Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh côn trùng đề kiểm soát rệp hại rau

Năm 2000, giá trị thương mại của thuốc diệt côn trùng sinh học được sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng.. Trong khuôn khổ đề tài hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ XUÂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM

KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

VŨ XUÂN ĐẠT

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG NẤM LECANICILLIUM

KÍ SINH CÔN TRÙNG ĐỂ KIỂM SOÁT RỆP HẠI RAU

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI

Hà Nội - 2011

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Rệp hại cây trồng 2

1.1.1 Đặc điểm sinh học 2

1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới 5

1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học 8

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng 8

1.2.2 Ưu và nhược điểm 9

1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học 11

1.3.1 Phân loại 11

1.3.2 Ưu và nhược điểm 12

1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng 13

1.3.4 Khả năng kiểm soát rệp hại cây trồng của nấm Lecanicillium 17

1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng 18

1.5 Ảnh hưởng của môi trường lên sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium 19

1.5.1 Nguồn carbon 19

1.5.2 Nguồn nitơ 20

1.5.3 Nhiệt độ môi trường 21

1.5.4 Độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất 21

1.5.5 Một số yếu tố khác 21

2 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 23

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 23

2.1.1 Chủng giống và plasmid 23

2.1.2 Hóa chất 23

2.1.3 Dung dịch và đệm 24

2.1.5 Thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao 25

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử 27

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của chủng nấm 485 29

3 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực cao 32

3.2 Định tên chủng nấm 485 34

3.3 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của L lecanii 485 36

3.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất 36

3.3.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ các thành phần cơ chất 37

3.3.3 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất 37

3.3.4 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất 39

3.3.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ 40

3.3.6 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ 41

3.3.7 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 42

3.3.8 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 43

3.3.9 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 44

3.3.10 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng 45

3.3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men 46

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC BẢNG

Trang Bảng 1.1 Thiệt hại một số cây trồng do rệp ở Vương quốc Anh 5Bảng 2.1 Các dung dịch và đệm 24Bảng 2.2 Các thiết bị 25

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cấu tạo ngoài của rệp 2

Hình 1.2 Rệp hại cây trồng 3

Hình 1.3 Vòng đời của rệp 4

Hình 2.1 Lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm 26

Hình 3.1 Kết quả phun bào tử nấm lên rệp cải 32

Hình 3.2 Độc lực diệt rệp của 7 chủng Lecanicillium spp 33

Hình 3.3 Điện di đồ DNA nhân gene 28S rRNA 34

Hình 3.4 Trình tự gene 28S rRNA của chủng 485 (A) và cây phân loại (B) 35

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nguồn cơ chất 36

Hình 3.6 Ảnh hưởng của tỉ lệ bột lõi ngô/bột ngô trong môi trường 37

Hình 3.7 Ảnh hưởng của độ dày cơ chất 38

Hình 3.8 Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất 39

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ 40

Hình 3.10 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ vô cơ 41

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 42

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nồng độ MgSO4 44

Hình 3.13 Ảnh hưởng của nồng độ KH2PO4 45

Hình 3.14 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng 46

Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian lên men 47

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

PCR Polymerase chain reaction

SDS Sodium dodecyl sulfate

MỞ ĐẦU

Rệp (Aphidoidae) là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất trên thế giới, phân bố rộng rãi ở các vùng ôn đới, cận nhiệt đới và nhiệt đới Chúng kí sinh trên hơn 11000 loài cây thuộc 243 họ khác nhau, trong đó có nhiều cây trồng quan trọng như bông, cải, cải dầu, các loại đậu, cà chua, khoai tây, ngũ cốc [39] Rệp không chỉ phá hoại trực tiếp bằng cách chích hút nhựa cây mà còn truyền virus gây bệnh cho cây Hàng năm, rệp cùng với các côn trùng khác gây thiệt hại 15% sản lượng cây trồng trên toàn thế giới [22] Do tính chất nguy hại của rệp, việc sử dụng các biện pháp phòng trừ rệp là cần thiết

Biện pháp phòng trừ rệp phổ biến nhất cho đến nay vẫn là sử dụng thuốc diệt côn trùng hóa học Mặc dù có ưu điểm là phổ tác dụng rộng và hiệu quả tác dụng nhanh, nhưng thuốc hóa học ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn trùng sau một thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Với ưu điểm vượt trội về độ thân thiện với môi trường,

hệ sinh thái và sức khỏe con người, thuốc diệt côn trùng sinh học được coi là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hướng phát triển nền nông nghiệp bền vững

Lecanicillium là chi nấm có khả năng kí sinh tự nhiên trên rệp và nhiều loài

côn trùng khác Từ những năm 1960, trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên

cứu ứng dụng Lecanicillium để diệt rệp bảo vệ cây trồng, nhiều sản phẩm đã được

sản xuất và thương mại hóa Tuy nhiên, kết quả đạt được trong nghiên cứu và sử dụng thuốc diệt côn trùng sinh học còn hạn chế Năm 2000, giá trị thương mại của thuốc diệt côn trùng sinh học được sử dụng trên toàn thế giới chỉ chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng Vì vậy, việc tăng cường nghiên cứu phát

triển các chế phẩm diệt rệp từ nấm Lecanicillium là cần thiết

Trong khuôn khổ đề tài hợp tác quốc tế của Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, viện Công nghệ Sinh học, viện KH và CN Việt Nam năm 2010-2013 do Bộ

Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ quản, tôi thực hiện đề tài: "Nghiên

cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh côn trùng để kiểm soát rệp hại rau"

1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Rệp hại cây trồng

1.1.1 Đặc điểm sinh học

Rệp (Aphidoidae) là một họ lớn thuộc lớp côn trùng, là các động vật không xương sống, cơ thể chia thành ba phần (đầu, ngực, bụng), có ba cặp chân phân đốt, mắt kép và một cặp râu, cơ thể được bao bọc bởi bộ khung kitin, chiều dài từ 1 đến

10 mm (hình 1.1) Khoảng 3700 loài rệp đã được biết đến trên thế giới [39]

Hình 1.1 Cấu tạo ngoài của rệp

Rệp là nhóm côn trùng chích hút nhựa cây phổ biến nhất thế giới, phân bố tập trung nhất ở các vùng ôn đới [51], rệp cũng phân bố khá phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt với độ đa dạng thấp hơn Khoảng 250 loài rệp là côn trùng phá hoại nguy hiểm đối với nông, lâm nghiệp cần được kiểm soát Tuy nhiên, đứng trên quan điểm động vật học, rệp là nhóm động vật thích nghi tốt với môi trường nhờ khả năng sinh sản vô tính [67]

Phần lớn rệp có thân mềm, màu xanh, đen, nâu, hồng hoặc hầu như không màu (hình 1.2) Phương thức dinh dưỡng của rệp là chích hút nhựa cây bằng miệng

có cấu tạo kiểu chích hút Khi chất dinh dưỡng của cây trở nên nghèo nàn hoặc mật

độ rệp quá đông, một số loài rệp sinh ra con có cánh để phát tán đi nơi khác Nhiều

Đuôi Ống tiết Mắt

persicae (rệp đào) có thể kí sinh trên hàng trăm loài cây thuộc nhiều họ khác nhau

Khi chích hút, chúng truyền virus từ cây bệnh sang cây khỏe mạnh ở một số cây trồng như: khoai tây, ngũ cốc, củ cải đường, cam, quýt [36] Những vết chích hút bởi rệp trở thành nơi bị tổn thương dễ dàng bị nấm xâm nhập và gây bệnh cho cây

Hình 1.2 Rệp hại cây trồng

Myzus persicae (A và B), Aphis gossypii (C) và Aphis illinoisensis (D)

Ở rệp có cả hai kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính Nhiều loài có sự thay đổi giữa kiểu sinh sản đơn tính và hữu tính khá phức tạp Sự thay đổi giữa hai kiểu sinh sản để sinh ra trứng hoặc ấu trùng, thay đổi giữa cây chủ thân gỗ và cây chủ thân thảo Khoảng 10% loài rệp thay đổi kiểu sinh sản để thích nghi với sự thay đổi cây chủ [51]

Mặc dù một số ít loài rệp có cả con đực và con cái, nhưng chỉ con cái có trong quần thể Vào mùa đông, khi nhiệt độ thấp trứng được sinh ra, mùa xuân trứng nở thành rệp cái Dạng sinh sản phổ biến ở rệp là đơn tính và sinh con, rệp con sinh ra có các đặc điểm giống hệt rệp mẹ ngoại trừ kích thước Quá trình sinh con lặp đi lặp lại trong suốt mùa hè, sinh ra nhiều thế hệ, thời gian sống của mỗi thế

hệ từ 20 đến 40 ngày, từ một rệp cái nở vào mùa xuân có thể sinh ra hàng nghìn rệp

con Chẳng hạn, rệp bắp cải (Brevicoryne brassicae) có thể sinh ra 41 lứa rệp con

trong mùa sinh sản

Hình 1.3 Vòng đời của rệp [75]

Vào mùa thu, khi có sự thay đổi về cường độ chiếu sáng, nhiệt độ, sự giảm sút về nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn, rệp cái sinh ra cả rệp đực và rệp cái con Đặc điểm di truyền của rệp đực giống hệt rệp mẹ ngoại trừ việc ít hơn một nhiễm sắc thể giới tính Rệp con hữu tính có thể thiếu cánh, thậm chí thiếu vòi chích hút [51] Khi trưởng thành, rệp cái giao phối với rệp đực rồi đẻ trứng Trứng sống sót qua mùa đông khắc nghiệt rồi nở ra thành rệp cái có cánh hoặc không cánh (hình 1.3) Tuy nhiên, ở những môi trường ấm áp như vùng nhiệt đới hoặc trong nhà kính, rệp có thể sinh sản vô tính qua nhiều năm [36]

Một số loài rệp có thể sinh ra rệp cái có cánh vào mùa hè khi nguồn thức ăn hoặc chất lượng thức ăn giảm sút Rệp cái có cánh di cư để sinh ra một quần thể mới trên cây chủ mới, thường là khác loài với cây chủ ban đầu Ví dụ như rệp táo

(Aphis pomi), sau khi sinh ra nhiều thế hệ rệp cái không cánh trên cây chủ điển hình

Mùa Đông

Mùa Hè Mùa Xuân

Mùa Thu

Rệp cái ban đầu

Rệp cái vô tính không cánh

Rệp cái vô tính

có cánh

Rệp cái vô tính sinh ra rệp hữu tính

Rệp cái không cánh Rệp đực *

* có cánh hoặc không cánh

Trứng đình dục

thể sinh sản "lồng", khi rệp cái mẹ sinh ra rệp cái con thì rệp cái con cũng chuẩn bị sinh ra thế hệ tiếp theo đã có trong cơ thể nó Cách sinh sản này có thể ảnh hưởng đến kích thước của rệp và tốc độ sinh sản tăng lên [28], [59]

Phần lớn rệp có thân mềm nên chúng dễ dàng bị giết bởi nhiều kẻ thù tự nhiên như bọ rùa ăn rệp, ong bắp cày kí sinh, ấu trùng muỗi kí sinh, nhện cua,

vi khuẩn, virus, các loài nấm kí sinh côn trùng Neozygites fresenii, Entomophthora,

Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae và Lecanicillium lecanii

1.1.2 Tình hình rệp hại cây trồng trên thế giới

Sản lượng nông nghiệp thế giới hàng năm bị thiệt hại khoảng 15% do côn trùng [22], ở Mỹ là 13% [63] Mặc dù chưa có thống kê chính thức về thiệt hại nông nghiệp do rệp nhưng trong số 300 loài côn trùng gây hại nghiêm trọng [54] thì có đến 250 loài là rệp Chúng là tác nhân chính gây hại ở nhiều loại cây trồng quan trọng như bông, đậu tương, hướng dương, củ cải đường, khoai tây, ngô, ngũ cốc và

rau cải Nhiều loài rệp có khả năng kí sinh trên nhiều loại cây khác nhau như Aphis

gossypii, Myzus persicae và Aphis craccivora

Theo thống kế của Tatchell (1989), rệp phá hoại nhiều loại cây trồng ở Vương quốc Anh Sản lượng bị thiệt hại thường ở mức 4-10%, và có thể lên đến 46% ở cây đậu (bảng 1.1) Ước tính giá trị thiệt hại lên đến 70 triệu bảng Anh

Aphis gossypii (rệp bông) kí sinh trên 700 loại cây khác nhau trên toàn thế

giới, bao gồm nhiều cây quan trọng như dưa hấu, dưa chuột, bí xanh, bí ngô, ớt,

cam và quýt Một trong những cây chủ bị A gossypii phá hoại nhiều nhất là cây bông vải (Gossypium hirsutum), thuộc nhóm cây công nghiệp quan trọng nhất thế

giới Theo Xia (1997), sản lượng bông hàng năm ở Trung Quốc bị thiệt hại 10-15%

và chủ yếu là do A gossypii [83] Với sản lượng bông của Trung Quốc năm 2011 là

7,4 triệu tấn (http://www.cotton.org/econ/cropinfo/cropdata/rankings.cfm) thì con

số thiệt hại có thể lên đến 0,8-1,2 triệu tấn

Bảng 1.1 Thiệt hại một số cây trồng do rệp ở Vương quốc Anh [78]

Loại cây Rệp gây hại Dạng gây hại Sản lượng bị

thiệt hại (%)

Metopolophium dirhodum

Phá hoại Phá hoại

9,7-12,5

13

Myzus persicae

Phá hoại Phá hoại

5,7 4,4

Đậu tương là loại hạt dầu được trồng nhiều nhất thế giới [5], nhưng năng

suất bị đe dọa nghiêm trọng bởi A glycines (rệp đậu tương) Sản lượng hạt bị thiệt

hại ước tính khoảng 34% [72], theo tính toán của Catangui và cộng sự (2009), con

số thiệt hại thậm chí lên đến 48-72% Nguyên nhân do rệp chích hút có thể làm giảm 50% tốc độ quang hợp của lá cây [18]

Đậu đũa (Vigna unguiculata) là loại cây được trồng nhiều ở châu Phi, ước

tính sản lượng hàng năm ở khu vực này khoảng 3,36 triệu tấn Không giống bông

vải bị phá hoại chủ yếu bởi A gossypii, đậu đũa bị phá hoại bởi nhiều loại rệp như

A craccivora, A leguminosae, A laburni, A fabae, Myzus persicae và cả

A gossypii Ở những khu vực không có biện pháp bảo vệ, sản lượng thiệt hại có thể

lên đến 20-100% [60]

Lipaphis erysimi (rệp cải dầu) kí sinh trên một số loài cây nhưng chủ yếu là

các loại cải và cải dầu Ngoài ra nó còn kí sinh trên cà chua và bí xanh Ở phía đông

của miền trung Ấn Độ, L erysimi cùng với M persicae và Brevicoryne brassicae là

phá hoại nhiều nhất, riêng nó gây thiệt hại 35,4-91,3% sản lượng [15], [76] Theo

nghiên cứu của Patel và cộng sự (2004), nếu không có biện pháp bảo vệ, L erysimi

có thể gây thiệt hại 80,6-97,6% sản lượng cải dầu [61] Trong một nghiên cứu khác,

Razaq và cộng sự (2011) đã chỉ ra rằng, Brevicoryne brassicae và L erysimi cũng

gây thiệt hại 75,1-81,9% sản lượng cải dầu ở Multan, Punjab, Pakistan [69] Ngoài

cải dầu, B brassicae còn phá hoại nhiều cây quan trọng khác như, súp lơ, cà rốt và

củ cải

Myzus persicae kí sinh trên hàng trăm loại cây thuộc 40 họ khác nhau Các

cây này phân bố rộng khắp thế giới, nhiều cây phân bố ở những vùng khá lạnh như atisô, củ cải, bắp cải, cà rốt, súp lơ, ngô, su hào, cải dầu Củ cải đường, cà chua,

khoai tây cũng là những cây chủ bị M persicae phá hoại [35]

Aphis craccivora (rệp đậu lăng) cũng là một loại rệp kí sinh trên nhiều cây

chủ khác nhau Ngoài cây đậu đũa, chúng còn phá hoại nhiều cây khác như bông, táo, cà rốt, rau diếp, lúa mì, đậu lăng Hossain và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về

thiệt hại do A craccivora gây ra trên cây đậu lăng, sản lượng bị thiệt hại cao nhất

lên đến 9% [40] Cũng trong nghiên cứu này, sản lượng đậu lăng đã tăng 0,91-9,89% khi áp dụng biện pháp diệt rệp hoặc gieo trồng tránh rệp Ước tính

A craccivora còn gây thiệt hại 12,8-61,1% sản lượng đậu răng ngựa (Vicia faba) ở

Sids ARS, Beni-Suef Governorate, miền Trung Ai Cập [25]

Rệp làm giảm năng suất cây trồng không chỉ do phá hoại trực tiếp mà còn do

truyền virus gây bệnh A craccivora truyền virus gây bệnh rụng lá ở đậu lăng, đậu răng ngựa, đậu gà [44], [58] M persicae là loại nguy hiểm nhất trong 10 loại rệp

truyền virus gây bệnh rụng lá ở cây khoai tây [57], [77] Rệp truyền virus gây bệnh khảm có thể làm thiệt hại 60% năng suất dưa chuột [79]

Không những phá hoại rau và cây công nghiệp, rệp còn là côn trùng nguy

hiểm đối với cây lương thực Diuraphis noxia (rệp lúa mì Nga) chuyên phá hoại lúa

mì, lúa mạch đen, lúa mạch trắng, yến mạch Theo nghiên cứu của Akhtar và cộng

sự (2010), năng suất lúa mì có thể bị giảm 7,9-34,2% do D noxia phá hoại [7]

Như vậy, với nguy cơ làm giảm năng suất cây trồng của rệp, yêu cầu phải có biện pháp kiểm soát rệp để bảo vệ mùa màng là cấp thiết Biện pháp kiểm soát rệp

và các loại côn trùng khác được áp dụng chủ yếu trong nhiều thập kỷ qua là sử dụng hóa chất diệt côn trùng tổng hợp Cho đến nay, đây vẫn là biện pháp được sử dụng chủ yếu, đặc biệt là ở các nước đang phát triển

1.2 Thuốc diệt côn trùng hóa học

1.2.1 Tình hình sản xuất và sử dụng

Thuốc diệt côn trùng (thuốc trừ sâu) chiếm tỉ lệ lớn trong thuốc bảo vệ thực vật Chúng có nguồn gốc tự nhiên hoặc được tổng hợp hoàn toàn trong các nhà máy hóa chất, được sử dụng trong nông nghiệp để bảo vệ cây trồng, hoặc phi nông nghiệp để tiêu diệt các vectơ truyền bệnh cho người và vật nuôi như ruồi, muỗi

Từ 2000 năm trước công nguyên con người đã biết sử dụng thuốc diệt côn trùng có nguồn gốc tự nhiên để bảo vệ mùa màng [52], nhưng việc sử dụng chỉ trở nên phổ biến khi các hóa chất diệt côn trùng được tổng hợp dễ dàng trong các nhà máy hóa chất, đặc biệt là sau khi Paul Hermann Müller khám phá ra khả năng diệt côn trùng mạnh mẽ của DDT vào năm 1939 Từ 1945 đến 1975, lượng thuốc bảo vệ thực vật được sản xuất ở Mỹ tăng 40 lần, từ 15,9 nghìn tấn/năm lên 636,3 nghìn tấn/năm Năm 1975, ước tính toàn thế giới đã sản xuất 1,7 triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật với giá trị thương mại khoảng 3,9 tỉ đô la Mỹ, trong đó thuốc diệt côn trùng chiếm 32% [71]

Năm 1997 toàn thế giới sử dụng 2,58 triệu tấn thuốc bảo vệ thực vật với giá trị 37,0 tỉ đô la Mỹ, trong đó thuốc diệt côn trùng chiếm 0,67 triệu tấn với giá trị 11,6 tỉ đô la Mỹ [11] Năm 2001 các con số trên lần lượt là 2,29 triệu tấn; 31,8 tỉ đô

la Mỹ; 0,57 triệu tấn; 8,8 tỉ đô la Mỹ [45] Và năm 2007 là 2,37 triệu tấn; 39,4 tỉ đô

la Mỹ; 0,40 triệu tấn; 11,2 tỉ đô la Mỹ [31]

Ở Việt Nam, lượng thuốc diệt côn trùng được sử dụng càng ngày càng tăng:

từ 10300 tấn lên 33000 tấn vào đầu những năm 1990, đến năm 2003 tăng lên 45000 tấn và năm 2005 là 50000 tấn (http://www.donre.hochiminhcity.gov.vn)

Mặc dù thế giới đã cố gắng cắt giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật được sử dụng nhưng kết quả đạt được còn hạn chế Khối lượng thuốc bảo vệ thực vật được

sử dụng trên toàn thế giới năm 2007 so với năm 1997 chỉ giảm 8% Tuy nhiên, kết quả đạt được với thuốc diệt côn trùng tương đối khả quan, trong cùng thời gian trên khối lượng thuốc diệt côn trùng được sử dụng đã giảm 40%

1.2.2 Ưu và nhược điểm

Ưu điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học là dễ sản xuất ở quy mô lớn với giá thành rẻ, phổ tác dụng rộng với độc lực mạnh và hiệu quả tác dụng nhanh Tuy

nhiên, chúng ngày càng bộc lộ rõ những nhược điểm như nhanh bị kháng bởi côn

trùng, gây ô nhiễm đất, nguồn nước và không khí, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người

Thuốc bảo vệ thực vật nói chung và thuốc diệt côn trùng nói riêng được sử dụng tràn lan làm cho các loài gây hại biến đổi nhanh chóng và kháng thuốc Hiệu quả của viêc sử dụng thuốc ngày càng thấp ngược lại với chi phí ngày càng cao [17] Ước tính có khoảng 520 loài côn trùng, 150 loài vi sinh vật gây bệnh cây và

273 loài cỏ dại đã kháng lại thuốc (http://www.nd.edu/%01chem191/e2.html)

Một số thuốc diệt côn trùng có thời gian phân hủy lâu, sau khi được phun cho cây trồng sẽ thẩm thấu một phần vào đất và các mạch nước ngầm Các chất này khi đã ngấm vào đất, vào nước ngầm sẽ tồn tại lâu dài vì trong đất có rất ít vi sinh vật phân hủy chúng và mỗi năm chỉ 1% lượng nước ngầm được hồi phục Điều đáng lo ngại là nhu cầu nước ngọt của một nửa dân số thế giới được đáp ứng từ nước ngầm [19], do đó nguy cơ bị ngộ độc thuốc diệt côn trùng rất cao

Một lượng thuốc diệt côn trùng sau khi được sử dụng trên đồng ruộng sẽ theo kênh thoát nước đi vào các thủy vực Tại đây chúng giết chết các sinh vật phù

du, làm giảm nguồn cung cấp thức ăn cho cá hoặc giết chết cá, làm giảm sút nguồn lợi thủy sản Trong trường hợp cá bị nhiễm độc nhưng không chết sẽ gây độc gián tiếp cho người ăn phải

Thuốc diệt côn trùng tổng hợp có độc lực mạnh, phổ tác dụng rộng cũng có nghĩa là có tính chọn lọc kém Chúng không chỉ tiêu diệt các côn trùng gây hại mà còn tiêu diệt cả những loài có ích như động vật ăn côn trùng, các loài kí sinh côn trùng hại cây trồng [65], tiêu diệt ong mật và côn trùng thụ phấn cho cây làm cho nhiều cây trồng thụ phấn nhờ côn trùng giảm năng suất và chất lượng [56]

Thuốc diệt côn trùng được sử dụng nhằm mục đích tăng năng suất cây trồng, nhưng đôi khi nó lại làm giảm năng suất Điều này xảy ra khi các chất này ức chế sự phát triển bình thường của cây trồng, thuốc được phun cho các cây trồng mục tiêu nhưng lại bị phát tán do gió gây thiệt hại cho những cây trồng ở vùng lân cận, nông sản bị đổ bỏ vì dư lượng hóa chất độc hại vượt mức cho phép [64] Bên cạnh đó, đất trồng trọt có độ tơi xốp cao nên thuốc diệt côn trùng dễ ngấm vào đất Trong đất có nhiều loài sinh vật cần thiết cho hệ sinh thái đất trồng như động vật chân đốt, động vật nguyên sinh, giun đất, nấm, vi khuẩn [66] Thuốc diệt côn trùng sẽ gây độc và làm đảo lộn hệ sinh thái đất, dẫn đến giảm năng suất cây trồng

Việc lạm dụng thuốc diệt côn trùng làm cho thực phẩm bị nhiễm độc [87] gây ngộ độc cấp tính hoặc mạn tính cho người sử dụng Trên thế giới, hàng năm có khoảng 26 triệu trường hợp bị ngộ độc (không tử vong) thuốc bảo vệ thực vật [70] (trong đó có thuốc diệt côn trùng), 750 nghìn trường hợp ngộ độc mạn tính, 3 triệu trường hợp phải nhập viện và 200 nghìn trường hợp tử vong [34]

Ở Việt Nam, khoảng 15-20 triệu người thường xuyên phơi nhiễm với thuốc bảo vệ thực vật (http://ca.cand.com.vn) Theo báo cáo của Cục Y tế dự phòng và Môi trường - Bộ Y tế, năm 2009 có 4515 trường hợp bị nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật trong đó có 138 trường hợp tử vong (http://www.thuocbietduoc.com.vn) Con số trên mới chỉ là kết quả thống kê được đối với các trường hợp đã nhập viện

Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, người phơi nhiễm thuốc trừ sâu và các loại thuốc bảo vệ thực vật tổng hợp khác có thể tăng nguy cơ mắc các bệnh như rối loạn cảm giác, rối loạn trí nhớ [34], hen suyễn, viêm xoang mạn tính, viêm phế quản mạn tính [82], rối loạn chức năng tinh hoàn hoặc vô sinh [20], đột biến gene [41],

u lympho không Hodgkin [38], bệnh máu trắng, ung thư da, ung thư thực quản, ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến và bàng quang [8], [14] Thời gian phơi nhiễm càng nhiều thì nguy cơ mắc các bệnh này càng tăng lên

Vì những nhược điểm của thuốc diệt côn trùng hóa học, xu hướng chung trên thế giới hiện nay là không sử dụng thuốc diệt côn trùng hoặc sử dụng thuốc có nguồn gốc sinh học để thay thế dần nhằm phát triển nền nông nghiệp bền vững

1.3 Thuốc diệt côn trùng nguồn gốc sinh học

1.3.1 Phân loại

Thuốc diệt côn trùng, thuốc diệt cỏ, thuốc trừ bệnh được gọi chung là thuốc diệt hại Thuốc diệt hại sinh học là các chế phẩm có nguồn gốc sinh học Chúng là các cơ thể sống như vi khuẩn, nấm, động vật hay các chất được tách chiết từ sinh vật như protein, các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật Theo EPA, Hoa Kỳ (2011), thuốc diệt hại sinh học được chia thành ba nhóm chính (http://www.epa.gov):

1 Thuốc diệt hại có nguồn gốc vi sinh vật: thành phần có hoạt lực diệt hại là các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus hoặc động vật nguyên sinh) Thuốc diệt hại nguồn gốc vi sinh vật được dùng để kiểm soát nhiều loại gây hại khác nhau như côn

trùng, cỏ dại Protein độc của vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) hay các sản phẩm

trao đổi chất khác của vi sinh vật cũng thuộc nhóm này

2 Các yếu tố bảo vệ được chuyển vào thực vật (plant incorporated protectants, PIPs): là các chất diệt hại thực vật vốn không sản xuất được, nhưng do nhận được gene ngoại lai nên thực vật có khả năng sản sinh ra để tự bảo vệ gene

mã hóa protein độc của B thuringensis là một ví dụ điển hình được chuyển vào thực

1.3.2 Ưu và nhược điểm

Mặc dù có một số nhược điểm như giá thành sản xuất còn cao, hoạt lực

không mạnh bằng hóa chất tổng hợp, hiệu lực tác dụng chậm, hiệu quả bị ảnh

hưởng nhiều bởi các điều kiện ngoại cảnh, nhưng với các ưu điểm vượt trội so với

hóa chất tổng hợp về độ thân thiện với môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người, các chế phẩm sinh học ngày càng được nhận được nhiều sự quan tâm trong nghiên cứu và sản xuất để sử dụng trong nông nghiệp

Các chế phẩm sinh học tác dụng có chọn lọc, mỗi chế phẩm chỉ tác dụng lên một hay một số loài côn trùng nhất định, không hoặc chỉ gây ảnh hưởng đến một số

ít thiên địch và các sinh vật có ích khác Do vậy, các hệ sinh thái được phun các chế phẩm này không bị xáo trộn, đảm bảo sự ổn định bền vững của đất trồng trọt Chế phẩm khi phát tán sang các khu vực lân cận cũng không gây ảnh hưởng tiêu cực đến cây trồng ở đó

Các chế phẩm chứa yếu tố diệt côn trùng là vi sinh vật có khả năng duy trì hiệu quả kéo dài, chúng không chỉ tiêu diệt lứa côn trùng đang phá hoại mà còn lây nhiễm trên côn trùng từ thế hệ này sang thế hệ khác

Do có tác dụng chọn lọc đến côn trùng gây hại, các chế phẩm sinh học sẽ không được sử dụng tràn lan, do vậy nguy cơ kháng thuốc của côn trùng sẽ được

giảm thiểu, mỗi chế phẩm được sử dụng trong thời gian lâu hơn làm giảm chi phí nghiên cứu sản xuất các chế phẩm mới thay thế

Các chế phẩm sinh học có thành phần chính là các cơ thể sống hoặc có nguồn gốc từ cơ thể sống, chúng dễ bị phân hủy thành các chất không độc sau một thời gian ngắn sử dụng, không làm ô nhiễm đất, nước, không khí Vì các chế phẩm này đã được chọn lọc để tác dụng đến từng loài côn trùng nhất định, trong trường hợp các cơ thể sống từ chế phẩm còn tồn tại được trên các nông sản cũng không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người Nếu phát tán vào các thủy vực, các chế phẩm này ít gây ảnh hưởng xấu đến các sinh vật ở đó và do vậy không làm giảm giá trị khai thác nguồn lợi thủy sản cũng như sự cân bằng của hệ sinh thái

1.3.3 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng

Hầu hết các loài côn trùng gây hại đều có thể bị nhiễm bệnh bởi các vi sinh vật [54] Trong tự nhiên, hiện tượng các vi sinh vật nhiễm bệnh và kiểm soát số lượng côn trùng là phổ biến, ví dụ như bọ xít hại vải, nhãn bị nhiễm tự nhiên và bị

giết bởi nấm Beauveria bassiana Đó chính là cơ sở khoa học vững chắc cho việc

nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học diệt côn trùng

A Thế giới

Sự đóng góp đặt nền móng cho xu hướng kiểm soát côn trùng bằng vi sinh vật là của Mechnikoff (1879) và Krassilnikow (1888), khi lần đầu tiên trình bày các

nghiên cứu về khả năng sử dụng nấm kí sinh côn trùng Metarrhizium anisopliae để

diệt côn trùng gây hại ngũ cốc và củ cải đường Năm 1914, lần đầu tiên d’Herelle thử nghiệm kiểm soát côn trùng bằng vi khuẩn [54] Cho đến năm 2001, có khoảng

195 yếu tố diệt hại sinh học (bao gồm thuốc diệt côn trùng) đã được đăng kí với

780 sản phẩm khác nhau (http://www.epa.gov)

ENomita và Azaguard Tech là các chất được chiết từ thực vật ENomita chứa chất furoflavone chiết từ cây karanjin tác dụng lên ve bét và các côn trùng chích hút Azaguard Tech là chế phẩm chiết từ hạt neem, tác dụng lên hơn 400 loài côn

trùng khác nhau nhưng không ảnh hưởng đến côn trùng có lợi Các chất này kiểm soát sự sinh trưởng và do đó kiểm soát số lượng côn trùng

Bacillus thuringensis là một trong những vi khuẩn được sử dụng để kiểm

soát côn trùng sớm nhất Năm 1901, Ishiwatari phát hiện ra một loại vi khuẩn gây

bệnh chết đột ngột ở tằm và đặt tên là Bacillus sotto Năm 1911, Berliner phát hiện

ra vi khuẩn này giết chết mọt bột mì và đặt tên lại là Bacillus thuringensis Chế phẩm từ B thuringensis (thường được gọi là Bt) bắt đầu được sử dụng để diệt côn

trùng từ năm 1920 (http://www.bt.ucsd.edu/bt_history.html) Bt được đăng kí để sử dụng làm thuốc diệt côn trùng lần đầu tiên ở Mỹ từ năm 1961, và được đăng kí lại vào năm 1998 (http://npic.orst.edu/ingred/aifact.html) Năm 2007, Ahmad và cộng

sự (2007) đã so sánh khả năng diệt rệp của Bt với một số hóa chất tổng hợp Kết quả cho thấy, Bt làm giảm 70% số lượng rệp, xấp xỉ với hiệu quả của các hóa chất này [6]

Cho đến nay, có một số sản phẩm Bt thương mại như Able™, Biobit®, Cutlass™, Dipel®, Foray®, Javelin®, Thuricide®, Vectobac® đã được sử dụng để bảo vệ cây trồng Larvorid là sản phẩm chứa protein độc của

B thuringiensis, tác dụng lên mọt và ruồi trắng Khi ăn phải độc tố của

B thuringensis, côn trùng không tiêu hóa được thức ăn và chết.

Gindin và cộng sự (2006) đã nghiên cứu khả năng diệt mọt cọ

Rhynchophorus ferrugineus của Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana

Kết quả cho thấy, sau 1 tuần M anisopliae diệt được 100% ấu trùng trong khi

B bassiana diệt được 80-82% ấu trùng và trứng của mọt cọ [29]

Kim và cộng sự (2001) sử dụng B bassiana và Verticillium lecanii để kiểm soát rệp bông Aphis gossypii Kết quả cho thấy chủng B bassiana CS-1 diệt được 50% rệp sau 4,6-4,7 ngày và sau 5 ngày diệt được 64-75% Chủng V lecanii

CS-625 diệt rệp tốt hơn, diệt được 50% rệp chỉ sau 2,7-3,3 ngày và diệt được

97-100% sau 5 ngày V lecanii cũng được sử dụng để kiểm soát ruồi trắng

Trialeurodes vaporariorum Sau 7 ngày phun, ruồi trắng bị diệt 98% ở 25°C, xấp

xỉ 80% ở 15°C và 35°C bởi chủng V lecanii CS-626 [47]

Lecanicillium muscarium trong nghiên cứu của Cuthbertson và cộng sự

(2010) đã được làm tăng hiệu quả diệt bướm khoai lang (Bemisia tabaci) nhờ phụ

gia Từ dung dịch bào tử nấm chỉ diệt được xấp xỉ 60%, sau khi được trộn thêm dầu

và phụ gia, hỗn hợp này diệt được 95% B tabaci [21] Trong nghiên cứu của Park

và cộng sự (2010), chủng Lecanicillium sp 4078 diệt được trứng, ấu trùng và con trưởng thành của B tabaci với các tỉ lệ lần lượt là 77,68 ± 12,01%, 75,55 ± 6,68%

và 93,33 ± 11,55% Còn trong nghiên cứu của Guclu và cộng sự (2010),

L muscurium có thể diệt 60-75% bướm Ricania simulans sau 7 ngày phun [32]

Nấm kí sinh không chỉ được nghiên cứu để diệt côn trùng gây hại cây trồng,

mà còn được nghiên cứu để diệt các côn trùng kí sinh truyền bệnh cho người và vật nuôi Angelo và cộng sự (2010) đã nghiên cứu khả năng kiểm soát rận

Rhipicephalus microplus của L lecanii Trong hỗn hợp với phụ gia, bào tử nấm

L leacnii diệt được 97,6% R microplus trước khi rận kịp đẻ trứng [9] Bukhari và

cộng sự (2011) nghiên cứu khả năng kiểm soát ấu trùng muỗi Anopheles truyền bệnh sốt rét của Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae Hỗn hợp bào tử

của hai chủng nấm này diệt được 39-50% ấu trùng muỗi [16]

Trên thế giới hiện đã có nhiều chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm kí sinh côn trùng được thương mại hóa Theo thống kê của de Faria và cộng sự (2007),

có ít nhất 12 loài (hoặc dưới loài) nấm được ứng dụng để sản xuất chế phẩm diệt

côn trùng Sản phẩm dựa trên B bassiana (33,9%), M anisopliae (33,9%),

Lecanicillium spp (9,4%), Isaria fumosorosea (5,8%), và B brongniartii (4,1%) là

phổ biến nhất trong số 171 sản phẩm được thống kê Trong đó 75% số sản phẩm đã được thương mại hóa, 15% hiện không còn được sử dụng và 10% hiện chưa biết thông tin [23]

Beevicide và LarvoEnd là hai trong số các sản phẩm thương mại chứa bào tử

B bassiana Đích tác dụng là sâu đục thân, sâu đục quả, bọ trĩ, sâu cuốn lá, bướm

đêm TermoENd chứa M anisopliae, tác dụng lên mối, kiến, bọ cánh cứng hại mía,

ấu trùng hại rễ cây và ruồi quả Grubkill và Bioter là các chế phẩm chứa cả nấm kí sinh côn trùng và vi khuẩn, tác dụng lên các côn trùng chích hút, sâu đục thân và

côn trùng thân cứng Biomite: chứa hỗn hợp của V lecanii và một số sinh vật kí

sinh khác, tác dụng lên ve bét phá hoại mùa màng Cơ chế diệt côn trùng của các chế phẩm này: Nấm tiết ra enzyme phân giải biểu bì côn trùng, sợi nấm đâm vào cơ thể côn trùng, kí sinh, hình thành bào tử và giết chết côn trùng sau 5-7 ngày phun Liều sử dụng: 250 ml chế phẩm (2×108 CFU/ml) cho 4000 m2 cây trồng

B Việt Nam

Ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về khả năng diệt côn trùng của vi sinh vật Võ Thị Thu Oanh và cộng sự (2007) đã nghiên cứu khả năng diệt

sâu khoang hại rau cải của M anisopliae Kết quả chủng nấm này diệt được trên

70% sâu khoang sau 7 ngày phun [2] Ho và cộng sự (2010) nghiên cứu khả năng

diệt rầy nâu trên lúa của M anisopliae Kết quả là 74,8-84,3% rầy nâu bị diệt trong

khi chi phí chỉ bằng 24,4% so với sử dụng hóa chất tổng hợp [37] Phạm Thị Thùy

và cộng sự (2005) đã nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi nấm sử dụng Beauveria và Metarhizium để phòng trừ sâu hại đậu tương và đậu xanh [3], Nguyễn Dương Khuê (2005) đã sử dụng M anisopliae để phòng trừ mối

nhà [1]

Mặc dù đã được nghiên cứu từ gần 100 năm qua, nhưng việc ứng dụng các chế phẩm diệt côn trùng sinh học trong nông nghiệp vẫn còn hạn chế Tổng lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng năm 2000 trên toàn thế giới có giá trị thương mại khoảng 160 triệu đô la Mỹ (chiếm 1,8% tổng giá trị của các loại thuốc diệt côn trùng), trong đó riêng chế phẩm Bt chiếm hơn 90% Tuy nhiên, việc ứng dụng các chế phẩm sinh học sẽ tăng trưởng mạnh trong tương lai Ở châu Âu và

Mỹ, nhiều chế phẩm mới có phổ tác dụng rộng đã được thương mại hóa và lượng bán ra tăng theo từng năm Ngoài ra, nhiều dự án và nghiên cứu đang được thực

thuringensis, B popilliae, V lecanii, M anisopliae, Beauveria bassiana và Paecilomyces Theo dự báo của công ty tư vấn Chuck Benbrook, chế phẩm sinh học

được sử dụng sẽ tăng 5-7,5 lần sau năm 2013 (http://eng.coa.gov.tw), [45]

1.3.4 Khả năng kiểm soát rệp hại cây trồng của nấm Lecanicillium

Lecanicillium là chi nấm kí sinh côn trùng thuộc ngành nấm túi Ascomycota,

lớp Sordariomycetes, bộ Hypocreales, họ Clavicipitaceae Lecanicillium trước đây được gọi là Verticillium lecanii [85] Cùng trong họ Clavicipitaceae với chi nấm

Lecanicillium còn có một chi nấm kí sinh côn trùng khác là Metarhizium

Lecanicillium có khả năng kí sinh tự nhiên và giết chết nhiều loại côn trùng

như rệp, ruồi trắng, bộ cánh đều, bộ cánh cứng, bộ cánh thẳng, bướm [12], [30],

[33], [43], [53] Cơ chế diệt côn trùng của Lecanicillium dựa trên sự tiếp xúc trực

tiếp của bào tử với côn trùng Sau khi bám trên vỏ côn trùng (chitin), các bào tử nảy mầm rồi tiết enzyme (chitinase, proteinase) phân hủy lớp biểu bì, kết hợp với áp lực nảy mầm của bào tử nấm giúp sợi nấm đâm sâu vào các khoang trong cơ thể Tại đây, sợi nấm tiết các enzyme (proteinase, lipase, chitinase) thủy phân các mô, tiết các độc tố nấm gây độc thần kinh cho côn trùng Kết quả là côn trùng bị tổn thương,

bị đa nhiễm bởi Lecanicillium và các vi sinh vật gây bệnh khác Sau khi côn trùng

chết, nấm tiếp tục phát triển và sinh bào tử bên ngoài cơ thể côn trùng và có thể lây truyền bệnh cho côn trùng khác [54]

Vu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium spp phân lập từ rệp Myzus persicae để kiểm soát M persicae và Aphis gossypii Trong điều kiện phòng thí nghiệm, 100% M persicae và A gossypii đã bị diệt sau 4-5 ngày phun Trong nhà kính, A gossypii đã bị diệt 78% sau 14 ngày phun

Trong một nghiên cứu khác, Kim và cộng sự (2008) đã sử dụng

L attenuatum CNU-23 để kiểm soát M persicae Trong phòng thí nghiệm,

L attenuatum CNU-23 diệt được 50% rệp sau 3,7 ngày phun và 80% sau 7 ngày

phun Khi thử nghiệm trên cây ớt được trồng trong nhà kính, chủng nấm này diệt được 72-97% rệp sau 12 ngày phun [46]

Năm 2009, Diaz và cộng sự đã khảo sát độc lực của L lecanii đối với một số loài rệp Kết quả là chủng này diệt được 95% M persicae, trong khi sản phẩm

thương mại Vertalec® chỉ diệt được 91,6% [24]

Có nhiều sản phẩm diệt côn trùng có nguồn gốc từ Lecanicillium đã được

thương mại hóa Một số sản phẩm tiêu biểu như Vertalec, Verelac, Mycotal, Enverto Liều sử dụng: 250 ml chế phẩm (2×108 CFU/ml) cho 4000 m2 cây trồng Côn trùng chết sau 5-7 ngày phun Các chế phẩm này không chỉ có tác dụng lên rệp

mà còn tác dụng lên nhiều loại côn trùng khác như ruồi trắng, bọ trĩ, ve bét

Mặc dù tiềm năng kiểm soát các côn trùng gây hại cây trồng của nấm

Lecanicillium rất lớn, nhưng việc nghiên cứu ứng dụng Lecanicillium để bảo vệ cây

trồng cũng như kết quả đạt được còn hạn chế, nhất là ở Việt Nam Hiệu quả diệt côn

trùng của chế phẩm Lecanicillium cũng như các chế phẩm sinh học khác còn kém,

khối lượng chế phẩm diệt côn trùng sinh học được sử dụng mới chỉ chiếm tỉ trọng thấp trong tổng khối lượng các loại thuốc diệt côn trùng Do vậy, việc tăng cường

nghiên cứu phát triển chế phẩm diệt côn trùng từ nấm Lecanicillium là cần thiết

1.4 Sản xuất bào tử nấm kí sinh côn trùng

Để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng trước tiên phải có bào tử nấm kí sinh côn trùng Việc lựa chọn phương pháp lên men và tối ưu các điều kiện lên men là cần thiết để sản xuất được nhiều bào tử với hiệu quả kinh tế cao Hiện nay có hai phương pháp lên men phổ biến nhất là lên men lỏng và lên men rắn

Phương pháp lên men lỏng có ưu điểm là dễ pha môi trường lên men với độ đồng nhất cao, có thể tiếp giống liên tục và đơn giản, dễ dàng kiểm soát pH Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là yêu cầu thiết bị và vận hành phức tạp, đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các thông số trong quá trình lên men, sử dụng nhiều năng lượng và nước, nhiều nước thải, khó xử lí khi bị tạp nhiễm và có nguy cơ phải

bỏ đi hỗn hợp lên men trong một bồn lên men lớn, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành lớn [68] Bênh cạnh đó, bào tử thu được nhanh chóng mất khả năng sống sót

Phương pháp lên men rắn mặc dù có một số nhược điểm là khó khăn trộn môi trường lên men, môi trường lên men có độ đồng nhất không cao, khó tiếp giống

và phải tiếp giống theo từng đợt, việc kiểm soát pH khá phức tạp, độ ẩm cơ chất liên tục thay đổi trong quá trình lên men, khả năng truyền nhiệt của cơ chất kém Nhưng

nó có nhiều ưu điểm quan trọng như yêu cầu thiết bị và vận hành đơn giản, có thể tận dụng các nguồn cơ chất không tan trong nước và sản phẩm phụ của nông nghiệp với chi phí thấp (tinh bột, cellulose, lignin, pectin), bề mặt lên men rộng nên dễ trao đổi nhiệt và không khí, không đòi hỏi kiểm soát nghiêm ngặt các thông số trong quá trình lên men, tiêu thụ ít nước và năng lượng, ít nước thải, dễ dàng kiểm soát sự tạp nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị và vận hành rẻ [68]

Từ những ưu điểm và nhược điểm của hai phương pháp lên men, phương pháp lên men rắn được coi là phương pháp phù hợp cho việc sản xuất bào tử nấm để phối trộn với phụ gia tạo thành chế phẩm [42] Phương pháp lên men rắn được áp

dụng để lên men các chi nấm kí sinh côn trùng như Beauveria, Metarhizium,

Trichoderma và Lecanicillium [68], [74], [81]

Trong quá trình lên men, cũng giống như các nấm khác, sự sinh bào tử của

Lecanicillium chịu ảnh hưởng chủ yếu của một số yếu tố như nguồn cơ chất, nguồn

carbon và nitơ bổ sung, chất khoáng, nhiệt độ, độ ẩm, độ thoáng khí và ánh sáng

1.5 Ảnh hưởng của môi trường lên sự sinh bào tử của nấm Lecanicillium

1.5.1 Nguồn carbon

Cùng với nitơ, chất khoáng và nước, carbon là một trong bốn yếu tố không thể thiếu đối với mọi loài nấm cũng như vi sinh vật Tuy nhiên, nồng độ carbon trong môi trường quá cao cũng có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật

Gao và cộng sự (2009) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ carbon trong môi trường lên sự sinh bào tử của một số chủng nấm Kết quả cho thấy, nồng độ

carbon tốt nhất cho khả năng sinh bảo tử của chủng nấm Lecanicillium lecanii CA-1-G và M anisopliae RS-4-1 là 4 g/l, Paecilomyces lilacinus IPC-P là 1 g/l,

P lilacinus M-14 là 2 g/l, Metarhizium anisopliae SQZ-1-21 là 16 g/l, Trichoderma viride TV-1 là 2 g/l [27]

Trong thực tế, nguồn carbon được sử dụng có thể là glucose, lactose, bột ngô, bột gạo, bột mì Trong trường hợp nguồn carbon là bột ngũ cốc thì ngoài khả năng cung cấp cacbon, chúng còn cung cấp cả nitơ, chất khoáng và giữ luôn vai trò

là giá thể Shi và cộng sự (2009) đã dùng bột ngô, cám mì là nguồn carbon để sản

xuất bào tử nấm Verticillium lecanii [74] Feng và cộng sự (2000) đã dùng gạo và cám gạo để sản xuất bào tử nấm V lecanii [26] Pham và cộng sự (2010) đã sử dụng gạo làm nguồn carbon để sản xuất bào tử nấm Beauveria bassiana [62]

1.5.2 Nguồn nitơ

Nitơ được cung cấp từ nhiều nguồn khác nhau như muối ammonium, muối nitrate, peptone, cao nấm men, bột đậu tương hay chitin Nguồn nitơ nào phù hợp cho sự sinh bào tử tùy thuộc vào từng chủng nấm Nồng độ nitơ tối ưu cho sự sinh bào tử của nấm còn phụ thuộc vào tỉ lệ của nó so với cacbon

Trong nghiên cứu về sự ảnh hưởng của tỉ lệ C:N lên sự sinh bào tử của một

số chủng nấm, Gao và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng tỉ lệ C:N phù hợp cho chủng

nấm Lecanicillium lecanii CA-1-G, Paecilomyces lilacinus IPC-P và Metarhizium

anisopliae RS-4-1 là 5:1, P lilacinus M-14 và Trichoderma viride TV-1 là 10:1,

M anisopliae SQZ-1-21 là 80:1 [27] Tuy nhiên, trong môi trường có nguồn dinh

dưỡng tự nhiên là bột ngũ cốc, peptone, cao nấm men thì rất khó kiểm soát được hàm lượng nitơ cũng như tỉ lệ C:N

Shi và cộng sự (2009) đã dùng cao nấm men, peptone, bột đậu tương làm

nguồn carbon để lên men Verticillium lecanii, kết quả là chủng nấm này sinh bào tử

cao nhất với nguồn nitơ là cao nấm men [74] Vu và cộng sự (2008) đã chọn được KNO3 với nồng độ 0,6% làm nguồn nitơ phù hợp cho sự sinh bào tử của

Lecanicillium lecanii 41185 [81]

1.5.3 Nhiệt độ môi trường

Dựa vào khoảng nhiệt độ thích nghi, vi sinh vật được chia ra thành 3 nhóm Nhóm ưa lạnh sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dưới 15°C, nhóm ưa ấm sinh trưởng tốt ở 20-37°C, nhóm ưa nhiệt sinh trưởng và phát triển tốt ở trên 50°C Phần lớn nấm là

vi sinh vật ưa ấm, phát triển tốt nhất ở 25-30°C

Nấm Lecanicillium spp trong nghiên cứu của Kope và cộng sự (2008) sinh trưởng tốt nhất ở 25°C [49] Chủng L lecanii 41185 trong nghiên cứu của Vu và

cộng sự (2008) sinh bào tử cao nhất ở 25°C [81] Trong khi trong nghiên cứu của

Arevalo và cộng sự (2009), L psalliotae sinh trưởng tốt nhất ở 30°C [10]

1.5.4 Độ ẩm không khí và độ ẩm cơ chất

Nước là yếu tố không thể thiếu đối với mọi sinh vật nói chung và nấm nói riêng bởi vì tất cả phản ứng sinh hóa ở các cơ thể sống đều diễn ra trong môi trường nước Nhìn chung, nấm có thể sinh trưởng trong giới hạn độ ẩm khá rộng, nấm sinh trưởng được trên gạo có độ ẩm 20% hay trong môi trường dinh dưỡng lỏng hoàn toàn Tuy nhiên, mỗi loài nấm đòi hỏi độ ẩm tối ưu khác nhau, trên mỗi loại cơ chất thì độ ẩm tối ưu cho nấm phát triển cũng khác nhau

Theo Vu và cộng sự (2008), chủng L lecanii 41185 sinh bào tử cao nhất ở

độ ẩm không khí 75% và độ ẩm cơ chất 28,5% [81] Trong nghiên cứu của Shi và

cộng sự (2009), Verticillium lecanii được lên men ở độ ẩm không khí 97%, độ ẩm

cơ chất là 7 ml nước/2 g bã mía [74] Trong thí nghiệm của Xu và cộng sự (2011),

V lecanii cũng được lên men ở độ ẩm cơ chất 7 ml nước/2 g bã mía, nhưng độ ẩm

không khí là 95% [84]

1.5.5 Một số yếu tố khác

Trong môi trường lên men rắn, nguồn cơ chất tự nhiên như bột gạo, bột ngô, bột đậu tương, lõi ngô ngoài khả năng cung cấp các chất dinh dưỡng (cacbon, nitơ,

khoáng), chúng còn ảnh hưởng đến sự sinh bào tử của Lecanicillium vì mỗi nguồn

cơ chất sẽ tạo độ thoáng khí, khả năng trao đổi nhiệt cho môi trường lên men khác

nhau Trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009), Verticillium lecanii sinh bào tử

trên cơ chất bã mía tốt hơn trên cơ chất cám mì [74] Từ nhiều nguồn cơ chất như cám mì, gạo, trấu, than bùn, gạo trộn cám gạo, gạo trộn bột mì, gạo trộn gạo tấm,

Vu và cộng sự (2008) đã chọn được gạo là nguồn cơ chất tốt nhất để lên men

Lecanicillium sản xuất bào tử [81]

Mặc dù chất khoáng có mặt khá đầy đủ trong các môi trường giàu hay môi trường tự nhiên nhưng tùy thuộc vào thành phần môi trường mà hàm lượng chất

khoáng khác nhau và có thể không tối ưu cho việc sinh bào tử của Lecanicillium Trong nghiên cứu của Vu và cộng sự (2008), chủng L lecanii 41185 sinh bào tử cao

nhất khi môi trường được bổ sung 0,6% KNO3 và 0,02% MgSO4 [81] Chủng

V lecanii trong nghiên cứu của Shi và cộng sự (2009) lại sinh bào tử cao nhất khi

môi trường được bổ sung 0,163% KH2PO4, 0,0325% K2HPO4 và 0,0325% MgSO4[74]

Một số yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sự sinh bào tử của nấm

Lecanicillium như pH, độ thoáng khí hay ánh sáng

2 Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị

2.1.1 Chủng giống và plasmid

Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 do

Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH và CN Việt Nam cung cấp

Chủng E coli DH5α (Invitrongen, Mỹ) được sử dụng để nhân plasmid

Plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas, Litva) kích thước 2974 bp, có T7 promoter, gene kháng kháng sinh ampicillin (Ampr)

Rệp hại rau lấy trên rau cải ngoài đồng ruộng sau đó được nuôi trên cải thảo trong phòng thí nghiệm Dựa trên các đặc điểm hình thái và cây chủ, rệp này bước

đầu được nhận định thuộc loài Myzus persicae

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm đều ở dạng tinh khiết: Agarose

từ Rockland (Mỹ); Tween 80, chloroform/isoamyl aclohol (24:1) của Merck (Đức);

Ethidium bromide, T4 ligase, Taq polymerase, protease K, RNase, enzyme giới hạn

của Fermentas (Litva); mồi của Invitrogen (Mỹ), ampicillin của Mekopha (Việt Nam)

Các hóa chất khác để pha môi trường: Peptone của Merck; cao nấm men của Difco (Mỹ); NaNO3, KNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, MgSO4, KH2PO4của Trung Quốc; glucose của Việt Nam

Một số vật liệu cần thiết khác như cải thảo, khoai tây, gạo, ngô, cám gạo, lõi ngô, bã mía được mua và thu thập tại khu vực Hà Nội

2.1.3 Dung dịch và đệm

Bảng 2.1 Các dung dịch và đệm

Dung dịch Thành phần, nồng độ

Dung dịch protease K 20 μg/ml protease K

Đệm tra mẫu DNA 5x 0,09% (w/v) Brommophenol Blue; 0,09% (w/v) xylene

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

Môi trường PD (potato dextrose) (g/l): 20, khoai tây, đun sôi cách thủy

2 giờ thu dịch chiết; 10, glucose; 5,7 KNO3

Môi trường PDA (potato dextrose agar): môi trường PD được bổ sung

20 (g/l) agar

Môi trường LB (Luria-Bertani) (g/l): 10, peptone; 5, cao nấm men;

10, NaCl; pH 7,5 Môi trường rắn được bổ sung 20 agar Môi trường chọn lọc khuẩn lạc mang plasmid được bổ sung 100 g/ml ampicillin

2.1.5 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học, Viện KH và CN Việt Nam (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Các thiết bị

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Sàng lọc chủng nấm có độc lực diệt rệp cao

Bảy chủng nấm Lecanicillium L18, L43, L85, 85k, 485, 8514 và L1185 được

nuôi cấy 7-10 ngày trên đĩa môi trường PDA ở 27-30°C, bào tử được thu trong dung dịch Tween 80 (0,05%) và được điều chỉnh về mật độ 3×108/ml

Lá cải thảo tươi, kích thước 10-15×20-25 cm, không bị bệnh, không bị rách được giữ tươi bằng cách đặt phần cuống lá vào đĩa agar-nước sau đó được đặt vào hộp nhựa trong suốt và cho phép không khí lưu thông dễ dàng 40 con rệp khỏe mạnh, kích thước trung bình được thả lên mặt trên lá cải Một ngày sau, rệp bò xuống mặt dưới lá, 30 con rệp khỏe mạnh được giữ lại, những con khác bị nhặt bỏ

20 ml dịch bào tử (mật độ 3×108/ml trong dung dịch 0,05% Tween 80 được phun đều dưới dạng sương cách 30 cm lên hai mặt lá (mẫu thí nghiệm) Dung dịch 0,05% Tween 80 được sử dụng để phun lên mẫu đối chứng Số rệp chết và sống sót được đếm qua từng ngày cho đến ngày thứ 7, ngày phun được tính là ngày 0 Nhiệt

độ và độ ẩm không khí được duy trì trong thời gian thí nghiệm lần lượt là 21-25°C

và 75-80% Thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần

Hình 2.1 Lá cải có rệp sau khi được phun dịch bào tử nấm

Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được đánh giá theo phương pháp của Abbott (1925) [4]:

+ LT50 (Lethal Time) là thời gian cần thiết để bào tử nấm gây chết 50% số lượng rệp Giá trị LT50 càng nhỏ thì độc lực của bào tử nấm đối với rệp càng mạnh

+ Độc lực gây chết rệp của bào tử nấm được tính theo công thức:

Kết quả sau đó được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần

2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Tách chiết DNA tổng số: Nấm 485 được nuôi cấy 96 giờ trong môi trường

PDA ở 30C, lắc 150 vòng/phút Dịch nuôi được ly tâm 4000 vòng/phút trong

10 phút Tủa sợi nấm được nghiền nhẹ trong nitơ lỏng rồi bổ sung 600 µl đệm phá

tế bào, lắc nhẹ, bổ sung tiếp 65 µl dung dịch lysozyme, ủ 37°C trong 45 phút Hỗn hợp sau đó được bổ sung 5 µl dung dịch protease K, ủ 2-3 giờ ở 56°C Bổ sung chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với tỷ lệ 1:1 và ly tâm 12000 vòng/phút trong

15 phút ở 4°C 500 µl dịch nổi được chuyển sang ống eppendorf mới và bổ sung isopropanol theo tỷ lệ 1:1, để ở -20°C trong 2 giờ Tủa sau khi ly tâm

12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C được làm khô dưới ánh sáng đèn sợi đốt và được bổ sung 500 µl ethanol 70% để rửa DNA, loại muối và isopropanol Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, tủa được làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE

và bảo quản ở -20°C

Khuếch đại gene bằng PCR: Để khuếch đại đoạn gene 28S rRNA từ chủng

nấm 485, cặp mồi NL1-F (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3') và NL4-R (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') được sử dụng

Nhiệt độ gắn mồi của cặp NL1 và NL4 là 50°C Hỗn hợp phản ứng PCR gồm: 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl dNTP; 1,5 µl MgCl2 25 mM; 2,5 µl đệm PCR 10x;

0,25 µl Taq; 1 µl khuôn DNA và bổ sung H2O cất tiêm lên tổng thể tích 25 µl

Phản ứng được thực hiện ở điều kiện: 95°C/4 phút, 35 chu kỳ (95°C/1 phút; 53°C/1 phút; 72°C/1 phút); 72°C/10 phút

Gắn sản phẩm PCR vào pJET1.2: Ủ hỗn hợp gồm 5 µl đệm 2x; 1,5 µl sản

phẩm PCR; 0,5 µl enzyme blunting; 2,5 µl H2O ở 70°C trong 15 phút Bổ sung 0,5 µl pJET1.2 và 0,5 µl T4 DNA ligase rồi ủ qua đêm ở 22°C

Biến nạp plasmid: Plasmid được biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5

theo phương pháp sốc nhiệt và hóa học Nguyên lý của phương pháp là E coli được

xử lý bằng CaCl2 giúp DNA dễ dàng bám dính vào màng tế bào, khi sốc nhiệt, các

lỗ màng tế bào mở rộng làm các chuỗi DNA đi vào dễ dàng

Chuẩn bị tế bào khả biến: Khuẩn lạc E coli được nuôi trong 2 ml LB lỏng,

lắc 200 vòng/phút ở 37°C qua đêm Nuôi lắc tiếp giống 1% ở 37°C trong 2-3 giờ đạt OD600nm 0,4-0,7 Dịch nuôi cấy để lạnh 30 phút cho ổn định rồi ly tâm thu tế bào

5000 vòng/phút trong 5 phút Tế bào được ủ lần 1 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong

1 giờ, ly tâm thu tế bào Rửa lần 2 với dung dịch 0,1 M CaCl2 trong 20 phút Tế bào

đã qua xử lý được hòa trong 100 l dung dịch 0,1 M CaCl2 để chuẩn bị biến nạp Các thao tác được thực hiện ở điều kiện 4°C

Biến nạp plasmid vào E coli: tế bào khả biến tươi hoặc lấy từ -80°C đã để

30 phút trong đá Hút 40 µl dịch tế bào khả biến và 5 µl dung dịch nối ghép gene vào một ống eppendorf mới, đảo nhẹ nhàng rồi ủ trong đá 30 phút Sau đó, hỗn hợp được sốc nhiệt 42°C trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt 5 phút trong đá Bổ sung

250 µl môi trường LB lỏng và nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37°C trong 1 giờ Cấy trải

100 µl dịch nuôi trên đĩa LB bổ sung ampicilin (100 µg/ml) Ủ ở 37°C qua đêm

Tách chiết plasmid: Mỗi khuẩn lạc đã được biến nạp mọc trên đĩa thạch

được nhặt cấy vào 1,5 ml môi trường LB chứa ampicillin (100 µg/ml), nuôi lắc

200 vòng/phút ở 37°C qua đêm Tủa tế bào thu được sau khi ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút được bổ sung 150 µl Sol I rồi lắc rung 30 giây tạo thành dịch đồng nhất Ủ dịch 15-20 phút ở nhiệt độ phòng, bổ sung 150 µl Sol II rồi đảo nhẹ, tiếp tục

bổ sung 150 µl Sol III vào hỗn hợp và đảo nhẹ Hỗn hợp được bổ sung 450 µl chloroform/isoamyl alcohol 24:1, lắc nhẹ và ly tâm 12500 vòng/phút trong 10 phút

450 µl pha trên được hút sang ống eppendorf mới, bổ sung 320 µl isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80°C để tủa plasmid Tủa plasmid thu được sau khi ly tâm

12500 vòng/phút trong 5 phút được rửa bằng 500 µl ethanol 70% ở 4°C để loại muối và isopropanol, làm khô trong không khí ở nhiệt độ phòng Tủa plasmid được hòa trong đệm TE pH 8 hoặc nước khử ion vô trùng và điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid rồi bảo quản ở -20°C

Cắt plasmid bằng enzyme giới hạn: Để kiểm tra dòng plasmid lựa chọn có

mang sản phẩm mong muốn hay không, plasmid tái tổ hợp từ các khuẩn lạc được

gồm 3 µl DNA plasmid tái tổ hợp; 0,5 µl enzyme giới hạn mỗi loại; 2 µl đệm Tango

Y+ và bổ sung nước cất tiêm đến 10 µl Sản phẩm cắt được điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra

Đọc trình tự nucleotide: Sau khi plasmid tái tổ hợp được tinh sạch, đoạn

DNA chèn vào plasmid được đọc trình tự nucleotide theo nguyên lý Sanger cải tiến dựa trên các dideoxy DNA polymerase xúc tác gắn các dideoxynucleotide vào đầu 3'-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3'-OH Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide có kích thước hơn kém nhau một nucleotide và được phát hiện bằng mẫu dò huỳnh quang trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer Vector pJET1.2 được gắn hai trình tự mồi xuôi và mồi ngược M13 (-20) để đọc trình tự phân đoạn chèn DNA ngoại lai

Kết quả đọc trình tự được phân tích, xử lý bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide, tính khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại

2.2.3 Xác định ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên sự sinh bào tử của

chủng nấm 485

Chủng nấm 485 được nuôi cấy trên môi trường PDA ở 27-30°C trong 7-10 ngày, sau đó một miếng nấm trên đĩa thạch (1×1 cm) được cấy vào bình nón chứa 100 ml môi trường PD lỏng và được nuôi lắc 150 vòng/phút ở 27-30°C Sau 4 ngày, dịch nuôi có mật độ bào tử 3-5×108/ml được cấy vào các bình nón

250 ml chứa cơ chất theo tỉ lệ 1 ml/10 g cơ chất

Sau khi lên men 10 ngày ở 27-30°C trong điều kiện tĩnh, bào tử được thu trong dung dịch 0,05% Tween 80 và được đếm dưới kính hiển vi quang học (độ phóng đại 640 lần) sử dụng buồng đếm hồng cầu Các thí nghiệm được lặp lại ít nhất 3 lần Kết quả được xử lí bằng phần mềm Microsoft office excel và phần mềm thống kê SAS