Công Nghệ Enzyme Lipase Le Tri Kieng

Giới thiệu chung về Lipase, cơ chế, cấu tạo, và các yếu tố ảnh hường hoạt tính enzyme. Thu nhận tinh sạch en zyme lipase. Các ứng dụng của nó trong đời sống và sản xuất Công Nghệ Enzyme Lipase Le Tri Kieng

6 Trương Thị Thái Hảo

Khoa Công nghệ Sinh học- Thực phẩm- Môi trường

2 Cấu trúc enzyme Lipase _ 4

3 Cơ chế sinh tổng hợp lipase _ 5

4 Phân loại enzyme 6

5 Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme 7

II Sản xuất enzyme Lipase 13

1 Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV 13

2 Quy trình cơ bản thu nhận enzyme từ nguồn động vật, thực vật _ 14

3 Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV _ 15

4 Quy trình sản xuất lipase ngoại bào từ Cadida rugosa _ 16

5 Tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký cột 17 III Phương pháp cố định enzyme lipase 17

IV Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase _ 17

1 Đối với cơ chất dạng lỏng _ 18

2 Đối với cơ chất dạng khô _ 18

V Ứng dụng _ 19

1 Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp _ 19

2 Ứng dụng của lipase trong công nghiệp thực phẩm 20

3 Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa _ 20

4 Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy _ 21

5 Ứng dụng lipase trong quản lý môi trường _ 21

6 Ứng dụng lipase trong công nghiệp hóa chất _ 21

7 Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế _ 22

8 Ứng dụng lipase trong nông dược 22

9 Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa 22

10 Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel 22

11 Ứng dụng lipase trong biosensor (cảm biến sinh học) _ 23

12 Quy trình ứng dụng của Lipase chuyển hóa Biodiesel từ dầu đậu nành _ 23

13 Quy trình ứng dụng của Lipase trong sản xuất phô mai _ 24

14 Chế phẩm enzyme 25 Tài liệu tham khảo _ 26

2

LỜI NÓI ĐẦU

Sự phát triển nhanh chóng của công nghệ enzyme đã mang lại sự quan tâm đáng kể đến việc ứng dụng enzyme lipase trong ngành công nghiệp dầu béo Các phản ứng sử dụng enzyme lipase mang lại nhiều lợi ích hơn các phản ứng hóa học thông thường Lipase có thể sử dụng một cách hiệu quả và kinh tế trong điều kiện ôn hòa Đây là đặc điểm quan trọng, bởi

vì điều kiện khắc nghiệt sẽ gây ra các phản ứng trùng hợp chất béo và sinh

ra nhiều sản phẩm phụ Do đó việc sử dụng lipase sẽ làm giảm nhu cầu loại

bỏ các hợp chất màu và sản phẩm phụ bằng phương pháp tốn kém năng lượng

Do đó nhóm chúng tôi xin giới thiệu đến các bạn về loại enzyme vẫn được xem là “chất xúc tác linh động nhất” này thông qua các phần sau đây:

3

ENZYME LIPASE

I Tổng quan về Lipase

1 Tên enzyme

Lipase (EC 3.1.1.3) còn có tên khác là Triacylglycerol lipase

Thuộc nhóm enzyme hydrolase, cắt đặc hiệu các liên kết ester

 Là enzyme tan trong nước xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerol không tan trong nước tạo thành các glyceril và các acid béo tương ứng nhờ hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu-nước

 Lipase xúc tác phản ứng thủy phân cắt đứt lần lượt các liên kết α-ester chứ không cắt cùng một lúc 3 liên kết Quá trình xúc tác thường chậm hơn so với các enzyme khác như protease, amylase…

EC 3 Hydrolase Nomenclature

EC 3.1 Acting on

ester bonds

EC 3.1.1 Carboxylic ester hydrolases

EC 3.1.1.3

triacylglycerol lipase

4

 Hoạt động mạnh trong hệ nhũ hóa, đặc biệt là hệ nhũ đảo Tại bề mặt phân cách giữa pha nước với các pha không hòa tan chứa cơ chất

Phản ứng thủy phân triacylglycerol thành glycerol và các acid béo

2 Cấu trúc enzyme Lipase

Tâm hoạt động của lipase là bộ ba: Serine, Histidine và Aspartate/Glutamate

Phía trên trung tâm hoạt động có vùng kỵ nước được hình thành sau khi lipase được hoạt hóa Ngoại trừ các điểm chung về khả năng xúc tác thông dụng thì lipase từ những nguồn khác nhau có rất ít điểm chung ở cấp độ amino acid Do đó, sự hiện diện của serine ở tâm hoạt động được xem là có tính bảo tồn cao và thường xuất hiện trong

chuỗi pentapeptide Gly – Xaa – Ser – Xaa – Gly

5

3 Cơ chế sinh tổng hợp lipase

Giống như sự tổng hợp protein, lipase sẽ được hình thành khi trải qua các quá trình phiên mã, dịch mã và sau dịch mã Tất cả các quá trình thực hiện bên trong tb chất của VSV

Đầu tiên là sự phiên mã Quá trình chỉ xảy ra khi đoạn gen tổng hợp nên lipase phải được hoạt hóa trước bằng chất cảm ứng Chất này sẽ giúp giải phóng enzyme RNA polymerase thoát khỏi sự kìm hãm của chất ức chế bằng cách kết hợp với chính chất

ức chế đó Bản chất của chất cảm ứng chính là cơ chất chịu sự xsuc tác của lipase Kết thúc quá trình phiên mã diễn ra trong nhân tế bào sản phẩm sẽ là phân tử mRNA, nhưng phân tử này rất dễ bị thuỷ phân trong môi trường tế bào chất Bên cạnh

đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy phân tử siRNA (short interference RNA) được hình thành trong quá trình phiên mã có tác động kìm hãm sự dịch mã hoặc thúc đẩy sự phân hủy những phân tử mRNA Vì vậy số lượng enzyme được tổng hợp sẽ giảm

đi đáng kể

Tiếp theo, quá trình dịch mã sẽ sử dụng thông tin mã hóa trong mRNA để tạo thành mạch protein có thứ tự acid amin chính xác Tuy nhiên, chuỗi polypeptide này rất dễ bị thủy phân bởi enzyme peptidase Quá trình này cần một loại protein “chuyển giao” để tái sử dụng các acid amin của protein có cấu trúc gấp khúc (folded protein)

mà không còn sử dụng được nữa

Khi những polypeptide enzyme đã được tổng hơp khá nhiều thì những polypeptide ở gần nhau sẽ tương tác với nhau tạo thành cấu trúc gấp khúc làm cho khối enzyme trở nên không tan Điều này đã làm cho enzyme mất đi hoạt tính sinh học Quá trình này được điều khiển bởi chaperone, là một đoạn polypeptide có chức năng làm gấp khúc các enzyme trong nội bào trước khi những enzyme này được vận chuyển qua màng mmebrane Đối với pro-pro-enzyme ngoại bào, là enzyme tổng hợp trong tế bào chất nhưng chưa có cấu trúc hoàn thiện, cấu trúc phân tử không được gấp khúc trogn suốt quá trình vận chuyển qua màng membrane Do đó, một số protein khác đã

hỗ trợ enzyme ngoại bào này chống lại sự gấp khúc trong tế bào chất để không hình thành khối protein không tan và chống lại thủy phân nội bào

Hoạt tính của enzyme còn phụ thuộc vào cofactor là những ion kim loại Sự cung cấp không đủ những ion này trong tế bào chất sẽ làm giảm đi hoạt tính của enzyme Vì vậy phải đảm bảo nồng độ bão hòa của các ion đối với enzyme phải thấp hơn nồng độ các ion đó trong tế bào chất

Đối với pro-pro-enzyme, khi không đủ cofactor để đảm bảo hoạt tính cũng như

sự vận chuyển qua màng membrane thì một lượng enzyme này bị giữ lại trong tế bào chất làm ảnh hưởng hiệu suất sinh tổng hợp enzyme

Sau khi được vận chuyển qua màng membrane, enzyme ngoại bào vẫn có thể bị phân hủy bởi enzyme peptidase trong không gian chu chất Trong giai đoạn này pro-enzyme, là enzyme ngoại bào trong không gian chu chất chưa có cấu trúc hoàn thiện, vẫn tiếp tục hoàn thiện cấu trúc của nó nhờ những phân ứng thủy phân

6

4 Phân loại enzyme

Lipase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau : lipase từ thực vật, lipase

từ động vật và lipase từ vi sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn và nấm, đã có một vài lipase thu nhận từ vi sinh vật có giá trị thương mại

Lipase từ thực vật như ngũ cốc trong giai đoạn nảy mầm Lipase từ nguồn thu nhận này hạn chế về hoạt tính lẫn khả năng bền nhiệt, đồng thời nồng độ enzyme là không cao

Nguồn lipase từ động vật quan trọng nhất là từ tụy tạng của bò, cừu và lợn Lipase từ tụy tạng lợn là một trong những lipase được biết đến sớm nhất

và khá thông dụng Hạn chế của lipase từ tụy tạng là chúng chứa những hợp chất

có mùi và vị khó chịu như trypsine, tạo vị đắng nên không được ưa chuộng Bên cạnh đó, nguồn lipase này còn có khả năng lây truyền virus từ động vật sang người nên hiện nay xu hướng sử dụng lipase từ vi sinh vật đang được ưa chuộng

do đặc tính đa dạng, dễ tách chiết và nguyên liệu vô hạn

 Đặc hiệu vị trí:

o Những enzyme không đặc hiệu với vị trí hoặc cấu trúc gốc acyl trên mạch

triglyceride (C.rugosa)

7

o Xúc tác đặc hiệu vị trí 1,3 trên phân tử triacylglycerol (A.niger)

o Chỉ xúc tác đặc hiệu 1 số acid béo nhất định (Geotrichum candidum)

 Đặc hiệu cơ chất: cơ chất có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của

enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme (C.rugosa, A.niger,

M.miehei …)

5 Thông số : nhiệt độ, pH, cofactor, coenzyme

a) Nhiệt độ, pH tối ưu

Lipase chiết xuất từ tụy tạng bị mất hoạt tính ở 400C, nhưng một số lipase ở vi

sinh vật lại có tính bền nhiệt

b) Cofactor

Enzyme lipase hoạt động không cần cofactor, tuy nhiên sự hiện diện của một số

các cation kim loại như Ca2+, Na+ sẽ làm tăng hoạt tính của lipase Hoạt tính của lipase

bị bất hoạt bởi Co2+, Ni2+, Hg2+ và Sn2+, bị kìm hãm nhẹ bởi Zn2+ và EDTA:

Đối với Bacillus sp

• Mg2+ làm tăng hoạt tính enzyme

• Ca2+ tăng tiết enzyme ngoại bào, tăng hoạt tính enzyme

Đối với Geotrichum sp:

• Ca2+ 1mM có tác dụng làm tăng 6% hoạt tính enzyme

• Hoạt tính lipase mất gần hết với Pb2+ 10mM

• Tween 20 làm tăng 10% hoạt tính lipase

• Chất tẩy rửa SDS kiềm hãm lipase hoàn toàn

Các phản ứng do lipase xúc tác đều là các phản ứng thuận nghịch và

chiều hướng của phản ứng phụ thuộc vào lượng nước tham gia vào phản ứng

9

10

Ví dụ về cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân:

Do lipase chỉ hoạt động ở bề mặt phân cách giữa hai pha dầu - nước,

nên lượng dầu tồn tại ở mặt phân cách sẽ quyết định hoạt tính của

lipase => đó là hoạt tính bề mặt của enzyme

11

Do đó, cần áp dụng phương pháp nhũ hóa thích hợp để làm tăng diện

tích tiếp xúc của các tế bào nhũ hóa

d) Cơ chất tự nhiên

Natural Substrates Organisms

Peanut press cake Neurospora sitophita, R.oligosporus

Rice bran, wheat bran Candida sp

12

e) Môi trường nuôi cấy tối ưu sinh tổng hợp Lipase

Môi trường nuôi cấy Cadida rugosa

KH2PO4: 15 g; K2HPO4:5,5 g;(NH4)2SO4:4g; MgSO4:1g; FeCl3:10m g; inositon: 0,004mg; biotin: 0,008mg; Thiamine.HCl: 0,2mg; dầu oliu: 1%; axit palmitic: 1.2 g;H2O: 1000ml

Số tế bào nấm men cấy ban đầu 2,6x10-6 cfu/ml môi trường nuôi cấy

Thời gian nuối cấy 40 giờ

Môi trường nuôi cấy Bacillus sp

Môi trường BMGY với thanh phần: 1% (w/v) cao nấm men, 2% (w/v) bacto-peptone, 100mM kali phosphat, pH 7.0, 4x10-5% (w/v) biotin và 1% (v/v) Methanol

Nhiệt độ 30oC Lắc 220 rpm

13

II Sản xuất enzyme Lipase

1 Quy trình tổng quát thu nhận enzyme ngoại bào từ VSV

Trích ly với dung môi

15

3 Quy trình cơ bản thu nhận enzyme lipase ngoại bào từ VSV

Canh trường lên men VSV

Ly tâm 4000 rpm/15min

thu dịch trong

Tủa protein bằng Amonisunfat

Lọc thu kết tủa

Tinh sạch enzyme theo mục

đích sử dụng

Enzyme

Thu lipase thô

Tủa với sodium sulfat

-Lọc: Thêm nước cất tỷ lệ 1:10

so với thể tích canh trườg, lắc 120rpm trong 30 phút, sau đó lọc bằng màng thích hợp -Ly tâm 10000rpm/15p, ở 4oC

Đệm bằng Tris-HCl 0.2M (pH=8)

Đệm phosphate pH 6.5

17

5 Tinh sạch enzyme bằng kỹ thuật sắc ký cột

Do nguồn thu lipase từ động vật kém bền nhiệt, lại có mùi hôi, sản xuất mất nhiều công sức và tốn kém Hơn nữa, việc lây nhiễm virus động vật là mối lo ngại hàng đầu

Nên việc chủ động nuôi cấy và tách chiết lipase từ VSV ngày càng chiếm ưu thế Người ta sử dụng sắc ký ái lực cho độ tinh sạch cao nhất, nhưng phương pháp này tốn kém, do cột đắc tiền, lại không bền Do nguyên nhân cột hoạt động trên nguyễn tắc sự bắt cặp giữa enzyme và cơ chất, tạo nên phức hợp E-S Nhưng bản thân cơ chất của enzyme được nhồi vào cột là protein, đó là nguyên nhân

mà cơ chất dễ bị biến tính và mất khả năng kết hợp với enzyme

Từ đó, các nhà khoa học sử dụng DNA tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli bằng cách thiết kế gen mã hóa tổng hợp lipase gắn thêm các trình tự mã hóa 6 gốc His ở đầu C (6His lk đặc hiệu với Ni++ trên cột sắc ký ái lực) Mà việc nhồi cột Ni++ tương đối dễ dàng, cột bền, sử dụng rất lâu Từ đó mà thành enzyme giảm, tạo điều kiện cho việc ứng dụng lipase rộng rãi hơn Bên cạnh đó, một số nghiên cứu còn dùng phương pháp gây đột biến, làm tăng khả năng biểu hiện gen, nâng cao hoạt tính lipase

III Phương pháp cố định enzyme lipase

Tuy lipase có khả năng xúc tác nhiều phản ứng có giá trị trong thực phẩm, y học, môi trường, công nghiệp da… nhưng việc ứng dụng còn hạn chế bởi chi phí cao Có thể khắc phục với pp cố định enzyme với mục đích thu hồi và sử dụng nhiều lần, không tốn chi phí cho quá trình tách bỏ enzyme sau khi thu hồi sản phẩm Có 3 pp được sử dụng:

 PP hấp phụ vật lý: Dẫn xuất enzyme lipase từ C.antarcrica B cố định trên

Octadecyl-Sepabead giữ được 100% hoạt tính sau khi ủ 200h/50oC/pH=7 Lipase được hấp phụ trên chất mang kỵ nước rất ổn định với nhiệt độ và sự vô hoạt của dung môi hữu cơ Mặc dù phương pháp này đơn giản nhưng dẫn xuất của enzyme này có tính ổn định nhiệt hơn các phương pháp khác

 PP liên kết cộng hóa trị: Lipase đã được cố định thành công nhất trên các chất

mang là chitosan, agarose, …làm tác nhân hoạt hóa nhóm cacboxyl của chất

mang khi cố định enzme lipase từ C.Rugosa Ưu điểm của carbodiimide là khả

năng hoạt hóa cao, độc tính với enzyme thấp

 PP nhốt/bao gói: Dùng các polymer dạng hạt: chitosan(hiệu suất 50%), agarose,

alginate…

IV Phương pháp xác định hoạt tính enzyme lipase

Hoạt tính enzyme lipase được xác định dựa trên lượng acid béo tự do được giải phóng Đối với lipase, 1 đơn vị hoạt độ U là lượng enzyme cần thiết để xúc tác tạo thành 1µmol acid béo trong 1 phút ở điều kiện xác định Một số phương pháp thông dụng như:

 PP chuẩn độ (titrimetry)-pH-stat

 PP quang phổ (Spectroscopy)

 PP sắc ký (Chromatography)

 PP phóng xạ (Radioactivity)

 PP sức căng bề mặt (Interfacial tensionmetry)

 PP hóa học miễn dịch (Immuno-chemistry)

18

 ……

1 Đối với cơ chất dạng lỏng

Dầu olive đã nhũ hóa bị phản ứng thủy phân do xúc tác của lipase tạo thành các acid béo (ở điều kiện pH, nhiệt độ, thời gian cụ thể cho các thử nghiệm xác định yếu

tố cụ thể được đo trực tiếp) sau khi bất hoạt enzyme với ethanol 99,5° bằng phương pháp chuẩn độ acid-bazơ, sử dụng NaOH 0,1 N; chất chỉ thị là phenolphthalein 0,1% Khi đó, hoạt tính (HT) và hoạt tính riêng (HTR) của lipase được tính theo công thức:

HT = [(a-b)*1000*0,1] (U/mL)

Trong đó; a: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu có enzyme (mL);

b: VNaOH 0,1 N chuẩn độ ở mẫu trắng (mL)

19

V Ứng dụng

1 Ứng dụng của Lipase trong công nghiệp

Chất tẩy Thủy phân chất béo Loại các vết bẩn dầu từ vải

Thực phẩm sữa

Thủy phân chất béo của sữa, làm chín phomat, biến đổi chất béo của bơ

Tăng cường các chất mùi thơm trong sữa, phomat và bơ

Các loại bánh Cải thiện mùi thơm Kéo dài thời gian sử dụng

Nước giải khát Cải tiến mùi hương Các loại nước giải khát

Chuyển đổi sự ester hóa Thực phẩm chức năng

Thịt và cá Tăng cường hương vị Các sản phẩm thịt và cá, loại bỏ chất béo

Hóa chất Chọn lọc đối kháng, tổng hợp Các khối kết tinh, hóa chất

Dược phẩm Chuyển đổi sự ester hóa, thủy phân Các lipid đặc trưng, các chất trợ tiêu hóa

Chất làm trắng Thủy phân Loại bỏ chất béo