CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT SÂU TỪ Bacillus thuringiensi

Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanhMối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn trùng không nhất quán:  Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng nh

CHƯƠNG III:

CHẾ PHẨM SINH HỌC DIỆT

SÂU TỪ Bacillus thuringiensis

I LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA THUỐC TRỪ SÂU BT

1901 Bacillus thuringiensis được tiến sỹ Ishiwatari phát

hiện.

1911 Berliner phát hiện trong các silo hạt ở Thuringe.

1915 Berliner quan sát thấy sự tạo thành tinh thể trong giai

đoạn tạo bào tử.

1920 Được sử dụng lần đầu tiên làm thuốc trừ sâu.

1950 Chế phẩm chứa bào tử được thương mại hóa lần đầu

Phát hiện chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao

Công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh Có 13 chủng Bt đã được xác định Tất cả đều chỉ diệt được côn trùng bộ cánh vẩy (Lepidoptera).

1977 Phát hiện ra Bt var.israelensis diệt ấu trùng ruồi,

muỗi.

1983 Phát hiện ra Bt var.tenebrionis diệt bộ cánh cứng.

 Trực khuẩn, kích thước 1-1,2 x 3-5 µm

 Phủ tiêm mao, di chuyển được

 Gram +

 Sinh bào tử, kích thước 1,6 – 2 µm

 Hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc

 Tế bào đứng riêng hoặc xếp chuỗi

 Nhiệt độ sinh trưởng 15º-45ºC

 Phổ biến trong tự nhiên, cư trú trong

đất, trên bề mặt cây và trên xác sâu

Tạo ra tinh thể protein trong giai đoạn

tạo bào tử, kích thước 0,6 – 2 µm

Bào tử : hình trứng dài, kích thước 1,6 x 2 µm

Tinh thể : kích thước 0,6 x 2

µm Bản chất là protein

Bacillus thuringiensis thuộc:

Khoá phân loại của Bergey (1984)

III Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)

1 Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao

Quan sát dưới kính hiển vi thấy tế bào

không di chuyển được

1 Theo typ huyết thanh kháng tiêm mao (tiếp)

Chuẩn bị kháng nguyên

tiêm mao H

Tiêm vào thỏ → thu huyết thanh miễn dịch

(xác định hiệu giá)

Thử phản ứng ngưng kết

 Chuẩn bị dịch kháng tiêm mao H

 Nuôi cấy VK B thuringiensis trên môi trường bán lỏng NA: cao thịt 5g, agar

2g, nước cất 1000ml, điều chỉnh tới pH = 7,2 Thời gian nuôi 16 – 18 giờ.

 Chuyển sang môi trường NB: nuôi ở chế độ lắc cho tới khi OD 650 = 0,8 – 1,0.

 Bổ sung 0,5 ml formaldehyt

Thu nhận dịch kháng nguyên tiêm mao H

 Thu nhận huyết thanh miễn dịch

 Tiêm dịch kháng nguyên tiêm mao H:

 Mũi đầu tiên dưới da.

 Các mũi tiếp theo tiêm ven, mỗi tuần 2 lần, liều lượng mỗi lần tăng dần (1ml, 2ml, 3ml), thời gian tiêm 3 tuần

 Kiểm tra sự hình thành kháng thể:

 Sau 8 ngày của lần tiêm cuối: lấy 2ml máu từ ven tai thỏ để xác định hiệu giá.

 Nếu HG lớn hơn hoặc bằng 25 000 là đạt yêu cầu.

 Nếu HG nhỏ hơn 25 000 thì tiếp tục tiêm thêm 2 – 3 lần nữa để nhận hiệu giá cao hơn.

 Dùng 02 con thỏ cho một kháng nguyên để tránh rủi ro.

Cho 1,8ml NaCl 1,15M và 200 µ l dịch huyết thanh miễn dịch tiêm mao vào ống nghiệm 5ml.

 Pha loãng với các nồng độ giảm dần theo hệ số 2: 1:10; 1:20; 1:40;

…… ; 1:2560.

 Chuyển 100 µ l dịch ở mỗi nồng độ pha loãng này vào ống nghiệm có chứa 900 µ l dịch vi khuẩn B thuringiensis, như vậy độ pha loãng lúc

này là 1:100; 1:200; 1:400; … ; 1:25600 Mẫu đối chứng được thay thế

100 µ l dịch huyết thanh bằng 100 µ l dịch NaCl 1,15M.

 Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong 2 giờ và quan sát sự ngưng kết.

Hiệu giá thu được là nồng độ pha loãng cao nhất xảy

ra hiện tương ngưng kết

Nhược điểm của phân loại theo type huyết thanh

Mối liên hệ giữa type huyết thanh với phổ diệt côn

trùng không nhất quán:

 Có các loài cùng type huyết thanh có độc tính với côn trùng

như nhau: loài phụ Kustaki và loài phụ alesti đều biểu hiện độc

với côn trùng bộ cánh vẩy.

 Có các loài có type huyết thanh giống nhau nhưng độc tính với

côn trùng khác nhau: loài phụ morisoni (type huyết thanh H8ab)

có độc tính với côn trùng bộ hai cánh và loài phụ sandiego

(type huyết thanh H8ab) có độc tính với côn trùng bộ cánh

cứng.

Không thể thông qua type huyết thanh của một loài

phụ để xác định hoạt tính diệt sâu của chúng

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

1 thuringiensis THU Berliner 1915; Heimpel và Angus 1958

2 finitimus FIN Heimpel và Angus 1958

3a, 3c alesti ALE Toumanoff và Vago 195, Heimpel và

Angus 1958 3a, 3b, 3c kurstaki KUR De Barjac và Lemille 1970

3a, 3d sumiyoshiensis SUM Ohba và Aizawa 1989

3a, 3d, 3e fukuokaensis FUK Ohba và Aizawa 1989

4a, 4b sotto SOT Ishiwata 1905, Heimpel và Angus 1958 4a, 4c kenyae KEN Bonnefoi và De Barjac 1963

5a, 5b galleriae GAL Shvetsova 1959, De Barjac và Bonnefoi

1962

Độc với bộ cánh vẩy

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

5a, 5c canadensis CAN De Barjac và Bonnefoi 1972

6 entomocidus ENT Heimpel và Angus 1958

7 aizawai AIZ Bonnefoi và De Barjac 1963

8a, 8b morrisoni MOR Bonnefoi và De Barjac 1963

8a, 8c ostriniae OST Ren et al., 1975

8b, 8d nigeriensis NIG Weiser và Prasertphon 1984

9 tolworthi TOL Norris 1964, De Barjac và Bonnefoi 1968 10a, 10b darmstadiensis DAR Krieg de Barjac và Bonnefoi 1968

10a, 10c londrina LON Arantes et al.(không công bố)

11a, 11b toumanoffi TOU Krieg 1969

11a, 11c kyushuensis KYU Ohba và Aizawai 1979

Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

12 thompsoni THO De Barjac và Thompson 1970

13 pakistani PAK De Barjac et al., 1977

14 israelensis ISR De Barjac 1978

15 dakota DAK De Lucca et al., 1979

16 indiana IND De Lucca et al., 1979

17 tohokuensis TOH Ohba et al., 1981

18a, 18b kumamatoensis KUM Ohba et al., 1981

18a, 18c yosso YOS Lee H.H et al., 1995

19 tochigiensis TOC Ohba et al., 1981

20a, 20b yunnanensis YUN Wan-Yu et al., 1979

20a, 20c pondicheriensis PON Rajagopalan et al (không công bố)

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

21 colmeri COL De Lucca et al., 1984

22 shandongiensis SHA Wang Ying et al., 1986

23 japonensis JAP Ohba và Aizawa 1986

24a, 24b neoleonensis NEO Rodriguez-Padilla et al., 1988

24a, 24c novosibirsk NOV Burtseva et al., 1995

25 coreanensis COR Lee H.H et al., 1994

26 silo SIL De Barjac và Lacadet (không công bố)

27 mexicanensis MEX Rodriguez-Padilla và Galan-Wong

(không công bố) 28a, 28b monterrey MON Rodriguez et al., 1988

29 amagiensis AMA Ohba (không công bố)

Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

31 toguchini TOG Hodirev (không công bố)

32 cameroun CAM Jacquemard 1990, Juarez-Perez et al.,

1994

33 leesis LEE Lee H.H et al., 1994

34 konkukian KON Lee H.H et al., 1994

35 seoulensis SEO Lee H.H et al., 1995

36 malaysiensis MAL Ho (không công bố)

37 andaluciensis AND Aldebis et al., 1996

38 oswaldocruzi OSW Rabinovitch et al., 1995

39 brasiliensis BRA Rabinovitch et al., 1995

40 huazhongensis HUA Dai Jingyuan et al., 1996

41 soocheon SOO Lee H.H et al., 1995

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

42 jinghongiensis JIN Li Rong Sen et al

43 guiyangiensis GUI Li Rong Sen et al

44 higo HIG Ohba et al., 1995

45 roskildiensis ROS Hinrinschen et al.(không công bố)

46 chanpaisis CHA Chanpaisaeng (không công bố)

47 wratislaviensis WRA Lonc et al., 1997

48 balearica BAL Caballero et al.(không công bố)

49 muju MUJ Seung Hwan Park et al.(không công bố)

50 navarrensis NAV Caballero et al.(không công bố)

51 xiaguangiensis XIA Jian Ping Yan (không công bố)

52 kim KIM Kim et al.(không công bố)

Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

53 asturiensis AST Aldebis et al., 1996

54 poloniensis POL Damgaard et al.(không công bố)

55 palmanyolensis PAL Santiago-Alvarez et al (không công bố)

56 rongseni RON Li Rong Sen

57 pirenaica PIR Caballero et al (không công bố)

58 argentinensis ARG Campos-Dias et al.(không công bố)

59 iberica IBE Caballero et al (không công bố)

60 pingluonsis PIN Li Rong Sen

61 sylvestriensis SYL Damgaard (không công bố)

62 zhaodongensis ZHA Li Rong Sen

63 bolivia BOL Ferré-Manzanero et al.(không công bố)

H

antigen Serovar Viết tắt Lần đầu tiên miêu tả

64 azorensis AZO Santiago-Alvarez et al.(không công bố)

65 pulsiensis PUL Khalique F Và Khalique A (không công

bố)

66 graciosensis GRA Santiago-Alvarez et al.(không công bố)

67 vazensis VAZ Santiago-Alvarez et al.(không công bố)

68 thailandensis THA Chanpaisaeng et al.(không công bố)

69 pahangi PAH Seleena và Lee H.L (không công bố)

Bảng phân loại Bacillus thuringiensis theo kháng nguyên H

2 Theo gen mã hóa protein tinh thể độc

Protein Cry Mã hóa Gen Cry

 Protein cry hay còn gọi δ -endotoxin (tinh thể độc)

 ICP tồn tại dưới dạng tiền độc tố, cần được hoạt hoá để có tác dụng.

 ICP tồn tại dưới nhiều hình dạng: kim tự tháp đôi, thoi phẳng, khối hộp, hỗn hợp của các loại trên.

 ICP có kích thước khoảng 230KDa với phần nhân độc 65KDa.

 ICP tan trong điều kiện pH cao (pH >9,5).

 Tính độc: gây độc ở nồng độ picomol (10-12M)

 Các gen mã hoá cho ICP thường nằm trên các plasmid.

 Mỗi ICP là sản phẩm của một gen.

 Một số loài phụ có khả năng tổng hợp được nhiều hơn 1 ICP.

 250 gen mã hoá tổng hợp protein cry đã được đọc trình tự và được xếp vào 40 họ dựa vào sự tương đồng về trình tự sắp xếp các nucleotit.

của các gen cry

Hàng thứ tượng Biểu % tương đồng axít amin của gen cry

Hai Chữ in hoa 75%

Gen Hình dạng tinh

thể Kích thước protein

(kDa)

Đối tượng sâu diệt

CryI (Aa, Ab, Ac, B,

C, D, E, F, G, H, I,

J, K, L)

Lưỡng tháp 130-140 ấu trùng bộ cánh vẩy

CryII (A, B, C) Hình lập

phương 69-71 Bộ cánh vẩy và bộ hai cánh

CryIII (A, B, C, D) Phẳng/không

đều

73-74 Bộ cánh cứng

CryIV (A, B, C, D) Lưỡng tháp 73-134 Bộ hai cánh

CryV-cryIX Đa dạng 35-129 Đa dạng

Phân loại Bt theo gen mã hóa protein tinh thể độc (Hoft và Whiteley, 1989)

Độc tố diệt sâu Khối lượng

phân tử (kDa) Độc tính Hofte and

Whiteley

(1989)

Crickmore et al

(1999)

cánh

cánh

Phân loại độc tố diệt sâu (tiếp)

Độc tố diệt sâu Khối lượng

phân tử (kDa) Độc tính Hofte and

Whiteley

(1989)

Crickmore et al

(1999)

cánh

Độc tố diệt sâu Khối lượng

phân tử (kDa) Độc tính Hofte and

Whiteley

(1989)

Crickmore et al

(1999)

hủy tế bào

hủy tế bào

3 Các cách phân loại khác

 Phân loại theo loại hình enzym lipase

 Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể

 Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên O

 Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng

Theo hình thái của thể vùi

III Phân loại Bacillus thuringiensis (tiếp)

 Tương đối thống nhất với loại hình huyết thanh kháng nguyên H, sử dụng để phân biệt các loài phụ của cùng một type huyết thanh.

 Phân loại theo type huyết thanh kháng protein tinh thể

 Các tinh thể có cấu trúc khác nhau, thành phần kháng nguyên của các tinh thể khác nhau.

 Thông qua phản ứng huyết thanh nhận biết type huyết thanh tinh thể.

 Quan hệ mật thiết với phổ diệt sâu

 Phân loại theo type huyết thanh kháng nguyên O

 KN O là một kháng nguyên bền nhiệt của Bt, thu được khi xử lý nhiệt

để loại bỏ tiêm mao.

 Được sử dụng để xác định vị trí phân loại Bt không có tiêm mao.

 Phân loại theo loại bệnh gây cho côn trùng

Căn cứ vào độ nhạy khác nhau của côn trùng: Dạng A (nhạy cảm với bộ cánh vẩy) Dạng B (nhạy cảm với bộ hai cánh) Dạng C (nhạy cảm với

bộ cánh cứng) Dạng D (nhạy cảm với bộ hai cánh và bộ cánh vẩy).

IV SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA Bt

Chu trình sống của Bacillus thuringiensis

1 Pha phát triển sinh dưỡng

2 Pha tạo bào tử

Các giai đoạn của quá trình tạo bào tử và tinh thể

của Bt

và tinh thể độc

V CÁC LOẠI ĐỘC TỐ CỦA Bacillus thuringiensis

Tinh thể độc của Bt var.israelensis (Bti) dưới kính

hiển vi điện tử

1 α-exotoxin : là phospholipase C, 45-50

kDa, không bền nhiệt Chỉ có ở một số

chủng Bt.

• Enzim liên quan tới sự phân huỷ

mang tính cảm ứng của photpholipit

trong mô của côn trùng.

• Đầu tiên enzim liên kết với tế bào

ruột của côn trùng, sau đó tách ra

và được hoạt hoá bởi một chất

không bền nhiệt.

chế tổng hợp ARN.

• Tác dụng cộng hưởng với δ-endotoxin: δ-endotoxin làm dập vỡ, phá huỷ vùng biểu mô ruột giữa côn trùng β-exotoxin xâm nhập vào huyết tương và máu gây ra biến đổi sinh lý của ấu trùng.

• Độc với cơ thể sống kể cả người, phổ diệt sâu rộng Do đó cần loại bỏ các chủng sinh độc tố này.

3 δ-endotoxin : ICPs (insecticidal crystal proteins) hay protein Cry hay thể vùi được tạo thành trong giai đoạn tạo bào tử Tác dụng độc đặc hiệu với các loài côn

trùng Lượng tinh thể độc cũng như phổ tác dụng thay đổi theo chủng.

• Protein kết tinh gồm 640 – 1200 a/a Chủ yếu là a glutamic, a asparaginic chiếm 20% tổng số a/a Điểm đẳng điện thấp (pI = 4,4).

• Tỷ lệ axit amin systein thấp (<2%) gây ra tính không tan của tinh thể.

• Ngoài ra chứa: hydratcacbon 5,6%; các nguyên tố C, N, H, O, S và 19 nguyên

tố Ca, Mg, Si, Fe…

• Hình dạng: đa dạng

4 Vips (Vegetative insecticidal proteins)

Cấu trúc của tinh thể protein

Cấu trúc không gian của tinh thể Cry3

quanh là 6 chuỗi xoắn α lưỡng tính

khác Chứa 290 axít amin và chứa đầu

N Chịu trách nhiệm tạo lỗ rò trên ruột

sâu.

tấm β và một chuỗi xoắn α ngắn Chịu

trách nhiệm gắn với thụ thể.

12 tấm β chứa đầu C Chịu trách nhiệm

nhận biết điểm gắn kết

Bao gồm 3 vùng:

Thụ thể Màng tế bào

III II

I Tinh thể độc

III

II I

• ngừng ăn

• nôn mửa, tiêu chấy, lờ đờ, mất điều khiển

có thể chết ngay sau khi nhiễm bệnh, hoặc cũng có thể

bệnh kéo dài 1giờ đến vài ngày Nếu sống sót thì tuổi thọ, khả năng sinh sản, trọng

lượng của sâu cũng giảm

VI SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA Bt

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và hình thành

Hoạt lực diệt sâu của Bacillus thuringiensis được

quyết định bởi:

 Số lượng gen cry có mặt

 Sự khác nhau về trình tự axít amin

của các ICPs

 Sự khác nhau của mức độ biểu

hiện các gen

 Thuộc tính của các ICPs, vd: khả

năng giữ được độ ổn định và hoạt

độ trong quá trình lên men

Các yếu tố quyết định phổ tác dụng của Bt

Chủng Bt

Khả năng hòa tan của độc tố trong ruột sâu

Khả năng tiếp cận của sâu với độc tố

1

2

3

trong môi trường

Ưu điểm của thuốc trừ sâu BT

- Không ảnh hưởng xấu đến môi trường, người sản

xuất, người tiêu dùng.

-Không ảnh hưởng đến chất lượng nông sản

- Công nghệ sản xuất và thiết bị đơn giản, nguồn

nguyên liệu sản xuất là phụ phẩm công nghiệp.

- Tỷ lệ phát triển tìm ra chủng giống mới cao Có thể

cải tạo giống theo ý muốn bằng phương pháp di

truyền và công nghệ gen.

- Đăng ký sản phẩm mới đơn giản, nhanh và rẻ tiền.

- Gặp khó khăn khi cây trồng bị tấn công bởi nhiều loài

sâu hại khác nhau.

- Thời gian có hiệu lực quá ngắn do các độc tố bị phân

hủy nhanh chóng do tia UV.

- Lắng đọng nhanh trong nước → mất hoạt tính.

- Mất hoạt tính trong đất do bị phân hủy bởi các VSV

trong đất.

- Khó tiếp cận được với các loài sâu ở rễ hay trong thân

cây.

- Một số độc tố có thể gây bệnh ở người → ít khả năng.

- Không có khả năng tự nhân lên và kém bền vững dưới

các tác động vật lý và hóa học.

- Hiện tượng kháng Bt.