Nghiên cứu nấm linh chi đa niên, nấm đa niên, các chất có hoạt tính sinh học chính của chúng nhằm góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng và tinh sạch chế phẩm TAQ P150254

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỂ TÀI NGHIÊN cứu KHOA HỌC TRONG ĐIỂM ĐẠI HOC QUỐC GIA HÀ NỘI “NGHIÊN CỨU N ẤM LINH CHI ĐA NIÊN, N ẤM ĐA NIÊN, CÁC CHẤT CĨ H O ẠT TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA CHÚNG NH ẰM GÓP PHẨN BẢO VỆ SỨC KHOẺ CỘNG ĐỔNG VÀ TINH SẠCH C H Ế PHẨM TAQ POLYMERAZA TÁI TĨ HỢP s DUNG TRONG CƠNG NGHỆ SINH HỌC ” Mã số: QGTĐ.03.08 Chủ trì: GS TSKH Trịnh Tam Kiệt ĐAI HOC QUỐC < SIA HÀ NỒI TRUNG TẤM : HÒNG riN ĨHƯVIẾN Ỉ ) r N T " // n ^ / Ịy / Ly ^ ~ ĩ Hà Nôi, 2005 Đại hục Qưoc gia NỌI TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC * * * _ NGHIÊN CỨU N Ấ M LINH CHI ĐA NIÊN, N Ấ M ĐA NIÊN, CÁC CHẤT CÓ H O Ạ T TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA CHÚNG NHẰM GĨP PHẨN BẢO VỆ sức KHOẺ CỘNG Đ ổ N G VÀ TINH SẠCH C H Ế P H Ẩ M TAQ POLYMERAZA TÁI T ổ HỢP s DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC M ả số: QGTĐ.03.08 C hủ tr ì để tài: GS TSKH Trịnh Tam Kiệt Danh sách người thực STT Chức vu Ho tên Cơ quan • • GS TSKH Trinh Tam Kiêt Chủ trì đề tài TTCNSHĐHQGHN TS Dương Văn Hợp Chủ trì đề tài nhánh nt GS TS Lê Đình Lương Chủ trì đề tài nhánh nt TS Đàm Bạch Dương Cán bô NC nt CN Hồng Văn Vinh Cán bơ NC nt CN Vũ Thị Kim Ngân Cán bô NC nt Ths Trần Thi Lan Cán bô NC nt CN Nguyễn Xuân Hùng Cán bô NC nt TS Ngô Anh Cán bơ NC ĐH Huế • • • • • • • • • TT Sinh hoc • 10 PGS TS Lê Xuân Thám Cán bô NC 11 Ths Ta Bích Thn Cán bo NC ĐH KHTN 12 Ths Đồn Văn Vê Cán bố NC nt 13 CN Trinh Tam Bảo Cán bơ NC nt • • • • • • • • HÀ NỘI - 2005 phóns xạ BÁO CÁO TÓM TẮT Tên đề tài: " Nghiên cứu nấm Linh chi đa niên Ị nấm đa niên, chất có hoạt tính sinh học chủng nhằm góp phần bảo vệ sức khoẻ cộng đồng tình ché phẩm Taq polymeraza tái tổ hợp sử dụng công nghệ sinh học" Mả số: QGTĐ.03.08 Chủ trì đề tài: GS TSKH Trịnh Tam Kiệt Danh sách người thực Ho tên STT Chức vu • • GS TSKH Trinh Tam Kiêt • Chủ trì đề tài • Co quan TĨCNSH - TS Dương Văn Hợp Chủ trì đề tài nhánh ĐHQGHN nt GS TS Lê Đình Lươn Chủ trì đề tài nhánh nt TS Đàm Bạch Dương CN Hồng Văn Vinh Cán bơ NC Cán bơ NC nt nt CN Vũ Thị Kim Ngân Cán bô NC nt Ths Trần Thi Lan CN Nguyễn Xuân Hùng Cán bô NC nt nt ĐH Huế • TS Ngơ Anh • • • • Cán bơ NC Cán bồ NC • • TI' Sinh hoc 10 PGS TS Lê Xuân Thám Cán bô NC 11 Ths Ta Bích Thuân Cán bo NC ĐH KHTN 12 Ths Đồn Văn Vê Cán bơ NC nt 13 CN Trinh Tam Bảo Cán bơ NC nt • • • • • • • phón^ xạ Mục tiêu nội dung nghiên cứu 4.1 Mục tiêu Nghiên cứu định loại số loài nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên q dựa đặc điểm hình thái sinh học phân tử • s_/ c - Nghiên cứu số nhóm chất có hoạt tính sinh học dược sử dụng việc góp phần tăng cường khả miễn dịch phòns chốnc uns thư - Nghiên cứu tinh enzim đặc hiệu Taq polymeraza dùns sinh học phân tử 4.2 Nội dung - Nghiên cứu đặc điểm hình thái sinh học phân tử số loài nấm Linh chi đa niên, nấm đa niên quí bảo tồn nsuồn sen chúng nuôi cấy khiết - Nghiên cứu số nhóm chất có hoạt tính sinh học phương thức chiết xuất hoạt chất quí từ số loài quan trọng - Nghiên cứu khảo nghiệm tác dụng chế phẩm “nấm đa niên” việc tãng cường khả miễn dịch phòng chống ung thư - Nghiên cứu tinh Taq polymeraza tái tổ hợp từ vi khuẩn E coli dùng cho phản ứng PCR Các kết đạt - Nghiên cứu xác định loài nấm đa niên Việt Nam thuộc họ Ganodermataceae (2 chi, 13 loài); Hymenochaetaceae (2 chi, 23 loài): Coriolaceae ( chi, 15 lồi) Các đặc điểm hình thái hiển vi số loài quan trọng mơ tả - Xác định quy trình tách chiết ADN từ nấm Linh chi đơn niên Đã nghiên cứu sử dụng enzyme giới hạn cắt gen Mn SOD để phân loại nhận dạng nấm linh chi đơn niên nấm linh chi đa niên Gau - Đã nghiên cứu mọc hình thành thê chủng nấm đa niên Toh, El, H l, Gs Cl Sự hình thành bảo tử vơ tính thê chủng mơ tả - Các nhóm chất có hoạt tính sinh học chủng E l Toh.7 Hl, • • Cl, NI nghiên cứu bằns phương pháp sắc kí cho thấy chúna giàu chất có hoạt tính sinh học - Tất các dịch chiết chủng nấm đa niên hỗn họp chúng không gây độc dòng tế bào đẫ thử nghiệm Sau xử lí với dịch chiết nước cồn quan sát thấy ức chế trình tăn sinh tế bào ung thư phụ thuộc vào nồng độ Việc ứng dụng dịch chiết nấm cho bệnh nhân tự nguyện bước đầu cho kết khả quan - Đã xây dựng quy trình lách tinh Protein tái tổ hợp Taq polymeraza Chế phẩm thu đạt hoạt tính 1.5 - 2\xỊ ịil Chế phẩm cung cấp cho số phịng thí nghiệm sinh học phán tử để thay chế phẩm nhập ngoại - Góp phần đào tạo nghiên cứu sinh cử nhân khoa học tài năn theo hướng nghiên cứu đề tài - Đã có 01 báo cáo hội nghị quốc tế, 03 báo cáo hội nghị quốc Ĩa 06 báo đăng tạp chí chun ngành Tình hình kinh phí - Kinh phí cấp: 300 triệu - Kinh phí sử dụng: 300 triệu đồng TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC ăn Hợp GS TSKH T rịnh Tam Kiệt c QUAN CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI Đại học Quốc gia Hà Nội SUMMARY The title project: Study o f perennial Ganoderma, polypores mushroom, their main bioactive compounds fo r health protection and pufification recombinant Taq polymerase fo r biotechnological research Code num ber: QGTĐ.03.08 Prject C oordinator: Prof Dr Sc Trinh tarn kiet Project members: - Prof Dr Sc Trinh Tam Kiet - Center of Biotechnology VNU - Dr Duong Van Hop - Center of Biotechnology, VNU - Prof Dr Le Dinh Luong - Center of Biotechnology VNU - Dr Dam Bach Duong - Center of Biotechnology, VNƯ - BA Hoang Van Vinh - Center of Biotechnology, VNU - BA Nguyen Thi Kim Ngan - Center of Biotechnology, VNƯ - BA Trinh Thi Tam Bao - Center of Biotechnology, VNƯ - BA Nguyen Xuan Hung - Center of Biotechnology, VNU - MSC Tran Thi Lan - Center of Biotechnology, VNU - MSC Doan Van Ve - College of Science, VNU - MSC Ta Bich Thuan - College of Science, VNU - Dr Le Xuan Tham - Center of Radio biotechnology The objectives and research contents 4.1 The objectives - Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores mushroom base on morphological and molecular characteristica - Research on main bioactive compounds for health protection (stimulation immune system and antitumor) - Pufification recombinant Taq polymerase for biotechnological research 4.2 The research contents - Research and identifycation the perennial Ganoderma, polypores mushroom base onmorphological and molecular characteristica and maintaining the strains on culture collection - Research on main bioactive compounds and method to exstract the main bioactive compounds from some important specices - Study using the abouv exstractions to stimulation immune system and antitumor traitement - Pufification recombinant Taq polymerase for PRC reaction Main results - There are about 51 specices of the perennial Ganoderma polypores mushroom had been found (Ganodermataceae - genus 13 species Hymenochaetaceae - genus, 23 species, Coriolaceae - eenus 15 species) - The morphological and micropic characteristica of some importan species are discribed and maintaining the strains on culture collection - Finding the method to extraction DNA of anual Linzi and identification Ganoderma using PCR - RFLP analysis of Mn SOD gene - The growing and fruiting of the perenial linzhi and polypores strains Toh, E l, HI, Gs and c were studied on Agar medium and Substrat - The main bioaactive compounds of the strains El,Toh, HI, N1 Cl were identificative by chromatography methods: MS, HPLC, TLC - All extracts and their mixtures not exhibit cytotoxic effect against the tested cell lines Upon treatement with ethanolic and aqueous extracts, a concentration-dependent inhibition of cell proliferation was abserved The exstractions were using to treatement of the free willing patients and give the good results - The Taq polymerase for PRC was on pufificated exstract and have activity about 1.5 - 2ji/ |il This product was using in some molecular laboratorium in Vietnam - Six papers have been published and two presentations on National congress and one in Japan - Two graduate students is being under the research direction of the project Cei^ter'ofiBiot^chnologv, VNU /T Director IKl.Jh’C i/f, \ : CON IN long Van Hop Prof Dr Sc Trinh Tam Kiet Project implementing organization Vietnam National University, Hanoi I M ĐẢƯ Số lượng loài nấm định danh 80060 loài (Từ điển nám Kirk et al, 2001) Trong , sơ lượng lồi nấm lớn (Marcro fun21) có thê nhìn thấy mắt thường khoảng 14 nghìn lồi lên tới 22 nshìn lồi (Hawkworth, 2001) đó, khoảng 50% lồi ãn bỏ'i mức độ khác nhau, 2000 loài an toàn (cả hợp chất tron2 tế bào hợp chất trao đổi thứ cấp có tính sinh kháng ngun yếu khôn gây phản ứng phụ ) khoảng 700 lồi cho có đặc tính dược liệu Các số liệu có cho thấy nấm lớn nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa hợp chất có trọng lượng phân tử lớn như: Polysaccharide, Polaccharide- Protein đặc biệt giàu sản phẩm trao đổi chất thứ cấp có trọng lượng phân tử nhỏ hơn.ít có 651 lồi lồi thuộc 182 chi Nấm có đảm đa bào (Heterobasidiomycetes) Nấm có đảm đơn bào (Holobasidiomycetes) chứa Polysaccharide có tác dụng dược liệu (Reshetnikov et al., 2001) Chú ne hầu hết Glucan với nhiều loài liên kết Glycoside khác p-1->3, p -l->6 p - l->3) số thực Hecteroglucan Một số polysaccharide liên kết với gốc protein phức hợp PSP (Krestin) chiết suất từ nấm Vân chi (Ttrametes versicolor) Các chất có tác dụng chủ yếu chống ung thư, nằm vách tế bào nấm, thường che lấp thành phần nấm kitin Bên cạnh đó, từ nấm lớn hàng trăm chất có hoạt tính sinh học có trọn lượng phân tử nhỏ đa tách chiết, sàng lọc, nshiên cứu cấu trúc hoạt tính sinh học chúng Trước hết phải kể đến Terpenoit ganoderic axit, lucideric axit, ganoderiol, ganodermodiol từ loài Ganoderma lanostal, sterol, phenol từ hàng loạt loài nấm lớn khác Hoạt tính chống ung thư, điều hịa hệ miễn dịch, antioxydan, chống viêm nhiễm, chống virus, vi khuẩn, nấm; làm giảm lượng choresterol mỡ đường máu nghiên cứu tích cực nhiều nước có công nshiệp phát triển [8, 10, 14, 15, 16, 17] Những nghiên cún thành phần loài nấm lớn Việt Nam Trịnh Tam Kiệt tác giả khác tiến hành [1, 2, 4, 11, 18, 19] thống kê toàn vao năm 2001 [3], bao gồm khoảng 1200 loài tổng số 2250 loài nấm định tên khoa học Trong có số lồi ghi nhận có tác dụng dược liệu chưa đặc điểm sinh học cũne tác dụnơ dược học chúng Một số chủng nấm dược liệu khác Linh chi, Vân chi Nấm đầu khỉ, Nấm lỗ nhập nội nuôi trồng thử nghiệm số sở nghiên cứu nuôi trồng nấm Việt Nam Một số sản phẩm nấm linh chi khô nguyên cắt lát, bột nấm, chè linh chi sản xuất thử nghiệm cung ứng cho người tiêu dùng Tuy nhiên, nghiên cứu kỹ lưỡng thành phần loài, phân bố, trữ lượng, khả đưa vào ni trồng lồi nấm dược liệu mọc tự nhiên Việt Nam cũn° xác định chất lươn.2 • • • • • c • • c tác dụng dược lí cịn chưa làm sáng tỏ Trong khuôn khổ dự án hợp tác với CHLB Đức: Nghiên cứa chơi có ỉìoat tính sinh học Việt Nam Các chất có hoạt tính sinh học £ần 100 • • • • • lồi nấm lớn nghiên cứu, 50 chất xác định tới cấu trúc phân tử, có khoảng 30 chất có cấu trúc cho khoa học mò tả [14] Một số chất có hoạt tính cao, kìm hãm hoạt động tế bào ung thư, tăn2 , khả nãng miễn dịch thể, kháng vi sinh vật gây bệnh, chống viêm có khả ứng dụns lớn dược phẩm, mỹ phẩm [12] Đặc biệt gần “Cổ linh chi” (thưc xác lànấm linh chi đa niên nấm đa niên) đặc biệt lưu ý ADN polymeraza enzim xúc tác cho phản ứng nhân sen PCR (Polymerase Chain Reaction) phản ứng trùng hợp chuỗi nucleotit (chiều 5’-3’) theo nguyên tắc bổ sung so với sợi ADN khn (template) có mặt cặp mồi Kỹ thuật PCR kỹ thuật quan trọng cho sinh học phân tử Phản ứns PCR khơng đơn giản nhân dịng gen nghiên cứu mà phát triển nhiều kỹ thuật khác nghiên cứu ứng dụng lĩnh vực Nông Sinh Y RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) AP-PCR (Arbitrarily primed - Polymerase Chain Reaction), PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism) kỹ thuật finger printing khác như: SSR (Single Sequence Repeat), minisatelite Trong kỹ thuật di truyền kỹ thuật PCR dùng cải biến een tạo đột biến điểm, tạo đầu nối (adaptor) để gắn đoạn gen với Tronơ lĩnh vực nchiên cứu ứng dụng phải kể đến hàng loạt loại kit PCR RT-PCR nhằm chẩn đoán nhanh bệnh vi khuẩn, vi rút, bệnh di truyền cho người, động vật, tôm cá thực vật vv Rõ ràng phản ứng PCR có ứng dụng rộng lớn nhưna yêu cầu tiên phản ứng tính đặc hiệu (hay độ xác) cao Đây yêu cầu bắt buộc cho enzim ADN polymeraza dùng cho phản ứng PCR nhiệt độ cao, đoạn mồi (primer) bám đặc hiệu vào sợi khn Đến có nhiều nghiên cứu đề cập đến đặc tính loại ADN polymeraza có nguồn gốc từ vi sinh vật ưa nhiệt Sulfolohiis.soifuiaricns Bacillus slcì ioỉỉtcrphilus Thenmis aquaticus, Thermits íhcrììĩoplìilus hav Pyrococus fumaricus Tuy nhiên, thực tế enzim phổ hiến chủ yếu ADN polymeraza tinh trực tiếp (native) sản xuất theo đường tái tổ hợp (recombinant) từ gen ADN polymeraza vi khuẩn Thenmis aquaticus Một enzim khác dùng số phòng thí nghiệm giới lưu hành thị trường ADN polymeraza sản xuất từ vi khuẩn Pyrococcus furiosus có tên thương mại pfu Tính phổ biến enzim ADN polymeraza Thermits aquaticus tronơ nghiên cứu sinh học phân tử giải thích đặc tính ưu việt như: enzim có hoạt tính cao bền nhiệt enzim ADN polymeraza khác, enzim ADN polymeraza có khả nhân gen với cặp mồi đặc hiệu (specific primers) mồi vạn nâng (degenerate primers) Điều có ý nshĩa quan trọng cho việc tách dòng gen kỹ thuật PCR dựa vào chuỗi axit amin biết protein nshiên cứu Ngoài ra, nhiều nghiên cứu chứng minh vai trị enzim nói xúc tác cho phản ứng giải trình tự ADN (sequencing) chép ngược ADN từ sợi khuôn ARN mà không enzim ADN polymeraza có Vì việc nghiên cứu tích cực thành phần lồi , định loại mơ tả đặc điểm sinh học chúng thiên nhiên phân lập thuân khiết dể bảo tồn nguồn gen, bước đầu định loại chúng sinh học phân tử, nshiên cứu môi trường nuôi cấy, xác định nhóm chất chất có hoạt tính sinh học số lồi nấm quan trọng, khảo nghiệm việc sử dụng thể loài “liệu pháp nấm đa niên” nghiên cứu sản xuất chế phẩm Taq ADN polymeraza thay sản phẩm nhập ngoại có nghĩa khoa học va thực tiễn Di I n n én hoc va ứng dun ‘ ị - C ln n én san C õ n g nghẹ Sinh liọc 2003 - 2004 SUM M ARY R E S E A R C H ON B IO L O G Y O F T H E P E R E N IA L S P O N G IU M L IN Z H I T O M O P H A G U S C O L O S S U S IN V IE T N A M T rin h T am K iet, H o a n g V an V in h , V u T h i K im N gan , T rin h Tam Bao C e n ter o f B io te c h n o lo g y - V ietn a m N a tio n a l U n iversity, Hanoi T h e ty p ic a ll agar S p o n g iu m g a s te ro s p o re s m e d iu m p ro d u c e d p ro d u c e L in z h i s tr a in under w ith th e fu ll d e v e lo p e d a T o h in te r e s tin g o p tim a l o n a a a r m e d iu m o rn a m e n t th e c o n d itio n s O n fr u itb o d ie s lo tt o f b a s id io s p o r e s w a r c u lt iv a te d on a fte r -4 u p s e id e and saw dust fu ll d e v e lo p e d s u b s tra t days T hese o f b a s id io c a r p as and th is as on th e s a w d u s t s u b s tra t T h e f r u it b o d ie s s tr a in fr u itb o d ie s w e ll on a re w ar w e re g r o w in g r e la tiv p ro d u c e d v e ry g ig a n tic s u b s t r a t T h e y a re on fa s t a n d a n d a b l e to due to g ro w p e r e n ia lly N g i th m đ ịn h k h o a h ọ c : T S P h m Q u a n g T h u J G en eric* íiiu ỉ A p p lic a tio n * - S p e cia l Issue: B io te c h n o lo g y C e n te r o f B io u rh r.o lo g y - V ietnam N a tio n a l U n iv ersity H anoi 131 I/I If VU II/IỊỊ a ụ n g - u 111I y e n s u n u OHg n g n c J i n n I U K 200 Ì ~>004 NGHIÊN c ú S ự MỌC VÀ s ự HÌNH THÀNH QUẢ THỂ CUA NAM LINH CHI ĐA NIÊN (CÔ LINH CHI) G A N O D E R A Í A A Ư S T R A L E Trịnh Tam Kiệt, Hoàng Văn Vinh, Vũ Thị Kim Ngân, Trịnh Thi Tam Bao T ning tám C ông nghệ Sinh học - Đ H Quốc gm H nội I C ác Đ Ặ T lo i n ấ m có ý n g h ĩa th ự c q u a n tiễ n V Ấ N th u ộ c trọ n g Đ Ể m KẾT QUẢ NGHIÊN c ú u G a n o d e n n a ta c e a e h ọ m ặ t kh o a học Đặc điểm thể nấm tự nhièn G a n o d c r m a a u s t r a le ( F r ) P a t v ì G a n o d e rm a rô n g lu c id u m r ã i, k ẻ nghèo khả n ă n g đáo n iê n v lo i g ần đa nấm n ả y n h iê n , v i ệ c đ ể u n g d ịc h m (4 ) n g h iê n c ổ m th ể b ện h bệnh L in h n ă n g nư c m ọ c c h i đơn m ộ t n g u n n ăm dược Đ ô n g số s ự h ìn h P o ly p o r iis liệ u T u y F o m e s L in h c h i đ a n iê n n ó i c h u n g M y c o l a u s t r a ìe o r o f la v u s to rn a tu m - Đ ảm m ột c u ố n g , lie - g ỗ M ũ năm h ìn h a u s t r a le n ó i r iê n g h ầu 88 9; to m a tu s - P e rs (P e r s ) B re s - G a n o d e rm a o r o fla \ - u m hay n h iề u năm , khơno q u t, k íc h th ó c - X 12- 80 X 2,5-9 cm; mặt màu nâu đen hay náu xám, khơng bóng, vịng đ n g tâ m rõ rệ t, đ ô i k h i n ứ t n é ; m ép tù, đ n g m àu v ó i m ũ h o ặ c đơi có màu nâu đ ỏ M ô đ ề u m u đ ấ t s o n h o ặ c n â u v n g , n c h ã c , d y th n h c m , v i lớ p v ỏ m u đ e n Ó n g m u n â u tớ i lo i n â u s ẫ m , p h â n tầ n g , m ỗ i ló p G a n o d e rm a :6 P o lv p o r u s F r , - L lo y d , F r (L lo y d ) T e n g , khoảng th ể Soc G a u d ,- G a n o d e r m a apud s in h d ụ n g ứ ng c h i m ất m ộ t n h ậ n c ác liệ u T ro n g B u ll chi dược h o t tín h lin h rã i chi L in h c h ấ t có k h ả u L in h c h ố n g v N ấ m v p h ò n g g h i rộ n g N a m lo i d ù n g th c ủ a đư ợ c n iê n , V iệ t đư ợ c đ â y , n h ó m dược n u i t r n g q c ác s e n s u la t o m iễ n cơng tr ìn h học đ ộ c n a y E lf w in g ia ) (d i c h i h iể m h iệ n d y -7 u m B e m ặ t lơ cịn m u n â u h a y n â u v n g , đ ô i k h i m u v n g ; lơ g n t r ị n , chư a đ ợ c t iế n h n h V ì v ậ y , v iệ c n g h iê n u -5 m ọc nhằm h ìn h th n h tạ o n g u n n g h iệ p d ợ c c ó q u ả n g u y ê n ý k h o a th ể liệ u h ọ c củ a c h ủ v lo i n ấ m đ ộ n g th ự c lỗ /m m n ày V ỏ ch o công tiễ n m ũ c ứ n g , đ ợ c tạ o th n h b i sợ i n g u y ê n thuỷ suốt vách mỏng sợi cứng vách dày màu lớ n n â u d ín h lạ i v i n h a u ; t r ê n b ê m ặ t c ủ a v ò v i r â t n h iê u n PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU n h ữ n g s ợ i tr o n g s u ố t n h n g k h ô n g d ễ đ ê p h â n b iệ t h a i lo i; s ợ i n g u y ê n C hủng n ấm đựoc phân lậ p từ th ể th u ỷ có đ n g k in h -3 ,5 um , đôi tư i k h i c ó c c đ ầ u h ìn h c h u ỳ ; s ợ i c ứ n g đ n g k ín h - ,5 m ọ c tự n h iê n n g h iê n h iệ n lư u trữ tạ i B c h pm th ả o n u ô i t r n g c ủ a p h ị n g t h í n g h i ệ m G iố n g g ố c n ấ m H ệ - T T C ô n g n g h ệ S in h h ọ c - Đ H sọi m ô tr im itic ; sợi nguyên th u ý tro n g Q u ố c g ia H N ộ i C ó suốt vách m ỏng, phân nhánh, có vách ngăn, đường k í h iệ u E k ín h - P hư ong pháp nuôi cấy, đánh đ iể m s in h h ọ c t h ự c h i ệ n t h e o T r ị n h T r ịn h T a m g iá v ề c c đ ặ c T a m K iệ t (1 ), K iệ t v c ộ n g s ự ( ) ; đ n h g iá s ự m ọ c đ ộ d y c ù a n ấ m t i ế n h n h t h e o c c p h n g p h p n g h i ê n c ứ u tự n h iê n hoá lý N M R ( U d o G r a e fe a n d o th e r, 0 ) H P L C , -5 d n g c â y h o ặ c d n g k i m , t r ụ c c h ín h c ủ a s ợ i c ứ n g um k ế t th ú c b a n c q u tr ìn h b ệ n d n g r o i; s ợ i b ệ n khơng m àu tó i n â u v n g n h t, v c h d y p h ả n n h n h ( v ó i g ó c g ầ n v u ô n g ) , đ u n g k ín h th e o S c h w a n te s ( ) V i ệ c n g h iê n c ứ u c c c h ấ t c ó h o t t ín h s in h h ọ c h ợ p c h í t đặc Ịiin ; s ọ i c ú n g n â u n h t tó i n â u , v c h d y tó i M S hố B o từ đ m - ^ im c ó k íc h th c - ,5 X -1 ,5 ( - 12) |iin hình trịn, elip rộng hay cụt đầu m àng hai lóp- l ó p n g o i t r o n g s u ố t n h ẵ n , l ó p t r o n g c o gai rõ rệt, nâu nhạt tới nâu J Genetics and A pplications - Spcciaì Issue: Biotechnology Center o f B io te c h n o lo g y -V ie tn a m N ational University H anoi í I ini', én 11'C va ínttỊ ílụnỵ ' c lun CH s a il - 2003-2004 Clin” i i í ị I ic Sinh học N i s ố n g : tr ê n c c c â y đ a n a s ố im v đ ã c liẻ t P h â n b o : T r u n o Ọ u ố c v ù n " n h iệ t đ i v b n n h iệ t đ ó i tr ê n th ế g i ó i R ấ t k h ó đ ẻ p h n b iệ t lo i n y G với a p p la n a t io n Các đặc đ iể m sạu đày có th ê y đ ợ c sừ d ụ n g (b ả n g Bùng 1: So sánh m ột số đặc điêin cùa Canoderm a australe G apphuiatum G a n o d erm a G cm oderm a a u s tr a le a p p la n a tu m K íc h th c - , X - (- 7-8 (- ,4 ) X b a o từ 12) ịim , - u m cứng, gân n hư có v õ d è v ỡ với c ấ u trú c v ỏ v ấ n h ợ p m ộ t vài c h ỗ Đ ặc điẻm M ật vỏ m ũ H ình 2: Q uá th ể tliànli tliục cùa E1 g iá th ê m ùn cưa d n g lơ ng Mơ c ó ló p v ó đ e n k h n g có Phân bơ n h iệ t đ i v n h iệ t ô n đới đới Nghiên cứu mọc hình thành qiiả thể S ự m ọ c c ủ a n ấ m Ở phát tr iể n chùng với trê n m ô i trư n g th c h (G a n o d e rm a E1 tố c độ tru n g b in h , a iís t r a le ) , dạt hệ khoảng sợi H ình 3: Q uả th ẻ thành thục cùa E1 240 g iá th ể m ùn cua Ịx m /g iờ , m u tr ắ n g , k h d ầ y C h ú n g c ó th ể h ìn h th n h c c g i ọ t n c t r ê n b ề m ặ t h ệ s ợ i K h o ả n g -1 n g y K h i q u a n s t b o t d i k í n h h i ể n v i đ i ệ n tử q u é t ta s au c h ú n g c h u y ể n m u từ tra n g s a n g v n C c sợ i g ă n đ iể n v i n h a u rấ t c h ặ t T r ê n v ế t n ứ t, đ ỏ i k h i m b ề m ặ t c ó n h iê u n é p n h ã n v b iế n d n g c ả k h u ẩ n lạ c T r ẽ n m i th ấ y h ìn h chúng có c ủ a lo i n ấ m th ể m ọc k iệ n c ó đ ộ ẩ m gờ tra n g t r í d n g k in h tu y ế n n y , g ầ n t n g tự v i b o tủ t ự n h i ê n K h i n u ô i c ấ y o n g đ iề u c a o c c b o từ n ả y m ầ m c ũ n g đ ã q u a n s t th â y tr n g th c h , c h ù n g th n h m ầ m 2 S ự E1 chưa quan s át th ấ y s ự h ìn h m o n o q u th ể c ũ n g n h q u th ể n o n m ọc v s ụ h ìn h th n h q u ả th ẻ trẽ n g iá th ê m ù n cư a M ù n cưa 50 b đ ề đ ã c ó b ô s u n g d in h d õ n g sứ dụng đẻ nghiên cứu m ọc hình thành quà thẻ chủim nấm nói T r o im tỏ i, c h ù n íí E1 m ọc tố t trê n s iá th ê , h ì nh t hà n h sợi n â m m u t r ă n g , đ t t ốc đ ộ k h o ả n g Lull'll K h i c ó c c đ i ể u k i ệ n t h í c h h o p c h o s ự h ì n h t h n h q u t he c h ù n s ĩ E1 c ó k h n ă n g p h t t r i ề n t o t hà n h q u t hè t h n h t h ụ c , với ô ni ỉ n ă m đ i ê n h ì n h đ â u tiên m u t r ănu sail c h u y ê n s a i l ” m u n â u x m n h t \á J.1I 11 b o t d i ê n h ì nh T h ị i e i a n h ì n h t h n h q u t hè t h n h t hục dai toi c h ì m L 120 tơi 140 n u y i Hình 4: giá bào tử IU ni cấy thiián khiẽt I C c n c iu > ih l A i y ỉ i c M o n s ■ S p e c ia l k i t t c : B io t e c h n o lo g y C o m r I ‘ B it >ĨCL h i u í - V ie t n a m N a t i o n a l U n iv e r s it y H a n o i Di tniyén lìọ c W ig d ụ n g - C h u yê n san C ô n g nghệ S in li hoc 2003 ■2004 A in s w o r t h , B is b y 's ( 9 ) D ic t io n a r y - o f th e F u n g i, U n iv e r s ity P re s s C a m b r id g e K ie t, "T Jew th e ir and T T , D o e r fe lt in te r e s tin g b io a c tiv e K e n -ic h ir o , H m a c ro fu n g i com pounds”, s , G e fe T a ts u ji, In : I n n o v a t iv e s , K le in w a e c h te r Hình : Giá bào tủ E trẽn thể tự nhién B , (2 0 ), IV T À I L IỆ U T H A M K H Ả O p , H A nh, new fro m a K iệ t, T T , L iê n , V M , V ệ , Đ V lã th u ậ t n u ô i trồ n g Nông nghiệp, n ấm ă n , N h w o f T G e fe T , u t r it e r p e n o id m u s h ro o m (2 ), -2 R y v a rd e n L , Johansen I (1 ), A xuất p r e lim in a n r y N ội H and (1 ), S in h h ọ c v A , V ie t n a m e s e G a n o d e r m a c o lo s s u m “ , J N a t P r o d R o le s K ie t H a r te l, „ C o lo s s o la c to n e s , M C h ib a N , -M , m e t a b o lit e s Dahse (2 0 ) o f V ie tn a m M a k o to B io lo g ic a l R e s o u r c e C e n te rs , -1 S c h le g e l u p o ly p o r e f lo r a o f E a st A f r ic a , G r o e n la n d s G r a f is k e A / c O s lo , N o r w a y K iệ t, T T , U d o G e fe , N h ữ iig n g h iê n u chi L in h c h i H ả i m iê n S c h w a n te s , H „ M e io d e n N anuN hững vấn đ ề U nd S a ltt le r , p w ( ) , T o m o p h a g u s M u r r ì l l c ủ a V iệ t n g h iê n u c b ả n tro n g zur M essung der kh oa W a c h s tu m s g e s c liw in d ig k e it von P ilz m y c e lie n “ , lìọ c s ự s ô h g , T - , N h x u ấ t b ả n K H K T , 0 O b e r h e s s N a t u m ’is s Z e it s c h r , - S U M M A R Y S T U D IE S A B O U T T H E G R O W IN G A M ) FR UITIN G O F THE PEREISTAL LINZH I G A N O D ER M A A U STR A LE Trinh Tam Kiet, Hoàng Van Vinh Vu Thi K im Ngan, Trinh Thi Tam Bao C enter o f Biotechnology - V ứ tnam N ational Universửy, H anoi T h e p e r e n ia l L in z h i G a n o d e n n a a u s t r a le s tr a in E l w a r c u lt iv a te d o n a g a r m e d iu m as w e ll as o n s a w d u s t s u b s t r a t T h is s t r a i n i s a b l e t o p r o d u c e t h e f u l l d e v e l o p e d f r u i d b o d i e s o n t h e s u b a t u n d e r t h e o p t i m a l c o n d i t i o n s f o r the f r u c t i f i c a t i o n a f t e r - d a y s T h e b a s i d i o s p o r e s o f t h e c u l t i v a t e d f r u i b o d i e s h a v e t h e t y p i c a l l c h a r a k t e r i s t i c a as th e b a s i d i o s p o r e s o f n a t u r a l f r u i b o d y o f G a n o d e r m a a u s t r a l e Ngum th ẩ m đ ịn h k h o a h ọ c : T S P h m Q u a n g T h u i ỉ Genetics and Applications - Special Issue: Biotechnology' Center o f B iotechnology-V ietnam National University, Hanoi Di truyền hoc ung dung Số 2/2005 J G enetics and Applications T T h ị C ú c Hà, 0 G iá o N g u y ễ n 2004 H ổ tr ìn h V ã n K h ả o sát quang v n ă n g trê n n ề n đất học to n H ữ u c ã y A n , Đ ín h , k h ả N g h iê m u N x b N h s in h trư n s , n ăn g q u ố c B o P h ú c k h o a i c o h ộ i B íc h N g u y ễ n T h ị K i m T h a n h H o n s M i n h T n n s h iè p N g u y ẻ n s u ấ t m ộ t s ố g iố n g V T n h T h i N ô n g Nguyễn K h a n h huỳnh tã y M n h H ù n g , 9 K h ả n ă n g sử d u n °- giống khoai tây nhãp nội từ Đức vào p h ía Bắc V iệ t L u ậ n N a m n T iế n Kha sinh t ây t r ổ n g ' ! c ù 9 - 9 N x b N ô n g N g h i ệ p - 49 Đ o 1996 K h o a 0 , - Thạch in v itro K ế t q u l ig h t e n cínt k h o a h o c ir o n ? trot trổ n g n g lự Quang trương nân g suất c u a khoai s ĩ N g u y ễ n số M ộ t tìn h k h o V ă n tây V iế t 1990 Đ iể u k iê n k h í háu Đ ô n g đ ố n g b i n s B ắc Bộ vụ q u ả n g h i ê n c ứ u k h o a h o c c ủ y k hoa i kết t â y - 9 N x b N ô n s n s h i é p 90- 92 N ò n g n g h iệ p S U M M A R Y C o m p a r is o n e ig h t p a ta to b r e e d s th e in s o il m id la n d o f v in h p h u c p r o v in c e o f p h o t o s y n t h e s is a n d p r o d u c t iv it y C o m p a r in g e ig h t p a ta to after d a y s ; c h lo r o p h y ll, m e d iu m 35 days b re e d s and g ro w th 50 days in th e s o il o f X u a n of growth, we have H o a o f V in h found phuc p ro v in ce the follow ing: p h o t o s y n th e s is t h e t ot a l c o n t e n t o f D i a m o n t , E b e n a n d S o l a r a h a v e t h e g r e a t e s t c a p a c i t y ; R e d s t a r H H a n d C V h a v e t he c a p a b ilit y : R e g a r d in g th e p h o t o s y n th e s is : K T and M a r ie lla K T , have and c v M a r ie lla th e Eben p h o t o s y n t h e s is le a s t Redstar and Diam ont have the m e d i u m have the capability: greatest H H capacity f or a n d S o l a r a h a v e t he le a s t p o t e n t i a l O ur C o m p a r in g th e h i g h e s t y i e l d ; e ig h t K T , p a ta to b r e e d s in p r o d u c t i v i t y s h o w s that: E b e n M a r ie lla and D ia m o n t p ro d u c e the m e d iu m vieid: C V H H and Redstar produce and S o la r a p r o d u c e t he lo w e s t y i e l d N gư i th ẩ m đ ịn h n ộ i d u n g k h o a hoc: P G S N g u y ễ n V ã n M ã CYTOTOXIC AND ANTIPROLIFERATIVE EFFECTS OF AQUEOUS AND ETHANOLIC EXTRACTS OF VIETNAMESE PERENNIAL POLYPORES ON HUMAN CELLS T r ịn h T u rn B C o l l e g e o f S i c i e n c e - V i e t n a m S ’a t i o n a l U n iv e r s ity , H a n o i T r ịn h T a m K iệ t C e n t e r o f B i o te c h n o lo g y ■ V ie tn a m N a tio n a l U n iv e r s ity H a n o i H H a n s - K n o l le - I n s titu te f o r N a tu r a l p o r d u c ts R e s e a r c h J e n a , G e rm a n y -M D a 35 D i truyền hoc úng dung S ố /2 0 J G enetics a nd A p o lica tio n s For millennia, by m ushrooms humankind resource A including as number in are bioactive the best and (Wasser 2002) valued medical molecules, have • mushroom been species known m ushroom -derived antitumor been and substances, many Polysaccharides have edible of anutum or identified potent an and most substances im m unom odulateins Moreover, the with properties sm all-w eighed m o l e c u l e s s u c h as t e r p e n s are al so p r o v e d that h aving p h a r m a c e u tic a l properties funai classification, techniques medical annual and about properties, funsai biolosy, et c of much the present we in h is h ) d e n s ity H e la culture s u p p le m e n te d s o d iu m NS w ith B R L bovine 10 ml / u /m l R P M I 1640 21875-034) p e n ic illin 10% (GIBCO non-essential at at (N U N C G- s tr e p to m y c in -s u lfa te -1 ), 1 -0 ) in BRL 00 serum fla s k s g ro w n s a lt/1 O O u ợ /m l (G IB C O fetal w e re (GIBCO 10500-064), -0 ) p o ly e th y le n e c e lls m edium BRL B R L h e a t-in a c tiv a te d BRL 10500-064), amino-acid °c in po ly eth y len e flasks ( N U N C (GIBCO h ig h d e n s ity ) T h e cell's w e r e h a r v e s t e d a t t h e l o g a r i t h m i c g r o w t h phas e a f t e r s o f t t r v p s i n i z a t i o n u s i n s , % t r y p s i n in some However, study, °c (GIBCO (G IB C O cultivation important the HBSS containing 0.0 % perennial 25200-056) p o l v p o r e s p e c i e s ar e still not s t u d i e d c a r e f u l l y In serum L -g lu ta m in e compounds, bioactive species bovine and B R L In r e c e n t d e c a d e s , p e o p l e h a v e s t u d i e d about fetal investigated EDTA ( G I B C O BR L A n tip r o life r a tiv e a n d c y to to x ic a ssa y s the T h e c e lls w e re in c u b a t e d w ith te n effects ethanolic and aq u e o u s ex tracts o f s o m e c o n c e n t r a t i o n s o f the test c o m p o u n d s F or eacs wood-inhabiting assay 10000 RPMI 1640 polypores on the growth h u m a n cervix c a r c i n o m a (Hela) A f r i c a n monkey kidnev hepatocellular ỉ'Vero-B4), carcinoma of Hreen human (Hep-G2) squam ous cells were culture -0 ) c o n t a in in g fet al bovine c a r c in o m a ( m o u th ) (C L S -3 ) and h u m a n breast 100 u/m l carcinoma streptom ycin-sulfate (M DA-M B 436) cells (Strains are signed E l H i H3, N l , and Pi) in to -w e ll P r e p a r a t io n th e p o lv p o r e c e lls in w e re m l w e re 10500-064) BRL ten 14 - 1 4) p la te s w e re dilutions 64 fo r ml BR L sal t / 10 0| Li s / ml T h e R P M I p r e in c u b a te d s u b s ta n c e s C e lls e x tra c tio n s (GIBCO m ic r o p la te s 0,1 h e a t-in a c tiv a te d BRL G-sodium with with (GIBCO 10% (GIBCO prepared s u b s ta n c e s M E T H O D S serum penicillin previously seeded m edium 48 h o f test m e d iu m H e la w i t h o u t t h e te s t in c u b a te d fo r h at °c in a h u m id ifie d a t m o s p h e r e a n d % C O ; We have sa m p le s s p e c ie s , th e y N igrofom es G a n o d e rm a a re : sp of V ietnam ese P h e lliu u s (Nl), sp, sub sps P erenniporia senus E lf w in g ia fungal (H , H I), sp (PI), (E l) T o The monolayer glutaraldehyde solution of of the and cells were stained m ethylene blue fixed with for 15 a by 0,05% Af t e r s e n t l y w a s h i n g t h e s t a i n w a s e l u t e d b y , m l of extraction, we take 0 g e a c h sa m p le W i t h e a c h ,3 s a m p l e , w e b o i l it w i t h w a t e r t i m e s , e a c h i n were m easured N H C in th e w e lls at T h e nm o p tic a l d e n s itie s in a Dynacech MR hours T hen, m i x solutions and boil d o w n until 0 w e different values w ere p e r f o r m e d w ith Microsoft have about - m l lyophilized T h e n T h e s o lu tio n s we dissolve th e m again a re with w a t e r a n d s t o r e in t h e r e f r i g e r a t o r T h e rest m a te ria ls are d ried samples are again extracted values by s u n lig h t A ll in E x c e l Ethanol 96%, growth m ic r o p la te F ro m th e re a d e r dose CASYSTAT 50%) evaluation and th en d i s s o l v e a g a i n w i t h E t O H a n d st o r e in where ihe r e f r i g e r a t o r f o r later e x p e r i m e n t s were intersected the % sodium were cultured in 10 m e d i u m i G I B C O B R L 4 - ) supplemented with 100 salt lO O i i s/ m l iGIBCO BRL The IC50 c u rv e s th e inhibited calculated software was o f IC cell wi t h for da t a as being defined concentration-response line, d e t e r m i n e d ih e cur ve bv means o f the c e ll c o u n t s / m l , c o m p a r e d to c o n tr o l C e l l s a n d c u l t u r e c o n d i t i o n s RPM1 the which (Schofe), ° S t f in h o u r s A f t e r h o u r s , w e d i s t i l l t h e m C e l l s or a d h e r e n t c e l l l i n e s re s p o n s e (concentration by C o m p a r is o n s u /m l p e n ic illin G- streptomvcin-sulfate i5 140-114), 10% h e a t- in a c tiv a te d R E S U L T S A N D D IS C U S S IO N T h e r e s e a c h d a t a are d e m o n s t r a t e d in table I and differend figures: D i truyền hoc ứng duna Số Z'2CC5 36 J G enetics and A pplications N1 E1 H3 H1 P1 Mix First concentration 775 84 oo CD IC (n g /m l) 0 6 6 6 68.7 > > 1.74 > > 775 5 186.1 7 9 6 7.4 2.8 267 88 6.4 53 > > 5 5 475 104.3 101 187.6 112.1 9 194.6 > 656.6 136.81 32.89 133.5 I 198 11.1 7.5 > Ì 19.1 Hela 5 3 > 52 77.3 73 34.6 ! 63.9 MDA-MB Vero-B4 Hep G CLS-354 ! 165.2 > 9.3 50.4 i 73 > > 1.74 A queous T a b le 1: IC o f th e e ffe c t o f a q u e o u s a n d p e r e n ia l p o h p o r e s o n pol ypores The IC50 extracts in c o mp l e t e l y d i f f e r e n t values are concentrations aqueous In higher used, extracts or values some than such in of these the cell some cases, even as the The are in Hela with with values are smaller curves of figures aqueous al l extracts o f N l E l P I a n d m i x t u r e H o w e v e r , i n A n t ip r o life r a t iv e a n d A q u e o u s C y to to x ic E ffe c t o f E x tra c t H 38,5 ^ C o n tro l o < the on cell proliferation peremal after 72 h o u r s o f i n c u b a t i o n a r e d e p i c t e d in t h e f o l l o w i n g first V ero-B4 the I C dose-resonse polypore extracts IC50 the other cases, t h a n L i a / ml perenial lines —i h a n 1ĩc c e ll c u lt u r e The I C v a l u e s w e r e f o u n d a n d s h o w n i n t h e table a b o v e e t a n o lic e x t r a c t s —o — V e r o - o — c~— H e p - G c o *0 u o Ư ) Q J > > —*— C L S - — »— H e l a —0 — M D A - M B fw 0) C o n c e n t r a t i o n (ụ g /m l) I truyền hoc ứng dụng, s G enetics and A p p lic a tio n s ố /2 0 3't Antiproliferative and Cy to to xic Effect of A q u e o u s E x t r a c t H3 C o n t r o l o Õ < _ õ Ũ C D —X— H e L a = o Ũ —o — V e r o - B H ep-G * > CLS-354 —0 — M D A - M 6 : C o n c e n t r a t i o n (|jg /m l) A n tip rolife rativ e and C y t o t o x i c Ef f ect of A queous ExtractNI 100 - _ _ ^ C o n t r o l < _ o "5 ^ 50 \V \ \ —X — H e L a —o — V e r o - B \ x _ : H ep-G s> > —X— C L S - —o — M O A - M : 1000 C o n c e n t r a t i o n (jjg /m I) Antiproli fe rativ e and C y t o t o x ic Ef fec t of A q u e o u s E x t r a c t E1 C o n t r o l —X — H e l a _ < o °o !? > —o — V e r o B - ti— H ep-G - ^ — C IS -354 —0 — M D A - M B C o n c e n a t i o n (pg/ml) Di truyền hoc va ứ n g C u n g S ố 2: : - J G enetics s n c A c c lc - - ^ r s A n t ip r o life r a t iv e a n d A q u e o u s C y to to x ic E x tr a c t E ffe c t o f P1 100 o Q C o n tro l < _z V 0 ) c o —X — HeLa Ũ > —it— H e p -G - — - oz —3 — V e r o - Q C L S -3 —0 — M D A - M B 1000 C o n c e n t r a t i o n (p g/m l) A n t i p r o l i f e r a t i v e a n d C y t o t o x i c E f f e c t o f M i xt u r e o f A q u e o u s Extracts — 0) u w c o w ^ - C o n tro l — X — H eLa —3— V e r o - B —-Ù H e p -G — cn —X — C L S - — 0— M D A - M B C o n c e n t r a t i o n (Ịjg/m l) A n t ip r o lif e r a t iv e a n d C y t o t o x i c Ef fect of E t h a n o l i c E x t r a c t N1 - C o n tro l o Õ — X — < _ Ộ = o o Õ ỊỘ < > D HeLa —3 — V e r o - B —ứ -— H e p -G — 4— C L S - ro —^ - M D A - M B ^ cn C o n c e n t r a t i o n ( p g / m l) 31 D i truyển h oc ứng dụng, s ố 2/'2005 J G e ne tics a nd A p p lic a tio n s Antiproliferative and C y t o t o x ic Effect of E t h a n o l i c E x t r a c t E1 i/(t» „ 100 - C ontrol I — X — H eLa —o— V e r o - B — Ù— H e p -G C LS-354 _^_M D A -M 436 1000 C o n c e n t r a t i o n (p g /m l) Antiprolifer ative an d C y t o t o x i c E ff e c t of Eth an olic Extract H3 — — C o n tro ! —X — H eLa s < E _ o ặ o —o — V e r o - B —Ù— H e p -G > — C L S -2 - Í -— —0— M D A - M B C o n c e n t r a t i o n (|jg/m l) A n t i p r o l i f e r a t i v e a n d C y t o t o x i c E f f e c t of E t h a n o l i c E x t r a c t H1 — — C o n tro l c ° < c _ o Ộ u — y — H eLs ỏ e — L— H e p -G —o— V e r o - B i < > -^ -C L S -3 _ < _ M D A - M E