nuôi cấy mô tế bào thực vật trong in vitro

Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, p

Chủ đề:

NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO THỰC VẬT TRONG IN

VITRO

L ịch sử nuôi c y nuôi c y ấ ấ

-Giai đoạn khởi xướng( 1898- 1930):

Haberlandt(1902) là người đầu tiên đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế

bào thưc vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào dựa trên thuyết tế bào của Schleiden-Schwann

Giai đoạn nghiên cứu sinh lý(1930-1950):

Bắt đầu với công trình của White(1934) nuôi cấy thành công rễ cà chua trên

môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose, dịch chiết nấm men

1935 Thimann đã phát hiện ra auxin(IAA) trong mô thực vật Nhiều nhà

nghiên cứu đã sử dụng IAA cùng các vitamin bổ sung vào môi trương nuôi cấy đã thu được kết quả tốt

Những năm 1940 nhiều chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm IAA được tổng

hợp thành công và được sử dụng nhiều trong nuôi cấy kết quả cho thấy chất này có tác dụng kích thích tạo mô sẹo, phân chia tế bào

Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái(1950-1960 )

1954-1955 Skoog phát hiện kinentin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào

1956 Skoog và Miller tìm hiểu ảnh hưởng của tỉ lệ Auxin/Cytokinin trong môi

trường nuôi cấy đến sự hình thành cơ quan và tạo được chồi từ lá cây thuốc lá

1960 Bergman đã tái sinh tế bào đơn thuốc lá trong môi trường lỏng

Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô tế bào vào công nghệ sinh học thực

vật(1960 đến nay)

1960 Cooking đã dùng enzym cellulase phân huỷ vỏ cellulose của tế bào thực vật thu

được tế bào không vỏ gọi là tế bào trần

1968 Nakata và Tanaka tạo được cây thuốc lá đơn bội bằng cách nuôi cấy bao phấn

Từ 1977 Melchers dung hợp tế bào trần giữa khoai tây và cà chua thành công tạo ra

cây lai khoai tây-cà chua

Từ năm 1980 hàng loạt nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học đã được công

bố

Ngày nay nuôi cấy mô tế bào không những là cơ sở quan trọng của công nghệ sinh

học hiên đại mà còn là công cụ quan trong trong chon tạo nhân giống, đóng góp cơ sơ ly luận mới cho sinh học hiên đại

KHÁI NIỆM

Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo

thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm

CƠ SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO

- Tế bào bất kì của cơ thể

simh vật nào cũng mang toàn bộ lượng thông tin

di truyền cần thiết và đủ của sinh vật đó,khi gặp điều kiện thích hợp mỗi

tế bào đều có thể phát triển thành cá thể hoàn chỉnh

 Tùy từng tế bào, từng

loại mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà

các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (do

cơ chế điều hòa hoạt động của gen).

 S Ự Ự PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PH N PHÂN HOÁ C A PHÂN CHIA, PHÂN HOÁ, PH N PHÂN HOÁ C A Ả Ả Ủ Ủ

CÔNG NGH NUÔI C Y MÔ-T BÀO Ệ Ấ Ế

CÔNG NGH NUÔI C Y MÔ-T BÀO Ệ Ấ Ế

 Phân hóa: 1 t b o,1kh i t b o : 1 t b o,1kh i t b o ế à ế à ố ế à ố ế à phân hóa t o mô c phân hóa t o mô c ạ ạ ơ ơ

quan h c quan ệ ơ

quan h c quan ệ ơ

 Ph n phân hóa Ph n phân hóa ả ả : khi các t b o ã phân hóa th nh các mô : khi các t b o ã phân hóa th nh các mô ế à đ ế à đ à à

ch c n ng riêng bi t nh ng v n có th quay v tr ng thái ứ ă ệ ư ẫ ể ề ạ

ch c n ng riêng bi t nh ng v n có th quay v tr ng thái ứ ă ệ ư ẫ ể ề ạ

ch c n ng phôi sinh ban ứ ă đầ u khi g p i u ki n thu n l i ặ đ ề ệ ậ ợ

ch c n ng phôi sinh ban ứ ă đầ u khi g p i u ki n thu n l i ặ đ ề ệ ậ ợ

CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BẢO THÀNH CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI

CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT :

C¸c ®iÒu kiÖn cÇn thiÕt cña nu«i

Môi tr ờng hoá học

Hầu hết các loại môi tr ờng nuôi cấy mô và tế bào thực vật

đều bao gồm:

Các loại muối khoáng đa l ợng và vi l ợng, nguồn cacbon, vitamin, các chất điều hoà sinh tr ởng, các nhóm chất b ổ sung, ch t n ấ độ …

C¸c nguyªn tè kho¸ng ®a l îng.

-Nit¬ (N): d¹ng NO-3 vµ NH+4 riªng rÏ hoÆc phèi hîp víi

-S¾t (Fe): thiÕu s¾t tÕ bµo mÊt kh¶ n¨ng ph©n chia

-Mangan (Mn): ThiÕu Mn kÐm ph©n bµo

- Bo (B): ThiÕu B trong m«i tr êng g©y nªn biÓu hiÖn nh thõa

auxin v× thùc tÕ Bo lµm cho c¸c chÊt øc chÕ auxin

oxydase trong tÕ bµo gi¶m M« nu«i cÊy cã biÓu hiÖn m« sÑo ho¸ m¹nh, nh ng th êng lµ lo¹i m« sÑo xèp, mäng

n íc, kÐm t¸i sinh.

Cây in vitro sống chủ yếu theo ph ơng thức dị d ỡng, mặc dù d ới ánh sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nh ng bị

hạn chế cho nên việc đ a vào môi tr ờng nuôi cấy nguồn các bon d ới dạng hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối

Tuỳ thuộc mục đích và sự đòi hỏi của từng hệ mô có thể dùng các loại đ ờng khác nhau: Sucrose, Maltose, Glucose, Galactose và Lactose Hàm l ợng đ ờng bổ sung vào môi tr ờng nuôi cấy th ờng là 20 - 40 g/l

Các vitamin.

Các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro đều có khả năng tự tổng hợp đ ợc hầu hết các loại vitamin, nh ng th ờng không đủ về l ợng nên phải

bổ sung thêm từ bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin nhóm B

- Vitamin B1 (thiamin) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi

cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxy hoá khử cacbon ở axit hữu cơ Nồng độ th ờng dùng từ 0,1- 10 mg/l

- Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin Nồng độ dùng từ 0,1 - 1 mg/l

-Myo - inositol cần đ ợc bổ sung một l ợng khá lớn từ 50 - 500 mg/l và tỏ ra

có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của mô

- Các chất bổ sung:

Bao gồm n ớc dừa,dịch chiết nấm men,chất độn…

Bao gồm n ớc dừa,dịch chiết nấm men,chất độn…

Nguồn cacbon

Các chất điều hoà sinh trưởng

 Chất điều hoà sinh trưởng gồm có các phytohormone và

các chất điều chỉnh sinh trưởng tổng hợp nhân tạo.

 Phytohormone là các chất hoá học được thực vật tổng

hợp với một lượng rất nhỏ ở các bộ phận, cơ quan nhất định và được vận chuyển đến các cơ quan, bộ phận khác

để điều hoà các quá trình sinh lý trong cây, đảm bảo mối quan hệ hài hoà giữa các cơ quan, bộ phận.

Auxin

Auxin - hormone kích

tr ưở ng

học giống với IAA:

cây tách rời.

khác tượng tự như hoạt tính của IAA.

 Kích thích s hình th nh,s sinh tr Kích thích s hình th nh,s sinh tr ự ự à à ự ự ưở ưở ng c a qu v t o q a ng c a qu v t o q a ủ ủ ả à ạ ả à ạ ủ ủ

không h t ạ

không h t ạ

 Gây ra tính h Gây ra tính h ướ ướ ng ng độ độ ng c a cây,kìm hãm s r ng lá,hoa,qu ng c a cây,kìm hãm s r ng lá,hoa,qu ủ ủ ự ụ ự ụ ả ả

 Trong cây Trong cây đượ đượ c t ng h p mô non, c t ng h p mô non, ổ ổ ợ ở ợ ở đặ đặ c bi t lá ang phát c bi t lá ang phát ệ ệ đ đ

tri n v vùng nh sinh tr ể à đỉ ưở ng

tri n v vùng nh sinh tr ể à đỉ ưở ng

 Hiện đã xác định được 136 GA, chúng có cấu trúc

hoá học khác nhau song có đều có bộ khung

gibberellase

GAn, trong đó GA3 là loại được phân tích cấu trúc

đầu tiên, đây cũng là loại GA có hoạt tính mạnh và

được ứng dụng rộng rãi.

Gibberellin - chất điều hoà phân chia

tế bào thực vật

Trao đổi gibberellin

bằng con đường terpenoid trong lạp bào, sau đó được biến đổi hoá học trong lưới nội chất và tế bào chất cho tới khi hoàn thiện cấu trúc

Cơ chế

Sự sinh trưởng kéo dài của thân:

– GA kích thích sự kéo dài của tế bào (không bằng cơ chế

sinh trưởng acid như auxin), tuy nhiên trong thực tế GA luôn xuất hiện cùng auxin  có thể tác dụng kéo dài của

GA phụ thuộc vào auxin.

– GA kích thích sự phân chia tế bào bằng cách khởi động

một số gene CDK (cyclin-dependent protein kinase) có

vai trò trong điều hoà chu trình tế bào (chuyển tế bào từ pha G1 sang pha S).

Hiệu quả sinh lý

Kích thích sự sinh trưởng kéo dài của thân (được xác định do vai trò của GA1)

Sinh trưởng các đột biến lùn (thiếu gene chịu

trách nhiệm tổng hợp enzyme trong con đường tổng hợp GA)

Hiệu quả sinh lý

Kích thích sự nảy mầm của hạt, củ

Kích thích sự vươn dài của các gióng cây họ lúa

Cytokinin - chất điều hoà phân chia

tế bào thực vật

 Về cấu trúc, đa số cytokinin có dạng purine được

thay thế N tại vị trí C6

Zeatin

 cytokinin là những dẫn xuất từ tARN thực vật, chúng được

tổng hợp trong hệ rễ, rồi được vận chuyển không phân

cực trong xylem lên ngọn Ngoài ra chúng còn được tổng hợp ở chồi, lá non, quả non, tầng phát sinh…

 cytokinin trong thực vật có thể ở dạng tự do hoặc liên kết,

chúng nhanh chóng bị chuyển hoá nhờ các enzyme

oxidase thành adenine rồi theo con đường chuyển hóa

adenin để tái sử dụng trong cơ thể hoặc phân giải thành sản phẩm cuối cùng là urea.

Điều hoà sự phân hóa cơ quan

Chọn vật liệu nuôi cấy

Tạo chồiKhử trùng

Tạo rễCấy cây vào môi tr ờng thích ứng

Sơ đồ : quy trình nhân giống bằng nuôi cấy mô TB

Quy trình tổng quát công nghệ nuôi

cấy mô tế bào thực vật in-vitro

- Đỉnh chồi, đỉnh rễ : là bộ phận non, dễ tham gia vào quá trình phân hoá và phản phân hoá tạo nên cơ thể mới.Th ờng ít nhiễm bệnh.

B ớc 1: Chọn vật liệu nuôi cấy

B íc 2 : Khö trïng

Buång khö trïng

B íc 2 : Khö trïng

B íc 3 : T¹o chåi

Khèi callus chuÈn bÞ t¹o c©y con C©y con míi ®ang h×nh thµnh

B íc 3 : T¹o chåi

- §Ó c©y cã thÓ ph¸t triÓn th©n cµnh

- C¾m vËt liÖu nu«i cÊy trong m«i tr êng dinh d ìng cã

bæ sung thªm xytokinin ho¹t ho¸ t¹o chåi.

B íc 4 : T¹o rÔ

sang MT t¹o rÔ §ã lµ MT dinh d ìng thÝch hîp bæ sung chÊt KT auxin, IBA…

T¹o rÔ

B íc 5 :CÊy c©y vµo m«i tr êng thÝch øng

- Chuyển cây sang MT thích ứng gần giống với MT tự nhiên về: nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng

yếu Nếu trồng trực tiếp vào MT tự nhiên cây sẽ dễ nhiễm bệnh và chết.

B ớc 5 :Cấy cây vào môi tr ờng thích ứng

B íc 6: Trång c©y trong v ên ¬m

nh©n nhanh SX.

Quy tr×nh nh©n gièng Lan b»ng nu«i cÊy m« in-vitro

Các ph ươ ng th c nuôi c y ứ ấ

• Nuôi c y mô th c v t trên môi tr Nuôi c y mô th c v t trên môi tr ấ ấ ự ậ ự ậ ườ ườ ng c ng ng c ng ứ ứ

• Nuôi c y huy n phù t bào Nuôi c y huy n phù t bào ấ ấ ề ề ế ế

Nuôi cấy mô tế bào thực vật trên môi

trường cứng

 Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu mô

nuôi cấy

Vật liệu nuôi cấy: Chủ yếu là những khối mô

và cơ quan tách rời:mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng,mảnh lá,

Các bước tiến hành:

+ Lựa chọn vật liệu + Khử trùng vật liệu nuôi cấy + Cấy vào môi trường mẫu + Nhân nhanh chồi

+ Chuyển sang môi trường tạo rễ,tạo cây hoàn chỉnh

Tái sinh chồi gián tiếp qua

giai đoạn mô sẹo(callus)

+Lựa chọn vật liêu +Khử trùng vật liệu nuôi cấy +Vào mẫu môi trường:

Không bật chồi trực tiếp

mà tạo mô sẹo hoặc protocom Nhân nhanh mô sẹo hoặc

protocom Cho mô sẹo hoặc protocom tái sinh tạo chồi

+Nhân nhanh chồi +Tạo rễ tạo cây hoàn chỉnh +Đưa cây ra môi trường ngoài

Nuôi cấy huyền phù tế bào

Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào chứa các tế bào và các khối tế bào, sinh trưởng phân tán trong môi trường lỏng Thường được khởi đầu bằng cách đặt các khối

mô callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) Nuôi cấy dịch huyền phù vì thế là sự tiến triển

từ thực vật đến mẫu vật, tới callus, và cuối cùng tới dịch huyền phù Nuôi cấy dịch huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối của tế bào thực vật so với nuôi cấy callus, do nuôi cấy dịch huyền phù có thể duy trì và được thao tác tương

tự với các hệ thống lên men vi sinh vật được ngập chìm trong môi trường lỏng

Các phương pháp nuôi cấy

Xác định tốc độ sinh trưởng tế bào

+Xác định số lượng tế bào: Đếm dưới kính hiển vi

*Lấy 1 thể tích dịch thể nhất định có chứa tế bào

* Tách riêng rẽ các tế bào bằng dd cloromium trioxide ( 5-10% W/v ), đồng thời đun nóng ở 700C trong 5’-10’ đủ để gây ra sự phân tách các tế bào nhưng chưa làm phân huỷ tế bào,sau đó làm nguội và lắc mạnh

* Pha loãng huyền phù tế bào đến nồng độ phù hợp,nhuộm và đếm trong buồng đếm tế bào

Từ đó tính được số tế bào trong 1ml dd cấy

+ Xác định thể tích tế bào:

Lấy ngẫu nhiên 1 lượng thể tích nuôi cấy dd huyền phù sau đó đem

ly tâm (thường 200 vòng/p ) trong 5’,thu lấy tế bào rồi đo thể tích của tổng khối tế bào

+Xác định khối lượng tế bào khô,tươi : Ứng dụng đẻ thu chất thứ cấp

Ý nghĩa khoa học

- Tạo ra 1 quần thể cây con đồng đều giữ nguyên đặc

tính của cây mẹ

- Hệ số nhân nhanh cao

- Rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất và phát

huy được hiệu quả kinh tế

- Nhân được số lượng cây lớn trong 1 diện tích nhỏ

- Đảm bảo các cây giống sạch bệnh

- Cây con được tạo ra nuôi cấy mô được trẻ hoá cao

độ

- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển

- Bảo quản cây giống thuận lợi

Một số ứng dụng trong thực tiễn

Làm sạch virut qua nuôi cấy mô phân sinh đỉnh

*Nguyên lý:

- Nồng độ virut giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng do:

+ virut không vận chuyển được trong mô phân sinh đỉnh

+ Các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sự sao chép

thông tin di truyền cua virut

+ Hệ thống vô hiệu hoá virut ở mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các

vùng khác

+ Nồng độ auxin cao ngăn cản quá trình sao chép của virut

*Các kĩ thuật làm sạch virut in vitro

+ Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh : Bao gồm các phương pháp:

- Nuôi cấy mô phân sỉnh đỉnh kết hợp với xử lí ở nhiệt độ cao

- Nuôi cấy mô phân sỉnh đỉnh kết hợp với xử lí hoá chất

- Kĩ thuật vi ghép

Chọn dòng biến dị soma

Cơ sở chọn dòng biến dị soma: là chỉ tất cả các biến dị thể

hiện ở các tế bào,mô nuôi cấy,cây có nguồn gốc từ nuôi cấy

mô tế bào

Gồm 2 nhóm chính: Biến dị kiểu gen và biến dị kiểu hình

Các nguyên nhân gây biến dị dòng soma

+ Sự đa dạng di truyền tự nhiên của các tế bào nuôi cấy

+ Phương thức nhân giống in vitro

+ Loại và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng sử dụng

+ Thời gian nuôi cấy và số lần cấy chuyển

Phương pháp chọn dòng biến dị soma

+ Chọn trực tiếp