ĐỀ tài ỨNG DỤNG các PHƯƠNG PHÁP của KHỐI PHỔ

PHẦN 1.LỜI MỞ ĐẦU : Thông thường sau khi biểu hiện một gen người ta co thể thu được một protein,nếu dừng ở mức độ điện gi trên geo acryllamide thì ta chỉ biết được khối lượng protein th

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LẠC HỒNG

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA –THỰC PHẨM

ỨNG DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP

CỦA KHỐI PHỔ

Lớp :08CH111 Nhóm 11

Thành viên

GVHD:THS Trần Đức Trọng

PHẦN 1.LỜI MỞ ĐẦU :

Thông thường sau khi biểu hiện một gen người ta co thể thu được một

protein,nếu dừng ở mức độ điện gi trên geo acryllamide thì ta chỉ biết được khối lượng protein theo các băng mà không thể xác định một cách chắc chắn rằng băng đó,theo lý thuyết trùng với khối lượng protein cần biểu hiện,chính là protein mong muốn.Ta có thể làm western blot có thể khẳng định chắc chắc hơn.Tuy

nhiên,không phải mọi protein đều kháng thể(hoặc kháng nguyên tương ứng) hoặc nếu có cũng gây mất nhiều thời gian công sức lẫn tiền bạc để dùng cho

westernblot Nhưng không phải là không thể…

Phương pháp khối phổ có thể khẳng định được chính xác protein chúng ta mong muốn

PHẦN 2 TÌM HIỂU VỀ KHỐI PHỔ

.MÔ HÌNH VỀ KHỐI PHỔ:

1.khối phổ là gì?

là phương pháp nghiên cứu các chất, bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó, dựa trên điện tích của ion; dùng thiết bị chuyên dụng là khối phổ kế

Kĩ thuật này có nhiều ứng dụng, thường được kết hợp với một số sinh học phân tử khác như:

.Khối phổ kết hợp với sắc ký khí

.Khối phổ kết hợp với sắc ký lỏng

.Khối phổ kết hợp điện di

2.Sơ lươc về nguyên tắc hoạt động:

Sự ion hoá:nghiên cứu các chất bằng phương pháp khối phổ, các phân

tử chất nghiên cứu phải ở dạng khí hoặc hơi, phải được ion hoá bằng các phương pháp thích hợp(va chạm điện tử ,bằng trường điện từ ,ion hoá

học,chiếu xạ bằng các photon.)

Phương pháp ion hoá bằng

va chạm điện tử

Trong buồng ion hoá, các điện tử phát ra từ cathode làm bằng vonfram hoặc reni, bay về anode với vận tốc lớn Các phân tử chất nghiên cứu ở trạng thái hơi sẽ va chạm với điện tử trong buồng ion hoá, có thể nhận năng lượng điện tử và bị ion hoá

PHẦN 3 NHỮNG ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP KHỐI PHỔ:

Trong thực tế khối phổ có rất nhiều ứng dụng quan trọng như:

• Phân tích dioxin và furan trên nhiều lĩnh vực về môi trường như:đất, bùn trầm tích,nước sông ngòi…

• Về thủy hải sản :tôm,cá , mực…

• Về nông sản :gạo ,đậu ,cà phê…

Nhưng có lẽ ứng dụng mà nhiều người nhắc tới về khối phổ nhiều nhất là ứng dụng trong sinh học

I Ưng dụng của khối phổ trong sinh học:

1 xác định protein :

protein và các phân mảnh peptit :

Protein mà các nhà nghiên cứu sinh học quan tâm thường là sự kết hợp phức tạp của nhiều protein và phân tử khác nhau, cùng tồn tại trong một môi trường sinh học Điều này đặt ra hai vấn đề chính Thứ nhất, hai kĩ thuật ion hóa dùng cho các phân tử lớn chỉ làm việc tốt khi mà hỗn hợp từ các thành phần có cấu tạo gần giống, trong khi trong các mẫu sinh học, các protein khác nhau thường là có lượng khác biệt nhau lớn

Khối Phổ Của Nếu hỗn hợp được ion hóa dùng phương pháp phun ion (ESI) hay MALDI, thì những protein dạng mà dư thừa nhiều có xu hướng giảm tín hiệu so với những cái ít dư thừa hơn Vấn đề thứ hai, quang phổ khối từ hỗn hợp phức tạp là rất khó để nghiên cứu do có quá nhiều thành phần phức hợp

Đó là vì với tác động của enzym, một protein tạo ra hàng loạt sản phẩm peptit giải quyết vấn đề này, hai phương pháp được sử dụng rộng rãi để phân mảnh protein, hay các sản phẩm peptit từ sự tác động của enzym Phương pháp đầu tiên sẽ phân mảnh toàn bộ protein và được gọi là điện chuyển gel hai chiều (2-DE: two-dimensional gel electrophoresis).Phương pháp thứ hai, ghi sắc lỏng hiệu năng cao (HPLC) được dùng với các phân mảnh peptit sau khi protein phân tách bởi tác động của enzym Trong một số tình huống, có thể cần phải kết hợp cả hai phương pháp

Các vết gel được xác định trên 2D Gel thường là thuộc về một protein Nếu cần biết định danh của protein đó, thì có thể xem xét vết gel đó Khối peptit kết quả

từ tác động của enzym lên protein có thể được xác định bằng khối phổ

dùng lấy dấu khối peptit Nếu thông tin này không cho phép xác định danh tính của protein một cách chính xác, các peptit của nó có thể xem là thuộc về đo phổ khối tandem

Việc xác định đặc tính của hỗn hợp protein dùng HPLC/MS còn được gọi

là shotgun proteomics và mudpit Một hỗn hợp là kết quả của sự tác động của enzym lên hỗn hợp protein sẽ được phân mảnh theo một hay hai bước bằng ghi sắc lỏng Chất tách rửa từ giai đoạn ghi sắc có thể hoặc là trực tiếp đưa vào

máy đo phổ khối thông qua ion hóa phun điện tử (ESI), hay tách ra thành một loạt các vết nhỏ để sử dụng sau này trong phân tích khối bằng MALDI

** Có 2 cách chính trong khối phổ để xác định protein

- Lấy dấu khối peptit (PMF )

- Tandem MS

- Lấy dấu khối peptit (PMF): dùng khối của các

peptit đã phân giải làm đầu vào để tìm kiếm trong

CSDL của các khối đã biết trước từ danh sách các

protein đã biết Nếu một chuỗi protein trong danh

sách tham khảo trùng khớp với giá trị thử nghiệm

thì có lí do để tin rằng protein đó có tồn tại trong

mẫu gốc

-Tandem MS: đang trở thành một phương pháp thử

nghiệm phổ biến để xác định protein Phân ly do va

chạm (CID) được dùng trong các ứng dụng chính để

khởi tạo một tập các phân mảnh từ một ion peptit cụ thể

Quá trình phân tách chủ yếu dựa vào các chế phẩm phân

tách để bẻ gãy liên kết peptit Vì sự đơn giản của việc

phân tách này, nó có thể dùng khối của các phân mảnh

quan sát được để so trùng CSDL của các khối đã biết với

một hay nhiều chuỗi peptit

Khả năng thực hiện song song MS sau khi electrospray

ion hoá đã cách mạnghóa protein từ phương pháp này

MS-MS có thể được sử dụng để có được thông tin trình tự amino

acid (Roepstorff, 1997) Như vậy chuỗi peptide thẻ có thể được sản xuất từ các mảnh peptide do đó cho phép tìm kiếm cơ sở dữ liệu tinh chế cao Đối với các chất chuyển hóa hồ sơ khả năng để có được cấu trúc thông tin thứ cấp sẽ có giá trị để xác định phân tích xác định này là cơ sở dữ liệu hoặc bằng cách tương tự với các chất được biết đến hoặc do giải thích các mô hình phân mảnh (McLafferty & Turecek, 1993)

peptide gắn thẻ và de novo trình tự protein yêu cầu nhiều vật liệu, trừ khi sự ra

đời của tiêu hóa là rất chậm với khối lượng rất nhỏ đã chết trong LC bộ máy truyền dịch Chúng tôi đã khắc phục vấn đề này bằng cách sử dụng mao dẫn HPLC (sắc ký lỏng cao hiệu suất) cho phép phụ microlitre mỗi tốc độ dòng chảy

phút mà là rất cần thiết để đạt được độ nhạy cao ESI-MS-MS các chuỗi axit amin

và protein trên mạng

Trong phương pháp này MS-MS (được mô tả ở trên) là một máy phổ khối đầu tiên (MS-1) mà sử dụng một khối tứ cực lọc được điều chỉnh để cho phép một

số ion analyte quan tâm (ví dụ như màu đỏ ở trên) thông qua Điều này sau đó được đưa vào một tế bào va chạm nơi Argon được sử dụng để phân đoạn các analyte, và các ion được gọi là con gái sau đó được quét vào một thời gian thứ hai của chuyến bay-MS (MS-2), nơi họ được tách ra và phát hiện

xác định protein thu được trong các mẩu sinh học Protein từ mẩu có thể được phân tách bằng điện di một hoặc hai chiều và protein được nhận dạng bằng cách sử dụng MALDI-TOF và đánh dấu khối peptide.Peptide thu được tại những vị trí đặc biệt của protein đã được phân tách trên gel polyacrylamide có

thể được phân tách bằng cách sử dụng khối phổ tandem.Dữ liệu từ khối phổ tandem có thể được dùng để tạo nên 1 cơ sở dữ liệu

*Để hiểu rõ vấn đề ta có thể thông qua ví dụ sau:

Các hóa chất khác nhau thì có khối lượng phân tử khác nhau Dựa vào đó, khối phổ kế sẽ xác định chất hóa học nào có nằm trong mẫu Ví dụ, muối NaCl hấp thụ năng lượng (năng lượng hấp thụ tùy theo nguồn ion, ví dụ MALDI năng lượng là tia laser) tách ra thành các phân tử tích điện, gọi là ion), trong giai đoạn đầu của phương pháp phổ khối Các ion Na+, Cl- có trọng lượng nguyên

tử khác biệt Do chúng tích điện, nghĩa là đường đi của chúng có thể được điều khiển bằng điện trường hoặc từ trường Các ion được đưa vào buồng gia tốc và

đi qua một khe vào miếng kim loại Một từ trường được đưa vào buồng đó Từ trường sẽ tác động vào mỗi ion với cùng một lực và làm trệch hướng chúng về phía đầu đo Ion nhẹ hơn sẽ bị lệnh nhiều hơn ion nặng vì theo định luật

chuyển động của Newton gia tốc tỉ lệ nghịch với khối lượng của phân tử Đầu

đo sẽ xác định xem ion bị lệnh bao nhiêu, và từ giá trị đo này, tỉ lệ khối lượng-trên-điện tích của ion có thể được tính toán Từ đó, có thể xác đinh được thành phần hóa học của một mẫu gốc Trên thực tế thì hai ion Na+ và Cl- sẽ không được đo trong cùng một lần, vì các máy đo chỉ có thể nhận ra ion điện tích dương hoặc điện tích âm nên nếu máy khối phổ kế được điều chỉnh để đo các ion điện tích dương thì chỉ có ion Na+ là được nhận ra bởi máy .Một trong những tính năng lớn của khối phổ lượng là có thể tìm thấy cấu tạo không gian của phân tử ví dụ phân tử C7H14O2 có thể là acid hoặc ester Và khả năng phát hiện ra hợp chất với độ nhậy cực cao từ 10-6 dến 10-12 gram Dưới đây là một khối phổ (electrospray)của phân tử

Kaempferol-rhamnose-rhamnose-Sequenc e

database

Tandem mass spectrum

Mass map

Tandem

mass spectrome try

MALDI

TOF

or

Gel-separated

protein

glucose(m/z 741) trong loại cỏ thaliana, phân tích với 5.10-6L (nếu dùng máy MALDI thì chỉ cần 0,5.10-6L)

2

kiểm tra chất lượng :nông sản, thực phẩn chế biến, thức ăn gia súc và thủy hải sản: độc tố nấm mốc, vitamin, thành phần aa, phụ gia thực phẩm, chất hoạt động bề mặt, dư lượng kháng sinh (chloramphenicol, nitrofuran,

fluoroquinolone, họ tetracycline, sulfamide…), dư lượng hormone kích thích tăng trưởng đã bị cấm, vi sinh vật có hại, mầu bị cấm trong thực phẩm (các loại Soudan), dư lượng thuốc trừ sâu

IV KẾT LUẬN:

Qua những gì ta được biết đến về khối phổ ta có thể thấy được tầm quan trọng của no trong nhiều lĩnh vực như hiện nay nhu ở trong công nghiệp ,nông nghiệp … và đặc biệt trong sinh học Nó có thể giúp chúng ta đi sâu hơn trong các nghiên cứu thí nghiệm trong lĩnh vực này để từ đó có thể tìm ra được nhiều ứng dụng co ích cho cuộc sống của chung ta

*Tài liệu tham khảo:

http: //wikipedia.org.vn

http://baigiang.violet.vn