và ph−ơng pháp nghiên cứu
3.1. Đối t−ợng, Nguyên liệu nghiên cứu
Đối t−ợng nghiên cứu: đà điểu 1 - 18 tháng tuổi, vi khuẩnCl. perfringens
và E.coli phân lập đ−ợc từ đà điểu.
Các dụng cụ, máy móc, hoá chất, môi tr−ờng nuôi cấy vi khuẩn, một số loại kháng sinh chuẩn của h6ng Oxoid- Anh.
Động vật thí nghiệm: chuột bạch
3.2. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
+ Thời gian nghiên cứu: từ năm 2005 - 2006 + Địa điểm nghiên cứu:
- Trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì, Hà Tây và một số cơ sở tiếp nhận con giống từ Trại nghiên cứu đà điểu Ba Vì.
- Bộ môn Vi trùng, Viện thú y quốc gia.
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ của các bệnh trên đà điểu từ 2002 - 2005 3.3.2. Bệnh do Cl. perfringens và E.coli gây ra ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi
+ Đặc điểm dịch tễ của bệnh: tỷ lệ nhiễm bệnh ở các lứa tuổi, mùa vụ. + Triệu chứng bệnh do Cl. perfringens và E.coli ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi. + Bệnh tích bệnh do Cl. perfringens và E.coli gây ra ở đà điểu 1 - 18 tháng tuổi. + Nuôi cấy, phân lập, đếm số l−ợng E.coli và Cl. perfringens ở đà điểu.
+ Khảo sát một số đặc tính sinh hoá, xác định độc lực của E.coli và Cl. perfringens phân lập từ đà điểu.
3.3.3. Biện pháp phòng trị bệnh cho đà điểu giai đoạn 1-18 tháng tuổi
+ Xác định ảnh h−ởng của mức độ nhiễm khuẩn trong thức ăn, n−ớc uống và môi tr−ờng đến tỷ lệ nhiễm bệnh ở đà điểu.
32
+ Xác định mức độ mẫn cảm với kháng sinh và một số thuốc sát trùng của E.coli
và Cl. perfringens, ứng dụng vào việc kiểm soát bệnh ở trại chăn nuôi đà điểu.
3.4. ph−ơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Ph−ơng pháp nghiên cứu dịch tễ học thú y
Nghiên cứu dịch tễ bệnh theo ph−ơng pháp dịch tễ học phân tích (Nguyễn Nh− Thanh, 2001) [28].
3.4.2. Ph−ơng pháp lấy mẫu
Mẫu nghiên cứu liên quan điều kiện vệ sinh
+ Mẫu thức ăn
Đ−ợc lấy trong các máng ăn của đà điểu sau đó cho vào ống nghiệm vô trùng đ−a về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy vi khuẩn.
+ Mẫu n−ớc uống
Đ−ợc lấy ở các máng n−ớc uống của đà điểu cho vào ống nghiệm vô trùng đ−a về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy.
+ Mẫu lấy từ không khí
Dùng các đĩa thạch mở nắp để trên độ cao cách nền chuồng 1,0 mét, sau 5 phút thu hồi các đĩa thạch đậy nắp đ−a về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy.
+ Mẫu ở nền chuồng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Dùng tăm bông vô trùng lăn trên nền chuồng đà điểu, mỗi đầu tăm bông lăn tròn 10 vòng mẫu cần lấy trên 5 điểm (4 góc và 1 điểm giữa chuồng đà điểu). Tăm bông cho vào ống nghiệm vô trùng đ−a về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy.
Mẫu lấy từ phân của đà điểu và bệnh phẩm
+ Mẫu phân
Lấy từ trực tràng đà điểu cho vào ống nghiệm vô trùng đem về phòng thí nghiệm trong vòng 6 giờ để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn.
33
+ Bệnh phẩm là phủ tạng
Đ−ợc lấy bằng cách đ−a cả con đà điểu mắc bệnh đ6 chết hoặc gần chết về phòng thí nghiệm, những đà điểu to thì mổ tại cơ sở chăn nuôi sau đó lấy bệnh phẩm gồm: tim, gan, phổi, ruột, dịch ruột và phân trong trực tràng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn.
Ph−ơng pháp phân lập xác định vi khuẩn
+ Từ mẫu phân và bệnh phẩm đà điểu
Phân lập xác định vi khuẩn theo ph−ơng pháp th−ờng quy tại Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y. Các mẫu trong thức ăn, n−ớc uống và môi sinh đ−ợc cấy lặp lại 3 lần, lấy kết quả trung bình.
+ Từ mẫu thức ăn
Lấy10g thức ăn cho vào cốc vô trùng cho vừa đủ 100 ml n−ớc sinh lý lắc đều, dùng pipet hút n−ớc trong 0,1ml nhỏ lên mặt thạch Mac Conkey, thạch máu yếm khí, mỗi mẫu nuôi cấy trên 3 đĩa, các đĩa thạch đ−ợc bồi d−ỡng ở tủ ấm 370C/24 giờ, thạch máu yếm khí để vào tủ chân không/48 giờ và đọc kết quả.
+ Trong n−ớc uống
Lấy 0,1ml mẫu n−ớc nhỏ lên mặt thạch Mac Conkey, thạch máu yếm khí, mỗi mẫu nuôi cấy trên 3 đĩa, các đĩa thạch đ−ợc bồi d−ỡng ở tủ ấm 370C/24 giờ, thạch máu yếm khí để vào tủ chân không/48 giờ và đọc kết quả.
+ Trong không khí
Để các đĩa lồng đ6 hứng vi khuẩn ở môi tr−ờng cần xét nghiệm vào tủ ấm 370C/24 giờ, thạch máu yếm khí để vào tủ chân không/48 giờ và đọc kết quả.
+ Xác định vi khuẩn trong nền chuồng
Lấy tăm bông đ6 lăn trên nền chuồng, ria lên 3 đĩa thạch Mac Conkey và 3 đĩa thạch máu yếm khí, thạch máu yếm khí để vào tủ chân không/48 giờ, các đĩa thạch Mac Conkey đ−ợc bồi d−ỡng ở tủ ấm 370C/24 giờ và đọc kết quả.
34
+ Đọc kết quả
Trên đĩa thạch Mac Conkey sau 18 - 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn trong hỗn dịch cấy láng, mọc thành những khuẩn lạc nh− sau: khuẩn lạc E.coli có màu đỏ cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, đ−ờng kính khuẩn lạc 1,5 - 2 mm. Khuẩn lạc Cl. perfringens to, hình tròn hoặc bầu dục, nhám, màu trắng và gây dung huyết đôi rất điển hình. Khuẩn lạc Salmonella dạng S, tròn gọn, nhỏ hơn khuẩn lạc E.coli, trắng và xung quanh có 1 bờ dính nhày... Kết hợp với quan sát khuẩn lạc, chúng tôi kiểm tra tính chất bắt màu và hình thái...
Ph−ơng pháp xác định đà điểu mắc bệnh
+ Chẩn đoán lâm sàng: dựa vào kết quả quan sát triệu chứng, bệnh tích, các biến đổi bệnh lý, đặc biệt ở ruột (Phạm Ngọc Thạch, 1996) [25].
+ Chẩn đoán phi lâm sàng: dựa vào kết quả phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm trong phòng thí nghiệm .
3.4.3. Ph−ơng pháp phân lập, giám định vi khuẩn E.coli và Cl. perfringens.
Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn E.coli và Cl. perfringens đ−ợc trình bày theo sơ đồ sau:
Phân hoặc bệnh phẩm của đà điểu mắc bệnh
Brilliant green agar (Khuẩn lạc màu vàng chanh) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Istrati
(Khuẩn lạc thuần khiết dạng S, màu vàng)
Mac Conkey (Khuẩn lạc màu đỏ)
Khuẩn lạc thuần khiết
Giữ trên thạch máu
Tính chất sinh học
Nhuộm Gram và kiểm tra hình thái Thử phản ứng sinh hóa, độc lực.
Chọn chủng và giữ giống vi khuẩn
35
36
Sơ đồ 3.2. Phân lập và giám định sơ bộ vi khuẩn Cl. perfringens
Mẫu Đà điểu tiêu chảy
Đà điểu khoẻ
Pha lo6ng (10 -2- 10 -9), đun 1000C/ 10 phút
Liver - Liver Broth (370
C/ 24 h) Sinh hơi, canh trùng đục, màu vàng rơm
Thạch máu Columbia - Blood - AgarBase (370C/ 24 h) Khuẩn lạc thuần khiết
Giữ ở môi tr−ờng Liver - Liver Broth
Tính chất sinh học
Đặc tính hình thái, sinh hoá, độc lực
Đặc tính sinh hoá Tiêm truyền động vật
Đặc tính hình thái Lên men đ−ờng Indol Thử đặc tính gây bệnh Thử độc tố Di động Hình thái ( Gram) Chọn chủng - Giữ giống Litmus milk
37
Cấy 0,2 ml huyễn dịch phân, bệnh phẩm trên thạch Istrati. Sau khi cấy và bồi d−ỡng ở 370C trong 24 giờ, kiểm tra khuẩn lạc E.coli. Chọn khuẩn lạc dạng S có màu vàng đặc tr−ng trên môi tr−ờng thạch Istrati cấy sang môi tr−ờng Mac Conkey và môi tr−ờng Brilliant green agar bồi d−ỡng ở 370C trong 24 giờ lấy ra quan sát tính chất mọc, màu sắc khuẩn lạc, độ tinh khiết. Nếu thuần khiết, cấy giữ giống trên thạch máu để tiến hành kiểm tra hình thái và giám định các tiêu chuẩn khác. Từ môi tr−ờng Liver - Liver Broth, cấy sang môi tr−ờng thạch máu yếm khí (370C/48 giờ), khuẩn lạc Cl. perfringens tròn hoặc hơi bầu dục, to, màu trắng đục, xù xì, dung huyết kép đặc tr−ng.
Sau khi các giống vi khuẩn E.coli và Cl. perfringens phân lập đ6 thuần khiết, tiến hành giám định một số đặc tính sinh vật hóa học cơ bản nh− đặc tính hình thái, tính chất nuôi cấy và một số phản ứng sinh hoá (Nguyễn Nh− Thanh, 1974) [26].
+ Kiểm tra hình thái học
Từ giống vi khuẩn, phân lập giữ trên thạch máu cấy chuyển ra n−ớc thịt hoặc thạch nghiêng, làm tiêu bản nhuộm Gram để kiểm tra.
+ Kiểm tra khả năng di động
Cấy chích sâu vi khuẩn vào thạch mềm hoặc xem di động của vi khuẩn trực tiếp trên kính hiển vi bằng tiêu bản giọt treo.
+ Kiểm tra tính chất mọc (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nuôi cấy vi khuẩn trên các môi tr−ờng: n−ớc thịt, thạch th−ờng, thạch máu, các môi tr−ờng đặc biệt nh−: Istrati, Mac Conkey, Brilliant green agar, n−ớc thịt gan yếm khí, thạch máu yếm khí. Quan sát tính chất mọc, hình thái, kích th−ớc và màu sắc khuẩn lạc.
+ Một số môi tr−ờng kiểm tra đặc điểm sinh hoá của E.coli và Cl. perfringens:
Khả năng lên men các loại đ−ờng: trong môi tr−ờng dinh d−ỡng Nutrient Broth, bổ sung thêm chỉ thị tía Bromocresol trong cồn và các loại dung dịch đ−ờng cần kiểm tra (với Cl. perfringens cần phải cho parafin vào để tạo môi tr−ờng yếm khí), cấy vi khuẩn vào, bồi d−ỡng trong tủ ấm 370C/24 giờ đọc kết quả. Phản ứng
38
d−ơng tính khi môi tr−ờng chuyển màu hồng, âm tính khi môi tr−ờng vẫn giữ nguyên màu sắc ban đầu.
+ Một số phản ứng sinh hoá khác
Phản ứng sinh Indol: nhỏ thuốc thử Kowacs vào môi tr−ờng peptol đ6 nuôi cấy vi khuẩn. Phản ứng d−ơng tính khi một vòng tròn đỏ xuất hiện ở trên cùng ống canh trùng. Phản ứng âm tính khi vòng tròn đỏ không xuất hiện.
Phản ứng thử V.P (Voges Proskauer): chủ yếu để kiểm tra E.coli và Aerobacter aerogenes. Cấy vi khuẩn vào môi tr−ờng peptol glucoza/37oC/2 - 4 ngày, sau đó nhỏ thuốc thử (NaOH 40g/100ml n−ớc cất hoặc dung dịch pôtat) vào, sau 5 phút nếu có màu đỏ hồng là d−ơng tính, có thể phản ứng sau 4 - 5 giờ mới xuất hiện.
Phản ứng M.R (Methyl Rouge): chủ yếu để kiểm tra E.coli và Aerobacter aerogenes. Cấy vi khuẩn vào môi tr−ờng peptol glucoza 37oC/2 - 4 ngày, sau đó nhỏ 2- 3 giọt dung dịch đỏ methyl 0,04%/ cồn 95o vào, sau 5 phút nếu có màu đỏ là phản ứng d−ơng tính, màu vàng là âm tính, giữa màu đỏ và vàng là phản ứng nghi ngờ.
Phản ứng phân giải Gelatin: cấy vi khuẩn vào môi tr−ờng Gelatin theo đ−ờng trích sâu từ giữa môi tr−ờng xuống đáy ống, sau đó để ở nhiệt độ 20oC/ 1 - 2 ngày và quan sát sự phát triển của vi khuẩn trong môi tr−ờng.
Phản ứng CAMP Test: cấy Streptococcus agalactie (serotype B) thành hai đ−ờng ngang trên đĩa thạch máu.
Sau đó các chủng Cl. perfringens phân lập đ−ợc cấy lên đĩa thạch theo đ−ờng vuông góc với Streptococccus nh−ng không chạm vào nhau. Để vào tủ chân không nuôi cấy 37OC sau 24 - 48h lấy ra đọc kết quả.
Phản ứng d−ơng tính: vùng dung huyết hình mũi tên ng−ợc chiều đ−ợc tạo ra nơi giao thoa.
Phản ứng khử Nitrat: cấy vi khuẩn vào dung dịch pepton có chứa KNO3, sau từng thời gian nhất định, lấy một ít dung dịch này và nhỏ vài giọt thuốc thử, nếu dung dịch chuyển sang màu hồng là phản ứng d−ơng tính, nghĩa là có Nitrat đ−ợc khử thành Nitrit.
39
Phản ứng Litmus milk: cấy vi khuẩn vào môi tr−ờng Litmus milk/37oC/ 48 giờ sau đó nhỏ thuốc thử vào, phản ứng d−ơng tính khi dung dịch chuyển sang màu tím hồng và sữa đông vón lại, nổi lên trên ống nghiệm.
3.4.4. Xác định số l−ợng vi khuẩn trong mẫu phân
Có nhiều ph−ơng pháp xác định số l−ợng vi khuẩn, nh−ng trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng ph−ơng pháp CoK xác định số l−ợng vi khuẩn bằng cách đếm số l−ợng khuẩn lạc phát triển trên môi tr−ờng thạch đĩa, để xác định số l−ợng vi khuẩn E.coli và Cl. perfringens có mặt trong các mẫu phân đà điểu bệnh và phân đà điểu khoẻ.
* Cách pha lo6ng mẫu:
Tiến hành pha lo6ng mẫu phân với nuớc muối sinh lý 0,9% theo cơ số 10: cân 1g phân cho vào cối sứ đ6 vô trùng, nghiền nát với nuớc sinh lý, nghiền phải kỹ để đảm bảo các vi khuẩn tách rời nhau thì khi cấy, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, đổ vào bình tam giác và cho thêm nuớc sinh lý cho đủ nồng độ pha lo6ng là 1/10. Lắc đều, dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch pha lo6ng này sang ống nghiệm đựng 9ml n−ớc sinh lý vô trùng, tiếp tục làm nh− vậy đến các nồng độ: 10-3; 10-4; 10-5; 10-6; 10-7; 10-8... * Cách lấy mẫu:
Để xác định số l−ợng vi khuẩn, chúng tôi tiến hành cấy mẫu ở nồng độ pha lo6ng cần thiết 10-4 - 10-5 để đảm bảo số l−ợng khuẩn lạc trên mỗi đĩa thạch ở khoảng 50 - 150.
Dùng pipet hút 0,2ml dịch pha lo6ng ở mỗi nồng độ nói trên, cấy vào đĩa thạch máu th−ờng hoặc thạch Mac Conkey đối với E.coli, ria đều và đặt vào tủ ấm 37OC/ 24 giờ. Đối với Cl. perfringens, hút 0,2ml dịch pha lo6ng vào thạch máu yếm khí. Mỗi mẫu phân cấy vào ít nhất 2 - 3 đĩa môi tr−ờng, dùng que cấy ria đều dịch nghiên cứu khắp bề mặt môi tr−ờng. Sau đó xếp các đĩa thạch vào trong tủ chân không/37OC/48 giờ, lấy ra đếm khuẩn lạc.
* Cách tính kết quả:
Nên cấy 0,2ml dịch pha lo6ng vào môi tr−ờng thì số l−ợng vi sinh vật (X) trong 1g phân đuợc tính theo công thức: X = 5 a ì b
40
Trong đó: a: là số khuẩn lạc trung bình /mẫu b: là nghịch đảo độ pha lo6ng.
3.4.5. Xác định độc lực của vi khuẩn E.coli và Cl. perfringens
Xác định độc lực của vi khuẩn E.coli và Cl. perfringens theo ph−ơng pháp của Carter (1984) [50]
Mỗi chủng vi khuẩn tiêm cho 2 chuột, liều 0,2 ml canh trùng nuôi cấy 24giờ/37OC vào xoang phúc mạc. Theo dõi số chuột chết và thời gian giết chết chuột của vi khuẩn trong 7 ngày. Chuột chết đ−ợc mổ kiểm tra bệnh tích và lấy máu tim, phủ tạng nuôi cấy phân lập vi khuẩn.
Xác định khả năng sản sinh kháng nguyên bám dính của E. coli, các độc tố bằng ph−ơng pháp PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng d−ơng cho phản ứng PCR. - Các primers, hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR xác định từng yếu tố gây bệnh.
Các primers: Các yếu tố
gây bệnh M6 primer Trình tự DNA STa STa-1
Sta-2
5’ TCT TTC CCC TCT TTT AGT CAG 3’ 5’ ACA GGC AGG ATT ACA ACA AAG 3’ STb STb-1
STb-2
5’ ATC GCA TTT CTT CTT GCA TC 3’ 5’ GGG CGC CAA AGC ATG CTC C 3’ LT LTa-1
Lta-2
5’ GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC 3’ 5’ CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC 3’ F4 F4-Fw
F4-Rv
5’ GGT GAT TTC AAT GGT TCG 3’ 5’ ATT GCT ACG TTC AGC GGA GCG 3’ F18 FedA-1
FedA-2
5’ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC 3’ 5’ CIT GTA AGT AAC CGC GTA AGC 3’ VT2e VT2-Fw
VT2-Rv
5’ CTT GGG TAT CCT ATT CCC GG 3’
5’ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC 3’
+ AMP x 5 buffer
41
+ dNTP stock + PCR x 10 buffer
- Các dung dịch và hoá chất cần cho chạy điện di: + 50 x TAE
+ 0,5 M (EDTA) + Loading buffer
- Các chủng E. coli ATCC 25922 dùng làm đối chứng
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 b−ớc, thực hiện trong máy nhân gen tự động Perkin Elmer.
- Chạy điện di
Sản phẩm PCR thu đ−ợc sau chu trình phản ứng đ−ợc nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (loading dye), đ−ợc trộn vào mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR đ−ợc chạy điện di trên thạch Agarose 3%, trong dung dịch đệm TAE (Tris - agartate - EDTA) với hiệu điện thế 100V trong vòng 40 phút.
- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy điện di đ−ợc nhuộm màu bằng chất nhuộm huỳnh quang Ethidium bromide (1àl/ml) trong 15 phút rồi đọc kết quả.
- Đọc kết quả
Đọc kết quả bằng cách quan sát d−ới ánh đèn UV (300nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Polaroid camera. Trên ảnh chụp nền đen, các đoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng và có thể chụp ảnh đ−ợc và ghi nhận lại. Kích th−ớc các băng DNA đ−ợc so sánh với DNA chuẩn (DNA marker).