA- gyrase tạo cấu trúc xoắn của chuỗi AND của vi khuẩn, phân cắt các sợi nhỏ, từ

đó ức chế quá trình tổng hợp protein và giết chết vi khuẩn

3 đối tượng, địa điểm, nội dung

và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng, Nguyên liệu nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: đà điểu 1 - 18 tháng tuổi, vi khuẩn Cl perfringens

và E.coli phân lập được từ đà điểu

Các dụng cụ, máy móc, hoá chất, môi trường nuôi cấy vi khuẩn, một số loại kháng sinh chuẩn của h6ng Oxoid- Anh

Động vật thí nghiệm: chuột bạch

3.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu

+ Thời gian nghiên cứu: từ năm 2005 - 2006

+ Địa điểm nghiên cứu:

- Trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì, Hà Tây và một số cơ sở tiếp nhận con giống từ Trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì

- Bộ môn Vi trùng, Viện thú y quốc gia

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ của các bệnh trên đà điểu từ 2002 - 2005 3.3.2 Bệnh do Cl perfringens và E.coli gây ra ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi + Đặc điểm dịch tễ của bệnh: tỷ lệ nhiễm bệnh ở các lứa tuổi, mùa vụ

+ Triệu chứng bệnh do Cl perfringens và E.coli ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi + Bệnh tích bệnh do Cl perfringens và E.coli gây ra ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi + Nuôi cấy, phân lập, đếm số lượng E.coli và Cl perfringens ở đà điểu

+ Khảo sát một số đặc tính sinh hoá, xác định độc lực của E.coli và Cl perfringens phân lập từ đà điểu

3.3.3 Biện pháp phòng trị bệnh cho đà điểu giai đoạn 1-18 tháng tuổi

+ Xác định ảnh hưởng của mức độ nhiễm khuẩn trong thức ăn, nước uống và môi trường đến tỷ lệ nhiễm bệnh ở đà điểu

+ Xác định mức độ mẫn cảm với kháng sinh và một số thuốc sát trùng của E.coli

và Cl perfringens, ứng dụng vào việc kiểm soát bệnh ở trại chăn nuôi đà điểu 3.4 phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y

Nghiên cứu dịch tễ bệnh theo phương pháp dịch tễ học phân tích (Nguyễn Như Thanh, 2001) [28]

Được lấy ở các máng nước uống của đà điểu cho vào ống nghiệm vô trùng

đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy

+ Mẫu lấy từ không khí

Dùng các đĩa thạch mở nắp để trên độ cao cách nền chuồng 1,0 mét, sau

5 phút thu hồi các đĩa thạch đậy nắp đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ

để nuôi cấy

+ Mẫu ở nền chuồng

Dùng tăm bông vô trùng lăn trên nền chuồng đà điểu, mỗi đầu tăm bông lăn tròn 10 vòng mẫu cần lấy trên 5 điểm (4 góc và 1 điểm giữa chuồng đà điểu) Tăm bông cho vào ống nghiệm vô trùng đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy

Mẫu lấy từ phân của đà điểu và bệnh phẩm

+ Mẫu phân

Lấy từ trực tràng đà điểu cho vào ống nghiệm vô trùng đem về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn