Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trồng cà phê trọng điểm

Mức độ nhiễm nấm mốc A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông Bảng 3.4: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 23 chủng Asperg

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxins

Bảng 1.2: LD50 của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24]

Bảng 1.3: Mức độ nhiễm ochratoxin A trong máu của người ở một số nước [24]

Bảng 1.4: Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng[25]

Bảng 1.5: Thời gian giảm 50% ochratoxin A trên lúa mỳ trong điều kiện nhiệt độ khác nhau [24]

Bảng 3.1 Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A trong đất trồng cà phê

Bảng 3.2 Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A trong rễ cây cà phê

Bảng 3.3 Mức độ nhiễm nấm mốc A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin

A trong đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông

Bảng 3.4: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 23 chủng Aspergillus niger đã phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên cơ chất ngô

Bảng 3.5: Khả năng tạo độc tố ochratoxin A của 12 chủng Penicillium viridicatum đã phân lập bằng phương pháp nuôi cấy trên cơ chất ngô

Bảng 3.6: Đặc điểm hình thái của chủng A.niger AN1 sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 28ºC

Bảng 3.7:Đặc điểm hình thái của chủng A.niger AN3 sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy trên môi trường PDA ở 28ºC

Bảng 3.8: Đặc điểm hình thái của chủng P1 trên môi trường PDA

Hình 3.3: Hình thái của chủng A.niger AN1

Hình 3.4: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN3

Hình 3.5: Bào tử của chủng A.niger AN4

Hình 3.6: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN12 trên môi trường PDA

Hình 3.7: Khuẩn lạc của chủng A.niger AN23 trên môi trường PDA

Hình 3.8: Bào tử của chủng P.viridicatum P1

Hình 3.9: Khuẩn lạc của chủng P.viridicatum P5

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

1.1 Đặt vấn đề ……… 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu……… 2

1.2.1 Mục tiêu……… 2

Chương 1: TỔNG QUAN……… 3

1.1 Hệ nấm mốc trên lương thực……… 3

1.1.1 Hệ nấm mốc ngoài đồng……… 3

1.1.2 Hệ nấm mốc bảo quản……… 3

1.2 Đại cương về độc tố nấm mốc……… 4

1.3 Ochratoxin A……… 6

1.3.1 Các loại độc tố ochratoxin……… 6

1.3.2 Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin A……… 7

1.3.3 Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc……… 8

1.3.4 Độc tính của ochratoxin A……… …… 8

1.3.5 Phương pháp phân tích……… 10

1.3.6 Tình hình nhiễm ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác ở thế giới và Việt Nam……… 11

1 3.7 Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và Việt Nam ……… 15

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU … ……… 19

2.1 Vật liệu……… 19

2.1.1 Đối tượng……… 19

2.1.2 Môi trường……… 19

2.1.3 Các hoá chất dùng cho phân tích độc tố ochratoxin A……… 20

2.1.4 Dụng cụ thí nghiệm……… 21

2.1.5 Thiết bị……… 21

2.2 Phương pháp……… 21

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố ochratoxin A……… 21

2.2.2 Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất và rễ cây cà phê………… 22

2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất trồng cà phê………….… 22

2.2.2.2 Phương pháp phân lập nấm mốc từ rễ cây cà phê……… 22

2.2.3 Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc……… 23

2.2.4 Phương pháp phân loại các loài nấm mốc……… 23

2.2.5 Phương pháp phân tích ochratoxin A……… 23

2.2.5.1 Chiết xuất……… 24

2.2.5.2 Làm sạch……… 24

2.2.5.3 Định tính và định lượng ochratoxin A……… 26

2.2.5.4 Thử xác minh ochratoxin A bằng dung dich NH 3 ……… 26

2.2.6 Phương pháp nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium để kiểm tra khả năng sinh ochratoxin A ……… 26

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… …… 28

3.1 Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê……… 28

3.2 Xác định khả năng tạo độc tố ochratoxin A của các chủng Aspergillus niger và Penicillium viridicatum đã phân lập ……… 34

3.3 Đặc điểm phân loại chủng nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A đã phân lập……… 38

3.3.1.Đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi của một số chủng Aspergillus niger đặc trưng đã phân lập từ đất và rễ cây cà phê……… 39

3.3.1.1 Chủng A.niger AN 1……… 39

3.3.1.2 Chủng A.niger AN 3……… 40

3.3.1.3 Chủng A.niger AN 4……… 41

3.3.1.4 Chủng A.niger AN 12……… 42

3.3.1.5 Chủng A.niger AN 20……… 42

3.3.1.6 Chủng A.niger AN 23……… 43

3.3.2 Đặc điểm hình thái và cấu trúc hiển vi học của một số chủng Penicillium viridicatum đặc trưng đã phân lập……… 43

3.3.2.1 Chủng P.viridicatum P1……… 43

3.3.2.2 Chủng P.viridicatum P2……… 45

3.3.2.3 Chủng P.viridicatum P5……… 45

KẾT LUẬN& KIẾN NGHỊ ……… 46

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cà phê là một trong những sản phẩm nông nghiệp chính có giá trị kinh tế cao của nước ta Cà phê là nông sản được xuất khẩu với số lượng lớn sang các nước thuộc khối ASEAN, Nhật Bản, Cộng hoà liên bang Nga và một số nước Đông Âu

Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cà phê nói riêng và các nông sản nói chung bao gồm các kỹ thuật bảo hiểm trên nông sản đồng thời chế biến chúng thành những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng bảo quản giữ gìn các giá trị dinh dưỡng, ngăn cản các chất độc hại cao đang ngày càng được quan tâm

Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản khác do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể Nguyên nhân nhiễm nấm mốc trên nông sản là do nấm mốc trong đất đã nhiễm vào rễ của cây rồi từ đó nhiễm nội sinh vào cây trồng, tiếp đó có thể nhiễm vào trong hạt Nấm mốc phát triển trên hạt,

sử dụng dinh dưỡng của hạt như protein, hydrocacbon, vitamin,…Đặc biệt, rất nhiều loài nấm mốc trong quá trình phát triển đã tạo ra các độc tố ảnh hưởng nguy hiểm tới sức khỏe con người và động vật kinh tế Ochratoxin A là độc tố đầu tiên được phát hiện sau độc tố aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất thường nhiễm trên cà phê Ochratoxin A gây suy giảm hệ miễn dịch, ảnh hưởng đến

hệ thần kinh, gây tổn thương cấp và mãn tính cho thận, ung thư thận và có thể gây quái thai,…

Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống đã được coi là một vấn đề quan trọng Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO) cũng như Bộ Nông nghiệp, Bộ Y Tế của nhiều nước đã đưa ra những chương trình khuyến cáo về độc tố nấm mốc và xây dựng tiêu chuẩn về giới hạn cho phép của độc tố nấm mốc trên lương thực

Ở nước ta, vấn đề nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống độc tố nấm mốc đang ngày càng được quan tâm Tuy nhiên, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố ochratoxin A trên cây cà phê và các nông sản khác thì còn rất mới mẻ

Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ”

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu

Xác định được mức độ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây

cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ở Việt Nam

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum

sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê

- Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum trong đất

và rễ cây cà phê

- Xác định khả năng sinh ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ cây cà phê

Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ nấm mốc trên lương thực

thể sống qua được trong nhiều năm ở hạt khô

Các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng tới bề ngoài và chất lượng của hạt Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước khi thu hoạch có thể phát hiện ra bằng phương pháp giám định thông thường và không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản Điều này được nhận biết rõ nhất là bắp, khi chín khô ngoài đồng, chưa thu hoạch kịp, gặp mưa có độ ẩm cao, các loại nấm mốc

có nguồn gốc từ đất tấn công vào nông sản Muốn khắc phục tình trạng này cần phải thu hoạch kịp thời, không nên để lâu ngoài đồng Sau khi thu hoạch phải phơi sấy ngay cho khô đến khi độ ẩm còn 13% mới đem bảo quản

1.1.2 Hệ nấm mốc bảo quản

Các nấm mốc bảo quản thường thấy ở trên các nguyên liệu có nguồn gốc hữu

cơ và vô cơ đa dạng, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm Chúng nhiễm trên các hạt lương thực và hạt giống sau khi thu hoạch Nguyên nhân chủ yếu là do độ ẩm trong thức ăn còn cao (> 14%) đã đem dự trữ hoặc do độ ẩm không khí trong kho cao hấp thu trở lại vào nguyên liệu, do chênh lệch nhiệt độ ngày đêm làm cho nước ngưng tụ trên bề mặt lớp thức ăn gây ra hiện tượng ẩm cục

bộ, tạo điều kiện tốt cho nấm phát triển Theo nghiên cứu của Christensen [9] hệ

nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, (trong đó chỉ năm loài là phổ biến), một số loài Penicillium, các loài của Sporendonema,… Các loài nấm mốc

bảo quản có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có hàm ẩm cao, từ 70%- 90% Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 30º- 32ºC Tốc độ phát

triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm Muốn khắc phục tình trạng này phải thường xuyên hút ẩm thông thoáng trong kho.

1.2 Đại cương về độc tố nấm mốc

Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá và gia cầm [20] Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại giữa kiểu gen và điều kiện phát triển của chúng Sự sinh trưởng, phát triển của độc tố nấm mốc phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái

như vùng, khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất,…

Từ năm 1960, bệnh độc tố nấm mốc đã bắt đầu được nghiên cứu sâu Vào năm 1960, ở nước Anh người ta đã phát hiện bệnh X trên gà tây đã làm chết hàng vạn con gà Nguyên nhân là chúng đã ăn phải lạc bị nhiễm độc tố nấm mốc Nghiên cứu về các động vật thực nghiệm cho thấy tính độc của các mycotoxin là rất lớn [7]

Nấm mốc có thể phát triển và sinh độc tố trên cơ chất là hầu hết các sản phẩm thực vật do đó nó tạo khả năng nhiễm trực tiếp độc tố vào thực phẩm của con người Khi ăn các thức ăn có nhiễm độc tố, vật nuôi không chỉ chịu tác dụng độc trực tiếp mà còn là nguồn mang độc tố vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự nhiễm độc tố tiếp theo cho con người Thường thì con người và vật nuôi bị nhiễm độc tố nấm mốc khi ăn phải lương thực, thực phẩm bị nhiễm độc tố.[2]

Hiện nay có khoảng 300 loại độc tố được phát hiện và nghiên cứu Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loại độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên

quan đến an toàn thực phẩm Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm:

Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B1, B2, G1, G2, M1, M2 ), ochratoxin

A, stermatocystin, axit cyclopianxoic

Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và

axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon

Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin

Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether

alternarion

Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà [45]

Độc tố nấm mốc ngày càng thu hút sự quan tâm, nghiên cứu của các nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau Rất nhiều hội nghị quốc tế, hội thảo, chuyên khảo, tạp chí và các bài báo nghiên cứu về vấn đề có tính cấp thiết này

Những giải pháp phòng trừ Mycotoxin:

- Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi

- Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng

để trộn thức ăn cho thú

- Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ

nguyên liệu

- Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo

- Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho: côn trùng hô hấp đốt chất dinh dưỡng sinh ra H2O làm ẩm nguyên liệu giúp nấm mốc phát triển đồng thời khi di chuyển chúng đã mang theo bào tử nấm phát tán nhanh trong kho

- Sử dụng hóa chất chống nấm mốc: có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn, hiện nay có thể nói chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực cao ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức

ăn là acid propionic và các muối của nó

- Vô hiệu hóa độc lực mycotoxin bằng phương pháp vật lý và hóa học: ngoài các biện pháp như xử lý nhiệt, ánh sáng, sử dụng ozone để oxi hóa mycotoxin và sử dụng chất kiềm NH3 thì việc sử dụng chất hấp phụ bề mặt các lọai mycotoxin xem

ra có hiệu quả cao và ít chi phí nhất hiện nay

+ Các loại đất sét: bentonite, zeolite và aluminosilicate, có nhiều kết quả đã được kiểm chứng chỉ ra rằng các lọai đất sét kể trên đặc biệt là Hydrate sodium calcium aluminosilicate (HSCAS) là có hiệu quả nhất với hàm lượng 10kg/tấn có thể lọai bỏ được các tác hại của aflatoxin ở gà, heo và bò Tuy nhiên, các lọai này vẫn còn 1 số khuyết điểm như hàm lượng sử dụng cao, hiệu quả kết dính trong

phạm vi hẹp và chỉ có hiệu lực chủ yếu với aflatoxin còn các độc tố khác ít có hoặc không có hiệu quả

+ Các chất kết dính hữu cơ mà đại diện là EGC (Esther Glucomannan) là thế

hệ chất hấp phụ độc tố nấm mốc có nhiều thành quả nhất đáp ứng được hầu hết các yêu cầu về một chất hấp phụ độc tố điều mà các loại đất sét còn thiếu sót

1.3 Ochratoxin

1.3.1 Các loại độc tố ochratoxin

Sau aflatoxin thì ochratoxin là nhóm độc tố tiếp theo được phát hiện Hiện nay có 4 loại ochratoxin được biết đến là ochratoxin A, ochratoxin B, ochratoxin C (este etyl của ochratoxin A) và este metyl của ochratoxin A Ở các ochratoxin chủ yếu là sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân izocumarin [6] Công thức cấu tạo của độc tố ochratoxin A như sau:

Ochratoxin A

Claude Moneau và cộng sự [5] khi nghiên cứu tính chất hoá lý của ochratoxin đã đưa ra những kết quả sau:

Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxin

1.3.2 Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin

Hợp chất đầu tiên được phát hiện trong nhóm độc tố ochratoxin là ochratoxin

A, được phân lập từ Aspergillus ochraceus Ochratoxin A là tinh thể không màu,

phát quang màu xanh dưới ánh sáng cực tím Muối natri của ochratoxin A hoà tan trong nước, hoà tan nhẹ ở các dung môi phân cực như clorofom, methanol, Ochratoxin A tinh khiết bền ở nhiệt độ cao Ochratoxin A ít hoặc không

bị phá huỷ ở điều kiện nấu bình thường Tuy nhiên ochratoxin A bị phân huỷ dưới tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời Trong quá trình thuỷ phân axit ochratoxin

A sẽ tạo ra phenylalanine và axit lacton hoạt động về mặt quang học Ochratoxin C

là chất trao đổi tìm thấy ở nước tiểu của động vật ăn thức ăn có nhiễm ochratoxin A [6]

1.3.3 Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc

Ochratoxin A đầu tiên được phân lập từ Aspergillus ochraceus nhưng những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và Penicillium

cũng tạo ochratoxin A

Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Aspergillus gồm: A.ochraceus, A elegans, A.fresenii, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.screrotium, A.sulphureus

Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Penicillium gồm: P.verrucosum, P.viridicatum, P.chrysogenum, P.commune và P.cyclopium, P.expansum, P.palitans, P.purpurescence, P.nordiceum, P.variable.[4]

Ochratoxin A được tạo ở nhiệt độ tối thích từ 20º- 30ºC và hoạt độ nước 0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt độ cao hơn hàm ẩm yêu cầu cao hơn aw= 0,997 hay 52% ẩm Các nấm Penicillium thường tạo ochratoxin A trong điều kiện nhiệt độ thấp còn các nấm Aspergillus thường tạo

ochratoxin A ở nhiệt độ cao hơn [1]

1.3.4 Độc tính của ochratoxin A

Tác dụng độc đầu tiên của ochratoxin A là ức chế sinh tổng hợp protein Tác dụng là đặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp phenylalanin tRNAPhe Thận là cơ quan nhạy cảm nhất đối với ochratoxin A Ochratoxin A có thể gây ra tổn thương cấp tính cũng như mãn tính cho thận Ochratoxin A tác động lên

hệ miễn dịch, làm suy giảm hệ thống miễn dịch và có khả năng gây quái thai Ochratoxin A còn là một trong những chất gây ung thư Những kết quả nghiên cứu cho thấy, việc cho uống ochratoxin A trong thời gian 2 năm ở các liều từ 3500 đến

6000 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột cái và 70 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột đực đã kích thích tạo các u, trước hết là các u thận Bệnh thận địa phương của vùng Balkan (BEN), chẳng hạn như vùng Vratza của Bulgari là một bệnh nghiêm trọng Bằng chứng đã rõ là với cách bảo quản truyền thống đã khiến lương thực thực phẩm ở các địa phương này bị nhiễm các nấm mốc sinh độc tố ochratoxin A [6]

Những nghiên cứu của Claude Moneau và cộng sự đã cho thấy độc tính của ochratoxin A là nguy hiểm nhất trong các ochratoxin Ochratoxin A làm giảm sản lượng trứng, sữa, giảm chất lượng vỏ trứng, ảnh hưởng đến thận của các loại gia cầm Chó, mèo, lợn, gà, gà tây, vịt con rất nhạy cảm với loại độc tố này LD50 của

ochratoxin A đối với vịt con là 135- 170n/con Nghiên cứu cho thấy ở lợn với hàm lượng nhiễm ochratoxin A 200 ppb làm giảm tăng trọng, gây tổn thương thận nhẹ Theo nghiên cứu của Osweiler (1992) [44] thì liều gây chết gia súc trong vòng 5 đến 6 ngày là 1mg/1kg thể trọng Còn ở gà mái Leghorn (Lơgo) trắng tuổi từ 14 tuần đến một năm ochratoxin A gây chậm thành thục sinh dục và đẻ ít trứng (với nồng độ thấp), gây đẻ ít trứng rõ rệt, rối loạn gan và thận, đôi khi làm chết gà (ở nồng độ cao).[49]

Bằng thực nghiệm người ta đã nhiễm độc cho vịt con và chuột, kết quả nhận thấy vịt và chuột bị viêm ruột, rối loạn thận, hoại tử ở tiểu quản thận, rối loạn gan, hoại tử các tế bào quanh cửa gan, thông thường nhiễm vào các tế bào riêng lẻ Ochratoxin A và dihidro- izocumarin, một trong những sản phẩm thuỷ phân của nó gây ức chế nghiêm trọng sự hô hấp nhịp khi cho hai chất đó ở nồng độ thấp vào các thể ty lạp riêng rẽ ở gan chuột Ochratoxin A còn gây sẩy thai ở động vật thí nghiệm

và ở các động vật trong các trại chăn nuôi Giá trị LD50 (liều gây chết tối thiểu 50%

số động vật thí nghiệm) của ochratoxin A đối với một số động vật được thể hiện qua bảng 1.2 dưới đây

Bảng 1.2: LD 50 của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24]

Loài

LD 50 (mg/kg trọng lƣợng cơ thể) Trong miệng Trong màng bụng Trong tĩnh mạch

Chuột mới sinh 3,9

Định tính và định lượng: Việc áp dụng các phương pháp định tính và định lượng của mỗi một độc tố phụ thuộc vào tính chất hoá học của chúng Với ochratoxin A có thể định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng cao áp

Phương pháp sắc ký bản mỏng

Việc định tính bằng sắc ký bản mỏng có thể tiến hành nhờ vào khả năng phát quang của ochratoxin A dưới đèn cực tím Giới hạn phát hiện của phương pháp tương đối thấp, đối với ochratoxin A là 0.25ppb Có thể định lượng ochratoxin A nhờ phương pháp sắc ký bản mỏng bằng cách so sánh cường độ phát quang của mẫu thử so với mẫu chuẩn bằng mắt thường hoặc có thể tiến hành đo trên máy đo mật độ huỳnh quang Việc đo cường độ phát quang bằng máy là ưu thế hơn xác định bằng mắt vì nó loại trừ được sai số cao được gây ra trong điều kiện của sắc ký bản mỏng Các nhà khoa học đã xác định được giới hạn chính xác của việc xác định bằng mắt thường là 20- 28% trong điều kiện lý tưởng [6]

Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

Ngoài sắc ký bản mỏng còn có thể định tính và định lượng ochratoxin A bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố của chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao

bọc tạo thành một tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp để định tính và định lượng các mycotoxin trong đó có ochratoxin A được tiến hành dựa trên nguyên lý: mẫu được đưa qua bộ phận tiêm mẫu vào dòng dung môi của pha di động được tạo bởi hệ thống phân chia dung môi bao gồm một hay nhiều bơm cao áp chính xác Dòng chảy của pha di động truyền mẫu vào cột sắc ký có các hạt của pha tĩnh (5- 100 nm) Sau đó dung dịch mẫu được chuyển vào cột Sự phân tách các thành phần tiến hành ở dạng các dải sắc ký phân tách Những dải sắc ký này được chiết rút từ cột qua một hay nhiều máy phát hiện Tín hiệu xung động được khuếch đại và được ghi lại thành đồ thị ở các đỉnh sắc ký

Sắc ký lỏng cao áp là hệ thống thiết bị hoàn thiện với độ xác định chính xác cao đối với việc phân tích các mycotoxin Giới hạn phát hiện đối với ochratoxin

đựơc trình bày trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Mức độ nhiễm ochratoxin A trong máu của người ở một số nước [24]

Quốc gia

Thời kỳ nghiên cứu

1984-85 52/668 8 0,33 1,0-4,0

Bocharova và cs (1991)

Breitholtz-cs (1994)

Nhật Bản 1992-96 156/184 8

5 0,068

0,004 0,28 Ueno và cs (1998)

-Pháp 1991-92 97/500 1

Creppy và cs (1993)

Sangare- Tigori B và cộng sự [42] đã nghiên cứu sự cộng nhiễm aflatoxin B1, ochratoxin A, fumonisin và zearalenon trên các loại ngũ cốc và lạc ở Cordivoir Kết quả cho thấy trong 30 mẫu phân tích thì có 86% mẫu nhiễm cả 4 loại độc tố Các tác giả cũng nghiên cứu sự nhiễm ochratoxin A trên lúa, miến, ngô, gạo và lạc ở Cardivoir từ năm 1998 đến 2002 Kết quả cho thấy trong 33 mẫu ngô, 10 mẫu gạo

và 10 mẫu lạc phân tích, trừ 4 mẫu lạc còn lại tất cả các mẫu đã nhiễm ochratoxin A

từ 3 đến 1738 ng/kg, trong đó hàm lượng ochratoxin A trong lúa miến dao động từ

17 ng/ kg đến 204 ng/kg, trong ngô từ 3-1738 ng/kg, trong gạo từ 9-92 ng/kg, trong lạc từ 0.6-64 ng/kg

Các nhà khoa học khác trên thế giới cũng đã nghiên cứu mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng như rễ cây cà phê, mỳ, bột mỳ, cám mỳ, lúa mạch, ngô Bắc Mỹ, … Dưới đây là bảng 1.4 trình bày kết quả mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng

Bảng 1.4: Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng[25]

là 0,63 ng/g gạo, chỉ có một mẫu nhiễm 2,78 ng/g gạo

Kết quả khảo sát 56 mẫu cà phê nhân Robusta ở 4 tỉnh Đắclắk (23 mẫu) , Gia Lai (14 mẫu), Lâm Đồng (12 mẫu), Đồng Nai (7 mẫu) của Lâm Thanh Hiền [ ]

cho thấy có 29 loài nấm mốc xâm chiếm hạt Trong đó Aspergillus là giống xâm chiếm hạt chủ yếu với 19/29 loài, chiếm ưu thế là A.niger, A awamori, A turbingensis, A ficuum, A ochraceus, A flavus, A tamarii, A alliaceus, A fumigatus Tiếp theo là giống Penicillium với 4 loài: P.viridicatum, P canescens, P nigricans, P purpurogenum , và P rubrum Phân tích hàm lượng ochratoxin A

trong hạt cà phê theo phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của Kamimuna

(1999) và AOAC (1995) đã phát hiện 50/52 mẫu bị nhiễm độc tố ochratoxin A với hàm lượng trung bình rất thấp: 0,38ppb và biến thiên từ 0,04 – 7,74ppb

Trước sự nguy hiểm của ochratoxin A, tổ chức nông lương thế giới (FAO) và

tổ chức y tế thế giới (WHO) đã có những chương trình khuyến cáo về phòng chống ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc và đưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A Các quốc gia trên thế giới cũng đã đưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc cho quốc gia của mình

Theo FAO và WHO thì giới hạn ochratoxin A trong nông sản thực phẩm là

10 ng/ kg trọng lượng cơ thể/tuần Năm 2004, cộng đồng châu Âu đã đưa ra tiêu chuẩn giới hạn ochratoxin A là 5ppb trong đất, rễ cà phê và 10ppb trong cà phê chế biến Tại Việt Nam giới hạn ochratoxin A trong nông sản là 35 ng/ kg [48]

Mức độ nhiễm ochratoxin A đã trở thành một trong những chỉ tiêu xuất khẩu nông sản của các hợp đồng thương mại quốc tế

1.3.7 Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và Việt Nam

Bên cạnh việc kiểm tra, giám sát mức nhiễm ochratoxin A, việc phòng chống ochratoxin A trên nông sản đã được nhiều quốc gia trên thế giới nghiên cứu Một số biện pháp được Bộ Nông nghiệp Mỹ và cộng đồng châu Âu khuyến cáo nhằm phòng chống các mycotoxin nói chung và ochratoxin A nói riêng đó là:

- Phát triển các cây trồng có khả năng đề kháng nấm

- Kiểm soát sự nhiễm các loài nấm sinh độc tố trên cây trồng ở ngoài đồng

- Xác định đúng thời gian trước thu hoạch, thu hoạch và sau thu hoạch cho cây trồng

- Giảm hàm ẩm của các hạt lương thực sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản

- Bảo quản các nông sản ở nhiệt độ thấp nếu có thể

- Sử dụng các chất diệt nấm và các chất bảo quản để ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc

- Kiểm soát sự xâm nhiễm của các côn trùng trong bảo quản bằng việc sử dụng các chất diệt côn trùng,…

Các nghiên cứu về nguyên nhân nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản của nhà khoa học Mỹ Christensen [9] cho thấy, đất là nơi phát sinh đầu tiên của các nấm mốc Các nấm này đã nhiễm vào rễ của cây rồi nhiễm nội sinh vào cây trồng và từ đó nhiễm tiếp vào bên trong các hạt lương thực Fernado E Vega và Francisco, các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã phát hiện trong số 11

chủng Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo ochratoxin A là P.brevicompactum, P.crustosum, P.olsonii và P.oxalicum [43]

Hiện nay rất nhiều nước trên thế giới quan tâm đến việc phòng chống ochratoxin A Các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã nghiên cứu việc phòng

chống nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum sinh ochratoxin

A Các tác giả Ringot D, Bejaoui H [18] cho thấy chủng A.niger không sinh độc tố

đã có khả năng ức chế chủng A.niger, A.ochraceus và các Penicillium sinh độc tố

theo cơ chế cạnh tranh Cộng đồng châu Âu đã công nhận kết quả này và khuyến

cáo sử dụng chủng A.niger không sinh độc tố để phòng chống ochratoxin A

Các biện pháp khử nhiễm ochratoxin A trong nông sản thực phẩm cũng được các nhà khoa học trên thế giới nỗ lực nghiên cứu Nhiều giải pháp được đưa ra nhằm khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm Boudra (1995) đã nghiên cứu khả năng khử nhiễm ochratoxin A trên lúa mỳ bằng sức nóng Kết quả cho thấy ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau, khả năng giảm ochratoxin A là khác nhau Kết quả được thể hiện trong bảng 1.5 dưới đây

Bảng 1.5: Thời gian giảm 50% ochratoxin A trên lúa mỳ trong điều kiện

phân lập đã có khả năng phân huỷ 80 % ochratoxin A Aspergillus được đánh giá là

loài có hiệu quả cao nhất đối với quá trình khử ochratoxin A, tiếp theo là

A.japonicus

Varga J và cộng sự [39 ] đã nghiên cứu sự phân huỷ ochratoxin A và các độc

tố nấm mốc khác bằng các chủng Rhizopus Kết quả cho thấy ochratoxin A đã được phân huỷ một cách hiệu quả bằng nấm Rhizopus stolonifer, R.microsporus,

R.homothallicus, hai chủng R.oryae và bốn chủng Rhizopus khác chưa được định loại Các chủng Rhizopus đã phân lập có thể phân huỷ trên 95% ochratoxin A trong vòng 16 ngày Các chủng A.niger không sinh độc tố và Rhizopus stolonifer cũng đã

được cộng đồng châu Âu khuyến cáo để khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực nhiễm độc tố này ở mức độ quá giới hạn

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng

Các mẫu đất và rễ cây cà phê được lấy ở các xã khác nhau của tỉnh ĐắkLắk

và ĐắkNông bao gồm: 50 mẫu đất và 30 mẫu rễ cây cà phê

8 mẫu ở Tân Lập, Đắclắk

15 mẫu ở Ea cúc, Đắclắk

7 mẫu ở Eapole, Đắclắk

10 mẫu ở Chư hlam, Đắclắk

12 mẫu ở Krông păc,ĐắkNông

9 mẫu ở Krông ana, Đắc Nông

11 mẫu ở Kpach, Đắc Nông

8 mẫu ở Empa Cumgar, Đắklắk

Các mẫu ngô dùng làm cơ chất để kiểm tra khả năng sinh Ochratoxin A của các chủng đã phân lập được lấy ở các cửa hàng bán lẻ thuộc các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Tây

2.1.2 Môi trường

Môi trường thạch khoai tây (PDA) : 200 g khoai tây gọt vỏ, thái hạt lựu đun

sôi với 4.500 ml nước Sau đó lọc qua lớp vải mỏng, thu dịch chiết khoai tây

Dịch chiết khoai tây: 1000 ml

Glucoza: 20 g

Đun cho tan chảy thạch và glucoza Thử pH = 5.5 - 5.8 Sau đó chia môi trường vào các bình tam giác, khử trùng ở 121ºC (1 at) trong 30 phút

Môi trường Czapek – Dox (g/l) :

Đun cho tan chảy thạch Thử pH = 5- 6 Khử trùng ở 0.8 at trong 30 phút

2.1.3 Các hoá chất dùng cho phân tích độc tố Ochratoxin A

Vi cột sep-pak (sep-pak silica Catridge),

Buồng sắc ký lớp mỏng (chromatography tank)

Nồi hấp môi trường, Đài Loan

Máy xay, máy lắc phòng thí nghiệm, Nhật Bản

Máy đánh siêu âm, Đức

Máy cô chân không quay, Đức

Kính hiển vi Olympus có gắn máy chụp ảnh, Nhật Bản

Tủ cấy vô trùng, Nhật Bản

2.2 Phương pháp

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố ochratoxin A

Tiến hành theo phương pháp của FAO [43]

Phương pháp lấy mẫu đất và rễ cây cà phê:

Mỗi mẫu lấy khoảng 25g đất và rễ cây cà phê sau đó cho vào túi nilon buộc kín Phải ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu trên mỗi mẫu đất và rễ cà phê Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem phân tích

Phương pháp lấy mẫu ngô:

Với mỗi mẫu ngô thu nhập ngoài chợ, cửa hàng thì khối hạt ngô được trộn đều lấy 1kg làm đại diện Một đại diện được trộn đều rồi chia tư, một phần từ đó lại được trộn đều và chia tư lấy 10g làm mẫu phân tích [6]

2.2.2 Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất và rễ cây cà phê

Tiến hành theo phương pháp của phòng Vi sinh, Viện Cơ điện Nông nghiệp

và Công nghệ Sau thu hoạch

2.2.2.1 Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất trồng cà phê

Mẫu đất trồng cà phê được nghiền nhỏ, cân lấy 1g và cho vào ống nghiệm đã

có sẵn 9ml nước cất đã thanh trùng ở 121ºC trong 60 phút Đánh tan và lắc đều bằng máy vovtex Hút 1 ml dịch trên cho vào ống nghiệm có sẵn 9 ml nước cất đã thanh trùng Tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp Hút 1000ml dịch chứa mẫu đã pha loãng vào hộp Petri đã được sấy khử trùng ở 160ºC trong 2h Sau đó đổ môi trường PDA lỏng (có bổ sung axit lactic 0.4% để diệt khuẩn) vào hộp petri Lắc đều hộp petri Đặt hộp petri trong tủ ấm, nuôi ở 37 ºC trong 5 - 8 ngày [47]

2.2.2.2.Phương pháp phân lập nấm mốc từ rễ cây cà phê

Mẫu rễ cây cà phê được rửa sạch bằng nước cất (rửa 5 lần) Sau đó rửa bằng

H2O2 trong 3 phút, tiếp tục rửa bằng javen trong 5 phút Rửa lại bằng nước từ 5 đến

10 lần Mẫu rễ cây cà phê sau khi rửa sạch theo cách trên được nghiền nhỏ bằng cối

sứ đã lau cồn sạch Cân 1g mẫu rễ cà phê đã được nghiền nhỏ và cho vào ống nghiệm đã có sẵn 9ml nước cất đã thanh trùng ở 121ºC trong 60 phút Đánh tan và lắc đều Hút 1 ml dịch trên cho vào ống nghiệm có sẵn 9 ml nước cất đã thanh trùng Tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp Hút 1000µl dịch chứa mẫu đã pha loãng vào hộp Petri đã được sấy khử trùng ở 160ºC trong 2h Sau đó đổ môi trường PDA lỏng (có bổ sung axit lactic 0.4% để diệt khuẩn) vào hộp petri Lắc đều hộp petri Đặt hộp petri trong tủ ấm, nuôi ở 37 ºC trong 5 - 8 ngày

2.2.3 Phương pháp làm tiêu bản soi nấm mốc

Phương pháp này dùng để phân loại sơ bộ các loài nấm mốc khác nhau dựa trên những đặc điểm hình dạng, kích thước của nấm mốc [6]

Phương pháp :

- Nhỏ một giọt dung dịch cồn nước trên lên lam kính

- Lấy nấm mốc trong ống thạch nghiêng bằng que cấy mốc đã được khử trùng và làm nguội

- Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên

- Nhỏ một giọt xanh metylen lên lam kính, đậy lamen lên, để khô

- Tiến hành soi kính

2.2.4 Phương pháp phân loại các loài nấm mốc

Các bào tử được tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này được pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc từ 1: 10 Một ml từ hai hay ba độ pha loãng được chọn, tùy theo mật độ của hỗn dịch ban đầu, được cho vào các hộp petri Sau

đó đun tan chảy thạch, đợi nguội đến gần 450C rồi phân vào các hộp này, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào tử được pha loãng Để vào tủ ấm 300

C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số lượng khuẩn lạc giới hạn từ 30 đến

100 những khuẩn lạc riêng biệt đồng đều [6]

Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi

sử dụng tài liệu của Raper và Fennell (The genus Aspergillus) [36]

Để phân lập đến loài của chi Penicillium, chúng tôi sử dụng tài liệu của

Thom Fennell (The penicillium) [34]

2.2.5 Phương pháp phân tích ochratoxin A

Chúng tôi tiến hành phân tích ochratoxin A theo phương pháp của Shimomura và Ishikuro [40] Phương pháp này gồm các giai đoạn: