Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần

Đưa ra được quy trình công nghệ tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua kỹ thuật dung hợp tế bào trần protoplast: Quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy, chọn lọc tái sinh tế bào trần

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

VIỆN SINH HỌC NÔNG NGHIỆP

BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI

TẠO GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH VIRUS

BẰNG DUNG HỢP TẾ BÀO TRẦN

9251

HÀ NỘI, THÁNG 03 NĂM 2012

MỞ ĐẦU

Khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ Đông ở Đồng bằng Sông Hồng, tuy nhiên diện tích khoai tây của Việt Nam không vượt quá 50.000 ha Có nhiều nguyên nhân hạn chế sự phát triển khoai tây của Việt Nam nhưng nguyên nhân chính là do công tác giống khoai tây Công tác giống khoai tây có vai trò quyết định sự phát triển ngành sản xuất khoai tây của Việt Nam Có 2 vấn đề bức xúc của công tác giống khoai tây là:

(1) Chưa xây dựng được hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ nhằm cung cấp chủ động củ giống sạch bệnh cho sản xuất với giá thành được sản xuất chấp nhận Các giống khoai tây sử dụng trong sản xuất chủ yếu vẫn phải nhập nội

(2) Còn có rất nhiều khó khăn và hạn chế trong công tác chọn tạo giống khoai tây phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm chất tốt (ăn tươi hoặc chế biến) và đặc biệt có đặc tính kháng bệnh nhất là bệnh virus gây thoái hóa giống khoai tây và bệnh mốc sương vào cuối vụ đông gây thiệt hại

về năng suất nghiêm trọng

Công tác xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh đã được nhiều cơ quan quan tâm nghiên cứu và đã đạt được những kết quả đáng khích lệ Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất Các nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây chủ yếu vẫn sử dụng các phương pháp chọn tạo giống truyền thống Ở Việt Nam, việc tạo giống thông qua lai tạo gặp rất nhiều khó khăn và hầu như chưa được tiến hành; chưa sử dụng các phương pháp CNSH hiện đại; chưa có bộ vật liệu phong phú mang các tính trạng quý Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt được của thế giới trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang

dần kế thừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng như một số dịch hại nguy hiểm khác

Xuất phát từ tình hình trên, chương trình CNSH trọng điểm của Bộ

NN&PTNT đã cho phép chúng tôi tiến hành đề tài: ”Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần”

Mục tiêu của đề tài:

1 Tạo được dòng khoai tây kháng bệnh virus hại khoai tây Ít nhất tạo được 2 dòng khoai tây kháng virus X (PVX) và virus Y (PVY)

2 Đưa ra được quy trình công nghệ tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua kỹ thuật dung hợp tế bào trần (protoplast): Quy trình tách, dung hợp, nuôi cấy, chọn lọc tái sinh tế bào trần trong chọn tạo giống khoai tây

Ý nghĩa khoa học của đề tài

+ Sản phẩm khoa học công nghệ của đề tài là quy trình công nghệ tạo giống khoai tây kháng bệnh virus là sản phẩm có tính độc đáo và đạt trình độ KHCN quốc tế, có giá trị chuyển giao trong và ngoài nước

+ Chất lượng khoa học của các sản phẩm nghiên cứu đều đạt yêu cầu cao,

có tính mới Các dòng khoai tây mới tạo ra đều có tính độc đáo và có triển vọng phát triển thành giống phục vụ sản xuất đại trà

Ý nghĩa thực tiến của đề tài

+ Kết quả quan trọng của đề tài là tạo ra các dòng khoai tây lai soma có khả năng kháng bệnh virus X và Y là các virus nguy hại nhất ở khoai tây Kết quả này cũng mở ra một triển vọng sáng sủa cho việc ứng dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần trong công tác chọn tạo giống cây trồng khác ở Việt Nam

+ Đề tài cũng góp phần xây dựng một đội ngũ, một trường phái nghiên cứu mới về công nghệ tế bào thực vật của Việt Nam: trường phái ứng và phát triển kỹ thuật tế bào trần trong tạo giống cây trồng

CHƯƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây

Khoai tây là một cây trồng lấy củ, nó có giá trị kinh tế rất cao trong nền kinh

tế quốc dân của nhiều nước trên thế giới từ những nước phát triển đến nước đang phát triển như Việt Nam Đặc biệt khoai tây còn có giá trị dinh dưỡng lớn đã góp phần quan trọng trong việc giải quyết an toàn an ninh lương thực của nhiều nước

Cây khoai tây thuộc họ cà, thân thảo, lớp hai lá mầm

Các yêu cầu điều kiện ngoại cảnh của cây khoai tây:

* Nhiệt độ:

Nhiệt độ trong vụ trồng khoai tây là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển của cây và năng suất củ Nhiệt độ trong vụ trồng bình quân là 16oC –

18oC là thích hợp và cho năng suất cao nhất Các thời kỳ sinh trưởng khác nhau

sẽ yêu cầu điều kiện nhiệt độ khác nhau

củ Đất có hàm lượng Chloride cao sẽ làm giảm hàm lượng chất khô của củ (Trương Văn Hộ, 1990)[8]

* Sâu bệnh:

+ Các loại bệnh virus hại khoai tây:

Có nhiều bệnh virus hại khoai tây, đến nay các nhà khoa học đã xác định được các loài chủ yếu như sau:

Virus Y (Potato Virus Y) gây xoăn lá, khảm lá, giảm năng suất từ 50% - 90% Virus X (Potato Virus X) gây khảm lá nhưng không biến dạng, giảm năng suất 10-25%

Virus A (Potato Virus A) gây khảm lá làm giảm năng suất tới 50%

Virus M (Potato Virus M) gây cuốn lá nhẹ ở ngọn, khảm gân lá, giảm năng suất 60-70%

Virus S (Potato Virus S) triệu chứng ẩn, có thể làm giảm diện tích, gây đổ cây, giảm năng suất 10-15%

+ Bệnh mốc sương hại khoai tây:

Bệnh do nấm Phytophthora infestans DB gây ra và rất phổ biến ở các

vùng trồng khoai tây Ban đầu bệnh xuất hiện trên lá, trên cành khoai tây các vết nhỏ màu nâu Khi vết bệnh loang ra trên nhiều lá, lá cây héo, rũ xuống, có màu đen, khô dòn Khi thời tiết ẩm, có sương buổi sáng, ở dưới chung quanh vết bệnh xuất hiện các đám nấm màu trắng

- Bệnh đốm vàng:

Bệnh do nấm Macrosporium Solani Ell-et Mart gây nên Bệnh rất phổ

biến ở các vùng trồng khoai tây Bệnh tạo thành các vết bệnh lớn hình tròn hoặc

có cạnh, màu nâu đậm Trên bề mặt vết bệnh có các vòng đồng tâm rất rõ và các đám bào tử nấm màu đen nhạt

* Sâu xám, sâu xanh:

Sâu ăn lá, phá hoại chủ yếu ở giai đoạn cây con

1.2 Tình hình sản xuất, sản lượng khoai tây trong và ngoài nước

1.3.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai tây trong nước

Vấn đề khó khăn nhất hiện nay đối với ngành sản xuất khoai tây đó là giống Hiện giống khoai tây ở trong nước mới chỉ đáp ứng từ 20-25% nhu cầu,

số còn lại phải nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan…

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự duy trì từ vụ này sang vụ khác hoặc giống do người dân tự mua không rõ nguồn gốc,

do vậy mà giống không những bị thoái hóa mà còn có tỷ lệ nhiễm virus cao từ 54–65% cộng với hao hụt trong bảo quản từ 45–60% Khoai tây trồng chủ yếu bằng con đường nhân giống vô tính nên tỷ lệ tái nhiễm virus cao Hơn nữa trong điều kiện sản xuất ở Việt Nam, củ giống bảo quản trong thời gian dài khoảng 9 tháng (từ tháng 2– tháng 10), điều kiện nóng ẩm của mùa hè củ giống bị già sinh

lý nhanh chóng, khi trồng khả năng sinh trưởng kém, hậu quả là năng suất và chất lượng củ thấp

Mặt khác việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam còn nhỏ lẻ, chưa mang tính hệ thống Trước tình hình đó cần xây dưng các chương trình nhân tạo giống khoai tây sạch bệnh, có chất lượng và phẩm chất tốt phục vụ bà con nông dân

Từ năm 2003 đến 2004 diện tích trồng khoai tây ở nước ta là 47340 ha với năng suất đạt 148 tạ/ ha Vùng Trung du miền núi phía Bắc có 9266 ha đạt năng suất 109 tạ/ ha Vùng Duyên hải Bắc Trung Bộ có 1686 ha với năng suất đạt 200 tạ/ ha Vùng Đồng bằng sông Hồng có 38267 ha đạt năng suất 164 tạ/

ha Vùng Tây Nguyên có 1126 ha với năng suất đạt 178 tạ/ ha

Trong giai đoạn hiện nay, cây khoai tây rất được chú trọng trong công tác nhập nội, chọn lọc và lai tạo dòng đặc biệt là việc sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô

tế bào và dung hợp tế bào trần Vì vậy, trong những năm gần đây diện tích trồng khoai tây được mở rộng nhanh chóng và khoai tây trở thành cây trồng chính trong vụ đông, là cây quan trọng ở nước ta

1.3.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ khoai tây trên thế giới

Bảng 1.1: Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế

giới năm 2007 (FAOSTAT) Chỉ tiêu

Quốc gia

Diện tích thu hoạch (ha)

Năng suất (tấn)

Sản lượng (tấn/ha)

Bảng 1.2 Sản lượng khoai tây trên thế giới giai đoạn 1991 – 2007

(triệu tấn) (FAOSTAT) Năm

Quốc gia

1991 1993 1995 1997 1999 2001 2003 2005 2007

Phát triển 183.13 199.31 177.47 174.63 165.93 166.93 160.97 159.97 159.89 Đang phát

và có phẩm chất tốt phục vụ sản xuất khoai tây thương mại

1.3 Tình hình nhiễm bệnh virus PVY (potato Y-potyvirus) ở khoai tây

Các loại virus hại khoai tây bao gồm: PLRV, PVY, PVA, PVV, PVX, PVM

và PVS trong đó PVY là loại gây hại lớn nhất (Beemster và De Bokx, 1987, Burton, 1989; Brunt và cộng sự, 1996) PVY lần đầu tiên được phát hiện ở Anh (Smith, 1931), bao gồm các chủng khác nhau tùy theo vùng và qua trình lây nhiễm vào cây kí chủ (Jones, 1990; Kerlan và cộng sự, 1999): PVYO, PVYC, PVYN, PVYNTN, PVYNW, PVYZ, PVYZE Trong đó có 3 chủng PVY chủ yếu là PVYO (ordinary strain), PVY N (tobacco veinal necrosis strain) và PVYC (stipple streak strain) PVYC ít quan trọng hơn so với PVYO và PVYN Gần đây đã phát hiện thêm một số chủng PVY khác như PVYNTN, PVYNW, PVYZ, PVYZE Chủng PVYNTN gây đốm vòng ở củ, hiện nay có mặt ở hầu hết các vùng trồng khoai tây

Virus PVY là một trong những loại bệnh virus phá hoại nghiêm trọng nhất đối với khoai tây trồng Virus lây truyền vào cây khoai tây từ thế hệ này sang thế hệ khác qua củ Chiến lược sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật để phòng trừ loại bệnh này đã không thành công (Jones và cộng sự, 1982; De Bokx

và Van der Want, 1987; Valkolen và cộng sự, 1996) Việc trồng các củ giống vị

nhiễm virus PVY (potato Y potyvirus hoặc PLRV (potato leafroll luteovirus) đã

làm giảm năng suất tới 80% (Banttari và cộng sự, 1993) Theo Hull (1984), nước Anh đã phải tốn 30-50 triệu bảng Anh mỗi năm để dùng cho phòng trừ bệnh virus hại khoai tây Năng suất khoai tây trên toàn thế giới đã giảm 20 triệu

tấn mỗi năm do virus PLRV (Kojima và Lapierre 1988)

Việc cải tiến tính kháng virus PVY (một loại virus hại chủ yếu ở khoai tây)

là một chiến lược lớn nhằm giảm thiểu việc sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật Tính kháng cực kỳ cao (extremely resistance) đối với loại virus này thể hiện ở khả năng kìm hãm sự nhân lên của virus tại các tế bào xâm nhiễm (Solomon-Blackburn và Barker, 2001) Tính kháng này được chuyển từ loài khoai tây dại

S stoloniferum vào các giống khoai tây trồng S tuberosum của Châu Âu qua 3

-7 thế hệ lai backcross với cây mẹ mang gen RTsto (Song và Schwarzfischer 2008) Tính kháng với virus cũng được chuyển vào khoai tây trồng bằng các thao tác gen song mức độ kháng là không hoàn toàn hoặc chỉ có thể kháng với 1 chủng của virus PVY trên trồng ruộng (Schubert và cộng sự, 2002) Hơn nữa việc chuyển gen có hạn chế với chương trình chọn tạo giống khoai tây Do đó việc sử dụng các loài khoai tây dại như một nguồn gen kháng virus là mối quan tâm của các nhà chọn tạo giống cây trồng bằng phương pháp lai soma Các nhà chọn tạo giống khoai tây đã sử dụng các gen có liên quan đến tính kháng virus

PVY từ các loài khoai tây dại (Solanum demissum Lindly, S hougasii Correll, S

stoloniferum Achlechtendal & Bouche, S tuberosum L ssp andigena

(Juzepczuk và Bukasov) và S chacoense Bitter để đưa vào nguồn gen khoai

tây trồng bằng phương pháp dung hợp tế bào trần Tuy nhiên các loài khoai tây dại này rất khó để lai với khoai tây trồng và lai hữu tính với khoai tây trồng thì chưa được biết đến Để khắc phục những khó khăn trong lai hữu tính, lai soma được sử dụng để dung hợp protoplast giữa loài dại này với giống khoai tây trồng Delikat (một giống rất nhạy cảm với virus) Các con lai soma không có biểu hiện bị nhiễm virus sau khi lây nhiễm nhân tạo với 6 chủng PVY quan trọng nhất ở điều kiện nhà kính và trên đồng ruộng (Thieme và cộng sự, 2008) Điều này chứng tỏ rằng tính kháng virus PVY đã được chuyển từ loài dại vào khoai tây trồng bằng dung hợp protoplast Sau đó, lai backcross giữa các con lai soma với giống khoai tây trồng Delikat nhạy cảm với virus, tất cả các dòng lai BC1 đều không có biểu hiện nhiễm virus PVY khi lây nhiễm với tất cả các chủng của virus này Trong các dòng lai BC2, các kiểu gen kháng và nhạy cảm đã được chọn lọc

1.4.Tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần

Đối với hướng tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần giữa hai hay nhiểu dòng mang đặc tính kháng tỏ ra có nhiều ưu điểm: Tổ hợp được bộ genome của cả hai bố mẹ tạo thành một cấu trúc genome dị hợp tử mới, không có sự biệt lập trong quá trình giảm phân, rút ngắn thời gian chọn tạo,

khắc phục những rào cản về mặt di truyền trong lai hữu tính… Cho nên trở thành công cụ đầy hứa hẹn phục vụ chương trình chọn tạo giống cây khoai tây kháng virus

Trong tự nhiên tồn tại khá nhiều nguồn gen kháng virus, theo một số nghiên cứu đã xác định có khoảng 206 loài khoai tây dại mang củ, 7 loài nguyên

thủy và một loài khoai tây trồng Solanum spp, cũng như một số loài dại không

mang củ có đặc tính kháng virus tốt (Spooner và Hijmans , 2001) Trong số đó

dòng S etuberosum có đặc tính kháng cao với bệnh virus PVY, PVA…(Valkonen

et al, 1992b; Thieme et al, 2000 ), S tarnii rất kháng với dòng virus PVY (Thieme

et al, 2003), loài khoai tây S cardiophyllum Lindl và S etuberosum Lindl thuộc

chi Pinnatisecta và Etuberosa (Hawkes, 1990) thể hiện tính kháng cao với nấm

Phytophthora infestans (Hanneman và Bamberg 1986) Chúng được thu thập và

thăm dò về tính kháng virus và tác nhân gây bệnh khác kể cả sâu hại Một số nghiên cứu về khoai tây ở Châu Âu khẳng định 90% loài khoai tây dại trong quỹ gen thu thập là nguồn gen kháng mới có ý nghĩa Đây là nguồn gen kháng quan trọng phục vụ chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp

tế bào trần Nếu lai tạo giống theo phương pháp truyền thống giữa những dòng dại có tính kháng virus và dòng trồng thường gặp rào cản về mặt di truyền, thời gian chọn tạo lâu

Rất khó khăn để có thể tập hợp nguồn gen dại vào dòng khoai tây trồng Châu Âu bằng lai hữu tính, do đó dung hợp tế bào trần là phương pháp hữu hiệu

để đưa nguồn gen đó vào quỹ gen của loài S Tuberosum, vượt qua được tính

không tương hợp trong lai hữu tính và sự phân tách gen trong chương trình chọn tạo giống (Millam et al, 1995) Sự dung hợp giữa tế bào trần của loài khoai tây

dại không có củ S Brevidens với loài khoai tây trồng S Tuberosum tạo con lai

soma biểu hiện tính kháng cao với một số nhóm virus và kháng vector truyền bệnh (Austin et al, 1985b; Fish et al, 1987; Gibson et al, 1988; Pehu et al, 1990; Vankonen et al, 1994b)

Tùy thuộc vào thành phần gen của con lai soma mà biểu hiện một số các biến đổi về tính trạng hình thái và phản ứng lại sự xâm nhiễm virus PVX bởi vector (Thieme et al, 2000) Một số con lai soma được lai lại thành công với dòng khoai tây trồng mà vẫn biểu hiện tính kháng (Willliams et al, 1992; Helges

et al, 1993; Thieme et al, 2002) Hàng loạt con lai soma của S etuberosum và S

tuberosum và dòng BC1 thể hiện kháng tốt với PVY (Novy và Helgeson, 1994b)

và tính rất kháng với PVX (Gavlirenco et al, 2003) Nghiên cứu của Polgar et al

(2002) đã tạo được 150 dòng lai soma giữa thứ khoai tây Hungari và S

brevidens cùng một vài thế hệ BC Kết quả cho thấy rằng tất cả con lai và hầu

hết dòng BC biểu hiện mức kháng cao với virus PVY và PLRV

Một nghiên cứu mới mẻ của Thieme et al (2008) cho biết loài khoai tây

dại S tarnii là nguồn gen kháng quan trọng với cả sâu hại và bệnh hại, biểu hiện tính rất kháng với virus PVY, tính kháng cao với nấm Phytopthera infestans Khi đó tiến hành lai soma với một số dòng khoai tây trồng thuộc loài S

tuberosum để tạo thể lai mới kế thừa tính kháng từ dòng khoai tây dại S tarnii

Trong số các phương pháp tạo giống khoai tây kháng virus thì phương pháp lai soma có nhiều ưu điểm và hiệu quả hơn cả Về phương pháp lai hữu tính gặp nhiều khó khăn về mặt di truyền, tốn thời gian chọn tạo Đối với phương pháp chuyển gen cũng gặp không ít rắc rối bởi khi chuyển gen kháng virus vào cây chúng có thể không biểu hiện tính kháng (Cockerham, 1970; Ross, 1986; Jones 1990; Mendoza et al, 1990) mà còn xuất hiện các sản phẩm phụ (protein) từ gen chuyển gây rối loạn hoạt động của cây chủ Nhược điểm của phương pháp chuyển gen là mang tính kháng đặc hiệu dòng virus, dễ bị phá vỡ tính kháng khi lây nhiễm virus với nồng độ cao, chỉ có ý nghĩa với nhóm virus lây nhiễm cơ giới

mà không có hiệu quả với nhóm virus truyền qua tuyến nước bọt của côn trùng (Anderson et al, 1989; Stark và Beachy, 1989)

Để có thể giải quyết vấn đề bệnh virus của cây khoai tây, cần áp dụng nhiều biện pháp khác nhau, trong đó ưu tiên giải pháp tạo giống kháng vector

truyền bệnh virus và kháng trực tiếp dòng virus

1.5 Cơ sở khoa học của phương pháp lai soma (dung hợp tế bào trần)

1.5.1 Khái niệm tế bào trần (protoplast) và con lai soma (somatic hybrid)

Tế bào trần là tế bào đã bị tách bỏ thành tế bào bằng phương pháp cơ học hay enzym, phần còn lại sau phân giải thành là màng nguyên sinh chất bao bọc nhân và các bào quan bên trong Màng nguyên sinh chất là phần ranh giới phân biệt giữa môi trường bên trong tế bào và bên ngoài tế bào trần

Mỗi tế bào thực vật đều có tính toàn năng (tipotential) nghĩa là có tiềm năng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Do đó việc dung hợp hai hay nhiều tế bào trần nhằm tạo con lai soma hoàn toàn có thể phát triển thành cây lai hoàn chỉnh

Con lai soma là sản phẩm của sự dung hợp giữa các nguồn tế bào trần khác nhau Nhân và các bào quan là sự lai giữa hai bố mẹ dung hợp, với mục đích kết hợp các tính trạng tốt của bố mẹ vào con lai để cải tạo nguồn gen của cây trồng Con lai soma được tạo ra khi phương pháp lai hữu tính gặp khó khăn về mặt di truyền hoặc các thao tác lai…

1.5.2 Quá trình tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh protoplast

Sự ra đời của kỹ thuật dung hợp tế bào trần ở thực vật cho phép tạo ra những cơ thể lai mới, mang các đặc tính tốt mà phương pháp lai truyền thống rất khó hoặc không thể tạo ra được con lai Hơn nữa, cây khoai tây là một loại cây rất dễ nuôi cấy mô, do vậy các nhà nghiên cứu dễ dàng áp dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo thể lai soma để cải tiến một số tính trạng mong muốn, đặc biệt là tính kháng Đặc tính kháng bệnh trong con lai soma có được là do một trong hai đối tượng tế bào dung hợp có mang tính chất đó Đồng thời tế bào lai soma là sự dung hợp của gen nhân và các bào quan (ty thể lai, lạp thể lai), nên cũng góp phần tăng cường các đặc tính nông sinh học khác ở con lai soma

Vào những năm 60 của thế kỷ XX, E C Cooking đã sử dụng một enzyme để phân giải thành tế bào và kết quả là tạo ra các protoplast tế bào chóp

rễ của cây cà chua

Sau đó I.Takebe và cộng sự (Viện nghiên cứu virus thực vật, Aobacho, Chiba/Japan) đã cải tiến kỹ thuật trên và đã tạo được một lượng lớn tế bào trần

của các tế bào thịt lá cây thuốc lá Quy trình này cũng được áp dụng thành công

trên nhiều đối tượng thực vật khác, rất dễ sử dụng và đạt hiệu quả cao Quy trình này được tiến hành qua hai bước: đầu tiên là phân giải lớp màng mỏng bằng enzym pectinase; sau đó, phân giải thành tế bào bị phân giải bằng enzym cellulase

Đây là những người đặt nền móng đầu tiên cho các nghiên cứu về tế bào trần Những kết quả nghiên cứu trên góp phần vào sự thành công tạo nguồn tế bào trần phục vụ dung hợp

* Tách protoplast

Để tách được protoplast người ta có thể sử dụng hai phương pháp tách cơ học và tách bằng enzyme Tách cơ học là làm cho protoplast ở trạng thái co nguyên sinh sau đó tác động cơ học để giải phóng tế bào trần Tuy nhiên phương pháp này có nhiều mặt hạn chế: chỉ áp dụng trên một vài đối tượng thực vật; mật

độ protoplast thu được không cao; khả năng tái sinh yếu Phương pháp tách protoplast bằng enzyme đã khắc phục được những nhược điểm trên Hiện nay, phương pháp enzyme được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả cao

* Dung hợp

Hai đối tượng tế bào đem lai có thể dung hợp thành một tế bào mới một cách tự phát hoặc được cảm ứng bởi tác nhân như hóa chất (dung hợp hóa chất polyethylen glycol, ký hiệu là PEG) hay xung điện (dung hợp xung điện-electrofusion) Đối với cây khoai tây người ta đã sử dụng cả hai phương pháp trên Tuy nhiên so với phương pháp dung hợp bằng hóa chất, dung hợp xung điện được áp dụng phổ biến và đạt hiệu quả cao hơn hơn do thao tác đơn giản,

tốc độ nhanh, hiệu suất dung hợp cao trong cùng một thời điểm và ít gây độc đối với tế bào (Banner, 1990) Phương pháp dung hợp bằng hóa chất PEG thường gây độc cho tế bào trần do không rửa sạch hết PEG, do vậy sẽ ảnh hưởng đến khả năng tái sinh sau này

* Nuôi cấy và tái sinh tế bào trần sau dung hợp

Sản phẩm sau khi dung hợp sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng cho tới khi microcallus xuất hiện Trong giai đoạn ban đầu protoplast “rất yếu ớt” do chưa có thành tế bào, do vậy môi trường nuôi cấy cần phải đảm bảo áp suất thẩm thấu để không làm vỡ tế bào, ngoài các yếu tố dinh dưỡng cần thiết còn cần cung cấp đủ ion Ca2+ cho quá trình phân chia hình thành thành vách tế bào mới Tiếp đó, các microcalli này sẽ được chuyển sang môi trường rắn để tạo thành macrocallus, tùy thuộc vào từng loại cây trồng mà sử dụng loại môi trường khác nhau Cho tới khi kích thước calli đạt tiêu chuẩn thì cấy chuyển sang môi trường tái sinh để tạo chồi và cuối cùng tạo cây hoàn chỉnh

1.5.3 Xác định con lai soma

Sản phẩm sau dung hợp là hỗn hợp gồm: Các dạng bố hoặc mẹ dùng để lai partners), các thể lai đồng hợp (do các tế bào của cùng 1 loài kết hợp lại với nhau - homozygous) và thể lai dị nhân (các tế bào khác loài kết hợp lại với nhau -hetezygous) do quá trình dung hợp xảy ra ngẫu nhiên và không kiểm soát được Chính vì vậy việc chọn lọc chính xác con lai soma trong hỗn hợp sản phẩm sau dung hợp là rất cần thiết Có rất nhiều phương pháp để chọn lọc con lai soma khác nhau, có thể xếp vào hai nhóm là chọn lọc ở mức tế bào (hay calli) và chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh (planlet) Tùy từng loại cây trồng mà có thể áp dụng các phương pháp khác nhau, tuy nhiên thường thì chọn lọc con lai ở giai đoạn cây hoàn chỉnh cho hiệu quả cao hơn

Chọn lọc ở mức tế bào

* Phương pháp tách trực tiếp:

Sau khi dung hợp, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi để chọn lọc trực tiếp sản phẩm dung hợp, bằng cách sử dụng micropipet hút trực tiếp tại

vị trí dung hợp Tuy nhiên phương pháp này rất khó khăn để tách được tế bào lai

do mât độ tế bào khá dày, hơn nữa dễ gây tổn thương tế bào, ảnh hưởng đến sự tái sinh sau này Phương pháp này ít được áp dụng trong chọn lọc con lai (Hein

và Schieder 1984)

* Phương pháp nhuộm huỳnh quang:

Puite và Pijnacker (1986) đã đề xuất phương pháp chọn lọc sản phẩm dung hợp bằng cách nhuộm huỳnh quang Tiến hành nhuộm flouresencein diacetate (FDA) cho nguồn protoplast thu được từ mẫu lá xử lý trong dung dịch thuốc trừ cỏ, các protoplast này không hoặc có rất ít lục lạp, sau đó tiến hành dung hợp với nguồn protoplast bình thường có chứa lục lạp Sau khi xử lý dung hợp, kết quả cho thấy các protoplast xuất hiện màu đỏ và màu xanh của FDA được xác nhận là con lai soma (heterokaryon) Tuy nhiên yêu cầu của phương pháp này là mật độ nuôi cấy protoplast phải thấp

Theo Harkins và Galbrain, 1984, các ông tiến hành nhuộm flouresent khác nhau cho cả hai nguồn protoplast dung hợp Sau dung hợp, hỗn hợp protoplast được chiếu tia laser khi đó các tế bào hấp thu năng lượng ánh sáng, cuối cùng tiến hành chọn lọc con lai dựa trên định lượng hàm lượng flouresent

* Dựa trên các biểu hiện di truyền, sử dụng các gen chỉ thị và gen đánh dấu:

Chẳng hạn như các gen đột biến gây bạch tạng, các đột biến hóa sinh làm ức chế gen nào đó dẫn tới sự thiếu hụt enzyme hoạt động, các gen đánh dấu

có được bằng phương pháp chuyển gen, các gen kháng sinh hoặc kháng thuốc trừ cỏ Có thể nêu một số ví dụ sau:

Gây đột biến tính lặn mẫn cảm với ánh sáng SSvv và ssVV của cây

thuốc lá (Nicotiana tabacum), khi đó dạng lai giữa hai kiểu đột biến trên có kiểu

gen SSssVVvv không mẫn cảm với ánh sáng Các dòng tế bào tồn tại hình thành

diệp lục ở cường độ ánh sáng cao do không mẫn cảm với ánh sáng, đó chính là con lai soma (Athuja 1982)

Dạng lai giữa Solanum nigrum và Petunia hybrida có thể phát triển trên môi trường có chứa diethylpyrocarbamate (hợp chất gây mẫn cảm với Solanum

nigrum) và iodine acetate (gây mẫn cảm với Petunia hybrida) Protoplast bố mẹ

dung hợp không phát triển trên môi trường có đồng thời hai chất trên do đó dễ dàng chọn lọc được con lai soma (Davey và Kumar 1983)

Hai nguồn protoplast Nicotiana glauca và B.langsdorfii cần có auxin

trong môi trường mới có thể phát triển được, ngược lại dạng lai giữa chúng có thể tự tổng hợp được auxin do vậy phát triển được trong môi trường thiếu auxin Qua đó con lai soma dễ dàng xác định được trong điều kiện môi trường nuôi cấy (Pelletier và Chupeau 1984)

Dòng tế bào A của Shaerocarpos donelli chỉ phát triển được khi trong

môi trường có acid nicotinic và dòng tế bào B (dạng bạch tạng) thì cần đường Dạng lai giữa A và B phát triển bình thường trên môi trường không có cả acid nicotinic và đường Dòng tế bào A và B được gọi là dòng tế bào đột biến dinh dưỡng thụ động (auxotrophic) theo Gonzales và Widholm 1985

Chọn lọc ở mức cây hoàn chỉnh

Bằng các phương pháp chỉ thị phân tử (AFLP, RAPD, RELP, PCR) hoặc Isozyme có thể xác định chính xác các con lai soma mang các gen của cả bố

và mẹ dung hợp

Theo N.Q.Thach và U Frei và G Wenzel (1993) đã tạo thành công con

lai soma giữa các nhóm khoai tây thuộc Solanum tuberosum L., việc xác định

con lai dựa trên phân tích isozyme esterase, peroxidase (Deimling et al 1988) và

kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) đã xác định được các con lai đều có sự biểu hiện của 2 allele trội đơn gen Rx và Ry từ bố mẹ dung hợp (partners)

Theo Ramona Thieme và Elena Rakosy – Tican (2007), Con lai giữa

Solanum tuberosum cv Delikat và S tarnii được xác nhận bằng chỉ thị phân tử

SSR (Simple Sequence Repeat ) và AFLP (Amplified Fragment length polymorphism), đồng thời cũng dựa vào đặc điểm hình thái và phân tích Flow cytometry Kết quả cho thấy SSR không cho kết quả với tổ hợp lai trên và các con lai BC1 còn AFLP cho kết quả tốt để khẳng định đúng con lai soma

Ngoài ra, để xác định con lai soma một số tác giả đã nghiên cứu thành phần, hàm lượng alkaloid trong các cây lai Theo nghiên cứu của Pehu và cộng

sự (1990) về dung hợp protoplast giữa S tuberosum và S brevidens đã tạo con

lai soma thành công Để xác định con lai soma ông tiến hành phân tích thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai Kết quả cho thấy các thành

phần alkaloid của bố mẹ bao gồm solanidine và slanthrene của S tuberosum,

tomatidine của S brevidens (Laurila et al 1996) đều có mặt trong cây lai So sánh với

bố mẹ, cho biết thành phần SGAA trong cây lai cao hơn so với S tuberosum nhưng

hàm lượng thấp vào khoảng 20 mg/ 100g trọng lượng tươi

Hơn nữa người ta có thể xác định con lai dựa vào đặc điểm hình thái khi

bố mẹ có đặc điểm khác nhau rõ rệt Tuy nhiên phương pháp này chỉ được áp dụng đông thời với phương pháp xác định ở mức phân tử thì mới cho kết quả chính xác nhất

1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.6.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Phương pháp chọn tạo khoai tây truyền thống nhờ kỹ thuật lai tạo, lai hồi giao (back cross), đột biến và chọn lọc (Kuckuck et al, 1985) vấp phải những khó khăn về mặt đặc tính di truyền của kỹ thuật trồng trọt (Solanum tubersosum) Đó là bộ genom của khoai tây trồng trọt ở thể tứ bội tetraploid (2n=4x = 48 nhiễm sắc thể), gây ra sự phân ly sau lai tạo với một quần thể rất lớn, rất phức tạp, đòi hỏi quá trình chọn lọc rất nhiều công sức Quá trình này đòi hỏi tối thiểu 10 năm để có được một giống lai ra đời (Fitsden, 1984) Ngoài

ra, nhiều đặc tính chống chịu do nhiều gen quy định sẽ có thể mất dần trong quá trình chọn lọc ở các thế hệ tiếp sau

Phương pháp chuyển gen được coi là chiến lược mới để cải tiến các giống cây trồng Tuy nhiên, nhiều tính trạng nông sinh học quan trọng không thể chuyển vào cây trồng bằng công nghệ gen do chúng được kiểm soát bởi đa gen; hoặc các gen kiểm soát các tính trạng mong muốn vẫn chưa được biết đến; hoặc các gen của chúng chưa thể tách ra được và nhân dòng thành công Do đó, phương pháp lai tạo giữa các loài có quan hệ gần gũi bằng dung hợp tế bào trần

là một phương pháp thú vị để khắc phục những nhược điểm trên Phương pháp dung hợp tế bào trần đã giải thích cơ sở di truyền của tính kháng với các stress

vô sinh và hữu sinh ở cây trồng (Chen và cộng sự, 1998; Naess và cộng sự, 2000; McGrath và cộng sự, 2002)

Sơ đồ tạo giống khoai tây nổi tiếng của Wenzel (1979) bằng dung hợp

tế bào trần bao gồm các khâu: chọn lọc các đặc tính mong muốn ở bố mẹ (haploid, 1x) sau đó tạo cây dihaploid (2x), lai tạo các cây dihaploid (có các đặc tính khác nhau) để tạo con lai 2x tổ hợp được các đặc tính mong muốn của bố

mẹ Sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào để tổ hợp các đặc tính mong muốn ở các dạng 2x Kết quả thu được con lai soma 4x (tetraploid) Các dòng lai soma này được chọn lọc để phát triển thành giống có đặc tính mong muốn

Các dòng tứ bội khởi đầu (4x )

Solanum phureja (Nitzche và Wenzel, 1977); các công trình nghiên cứu về hoàn

thiện kỹ thuật tách protoplast và dung hợp protoplast khoai tây theo các phương pháp hoá học, điện học (Shepard, Tohen 1977, Thomas 1981, Bokelmann, Roest

1983, Millers 1990, 1994, Si and Dai, 1997 )

Eduard Chani và cộng sự (2000) đã áp dụng công nghệ dung hợp protoplast và nuôi cấy bao phấn để tạo các cây đơn bội Các con lai soma được

tạo ra từ tổ hợp lai giữa Solanum phureja Juz.&Buk và S chacoense Bitt Nuôi

cấy hạt phấn của các con lai này để tạo 1 họ cây đơn bội Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn như điều kiện trồng cây cho bao phấn; phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy; điều kiện nuôi cấy; kiểu gen; thời gian lấy bao phấn Đa số các cây tái sinh đều là cây nhị bội, điều này chứng tỏ rằng có một số alen đã bị đào thải trong thể dị hợp ở cây cho hạt phấn Trong các cây tái sinh, các thể đồng hợp cũng được xác định thành công bằng chỉ thị phân tử SSR

với 8 cặp mồi

Trong giai đoạn những năm 80 đến 90, các nghiên cứu nhằm phát triển các phương pháp tách, dung hợp, nuôi cấy và tái sinh các thể lai soma được tiến hành rất mạnh mẽ (Shepard và totten,1977; haberlach và cs,1985; Austin và cs, 1985a; Fish và cs, 1988; Perl và cs , 1988; Schilde, Rentschler và cs, 1988; Deimling và cs,1998; Masson và cs, 1988; Hunt và Helgeson, 1989; Chaput và

cs, 1990; Wenzel, 1992; Thach et al., 1993; Menke và cs,1996,1997) Các công trình nghiên cứu tạo các con lai soma tổ hợp được các đặc tính kháng bệnh virus

từ bố mẹ đã chọn lọc (2x) cũng được rất nhiều tác giả nghiên cứu thành công Các tác giả này thừa nhận có thể tổ hợp được các đặc tính kháng bệnh (virus PVY, PVX, mốc sương, rệp) của bố mẹ vào con lai soma và các đặc tính này có thể quan sát rõ trên đồng ruộng Tuy nhiên những dòng con lai soma có nhiều

biến dị trên đồng ruộng cần phải chọn lọc

Thach và cộng sự (1993) đã chọn lọc thành công 14 dòng khoai tây nhị

bội S tuberosum mang gen kháng Rx hoặc Ry hoặc cả hai, biểu hiện tính kháng

rất cao với virus PVX, PVY, điều này rất ý nghĩa để tiến hành nghiên cứu dung hợp tế bào trần giữa chúng nhằm tạo thể lai soma mang đặc tính kháng bệnh virus Các tổ hợp chọn cho dung hợp hầu hết tạo thể lai tứ bội (tetraploid), một

số kết quả khác gần 50% là thể lục bội (hexaploid) và thể bội không hoàn chỉnh (aneuploid) Đặc biệt một tổ hợp lai thu được có tới 94% dòng lai soma, trong khi đó những tổ hợp khác chỉ có 2% là dòng lai soma Đa số các con lai soma thu được có biểu hiện tính kháng virus của cả hai đối tượng khoai tây dung hợp,

con lai được xác định bằng kỹ thuật RFLP và phân tích isozyme với 2 loại enzym esterase và peroxidase

Lu Wenhe và cộng sự (2004) cho rằng dung hợp tế bào trần không chỉ vượt qua rào cản lai tạo thông thường mà còn thu được các thể lai soma, do vậy con lai soma sẽ thể hiện ưu thế lai rất rõ Kỹ thuật dung hợp tế bào đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công trong việc phát triển các giống cây trồng mới Có thể kể tên một số giống đã thương mại hoá thành công như : cam

"Oretachi" (cam + cam ba lá), "Shuvel" (quít Satsuma + cam), "Gravel" (cam lai bưởi chùm), "Murrel" (murcott +cam) và "Yuvel" (Yuzu + cam), Giống thuốc lá bất dục đực Ms-F 224 Ngoài ra nhiều dòng bất dục đực dùng để sản xuất hạt F1 ở lúa, cà rốt, cải bắp và cà cũng được phát triển bằng kỹ thuật dung hợp tế bào (Nakajima, 1991)

Với sự phát triển không ngừng của các công nghệ hiện đại kết hợp với các

kỹ thuật truyền thống, các gen kháng hai loại virus PVY và PVX đã được xác định thông qua các nghiên cứu di truyền và chỉ thị phân tử (Blackburn & Barker, 2001) Các trình tự liên quan đến khả năng kháng virus ở khoai tây đã được xác định Bên cạnh đó, hơn 5881 SSRs ở khoai tây đã được tìm thấy Đây chính là những cơ sở dữ liệu quan trọng để ứng dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện đại (tin sinh học, chỉ thị phân tử) nhằm nhanh chóng tạo các giống khoai tây theo định hướng mong muốn D.Milbourne và cộng sự (1998) đã thành công trong việc phân lập, đánh giá và lập bản đồ SSR cho khoai tây Các nhà nghiên cứu đã thiết kế và tổng hợp thành công 120 cặp mồi với vị trí chính xác trên ADN của khoai tây được thiết kế và tổng hợp Đây là những giữ liệu rất quan trọng cho nghiên cứu di truyền ở khoai tây trong tương lai Kế thừa những kết quả này, Ye –So Song và cộng sự (2005) đã xây dựng thành công bản đồ gen

Rysto (gen kháng cực kỳ cao với virus PVY), gen này nằm trên nhiễm sắc thể số

XII của khoai tây 12 marker của gen Rysto đã được sử dụng để phân tích đa hình

của 106 giống khoai tây của Đức, Ba lan, Thụy sỹ Locus của gen Rysto đã được

xác định nằm trên nhiễm sắc thể số XII bằng mồi STM0003 Sử dụng các dòng khoai tây nhị bội tạo ra từ nuôi cấy hạt phấn sơ cấp để phát triển các chỉ thị phân

tử đã được chứng minh Đây là nguồn marker tiềm năng cho chương trình chọn

tạo giống khoai tây có các đặc tính mong muốn

Gần đây, có nhiều hướng nghiên cứu mới là sử dụng nguồn gen khoai

tây dại có đặc tính kháng bệnh và dịch hại (virus, Phytophtora infestan, rệp

truyền bệnh ) rất điển hình làm nguyên liệu dung hợp trực tiếp với các dòng khoai tây trồng để tạo các con lai soma mang đặc tính chống chịu virus mốc sương và rệp truyền bệnh Các dòng lai này sẽ được sử dụng làm vật liệu lai lại (BC) với chính bố mẹ của chúng Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang đặc tính kháng bệnh virus rõ rệt cùng với các đặc tính nông sinh học tốt của bố mẹ Đã có nhiều công trình công bố về việc sử dụng nguồn gen khoai tây dại để chuyển vào các giống khoai tây trồng bằng dung hợp tế bào trần và lai

hữu tính: S Chacoense (Butenko và cs, 1982); S.niggrum (Binding và cs, 1982; 1988); S.brevidens (Austin và cs, 1985; helgeson, 1993); S.circaeifolium (Mattheij và cs, 1992); S.berthaultii (Serraf và cs,1991); S.commersonii (Cardi

và cs, 1993); S Khasianum, S.aculeatissimum (Stattmann và cs, 1994);

S.torvum (Jadari và cs, 1992); S.phureja (Puite và cs, 1986); S.pinnatisectum

(Sidorov và cs, 1987, 1994; Schilde-Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs,

1995); S.bulbocastanum (Austin và cs, 1993; Brown và cs, 1995;

Schilde-Rentschler và cs, 1993; Thieme và cs, 1995, 2004, 2008, 2010; Ioana Dinuet

al., 2000; Tajana Gavrilenko et al., 2003)

1.7.2 Tình hình nghiên cứu trong nước:

Mặc dù thế giới đang tiến rất nhanh và đạt được khá nhiều thành tựu trong chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh và sâu hại bằng công nghệ dung hợp

tế bào trần, song ở Việt Nam, cho đến nay công nghệ này vẫn còn hết sức mới

mẻ Chúng ta chưa thành công trong việc tạo giống thông qua lai tạo truyền thống; chưa sử dụng các phương pháp CNSH hiện đại; chưa có bộ vật liệu

phong phú mang các tính trạng quý như mang gen kháng virus, mốc sương, chống chịu với các stress phi sinh học (abiotic stress) Sản xuất khoai tây ở Việt Nam đang gặp 2 vấn đề nan giải: (1) Chưa xây dựng được hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ nhằm cung cấp chủ động củ giống sạch bệnh cho sản xuất với giá thành được sản xuất chấp nhận Các giống khoai tây sử dụng trong sản xuất chủ yếu vẫn phải nhập nội; (2) Còn có rất nhiều khó khăn

và hạn chế trong công tác chọn tạo giống khoai tây phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam có năng suất cao, phẩm chất tốt (ăn tươi hoặc chế biến) và đặc biệt có đặc tính kháng bệnh nhất là bệnh virus gây thoái hóa giống khoai tây và

bệnh mốc sương vào cuối vụ đông gây thiệt hại về năng suất nghiêm trọng

Công tác xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh đã được nhiều cơ quan quan tâm nghiên cứu và đã đạt được những kết quả đáng khích lệ Gần đây, quy trình sản xuất giống khoai tây sạch bệnh bằng nguồn nuôi cấy mô

đã được nhận giải nhì VIFOTEC năm 2008 và được công nhận là TBKT năm

2009 (Viện SHNN – Trường ĐHNN HN)

Hướng nghiên cứu chọn tạo giống khoai tây lâu nay ở Việt Nam chủ yếu vẫn là công tác nhập nội và khảo nghiệm, trên cơ sở đó đề xuất các giống phù hợp cho sản xuất Bộ giống khoai tây nhập nội của Việt Nam còn rất nghèo nàn bao gồm: giống Thường Tín (Ackersegen nhập nội từ đầu thế kỷ 20); giống Mariella (nhập nội từ Đức năm 1974 và công nhận giống mới năm 1980); giống Lipsi (nhập nội từ Đức năm 1985, công nhận 1990); giống Sanetta (nhập nội

1987, công nhận 1990); giống Rasant, Karsta (nhập nội từ Đức 1995, công nhận tạm thời năm1998); giống VT2 (nhập nội từ Trung Quốc và công nhận năm 1998); giống PO3 (nhập nội từ Philipin, công nhận tạm thời 2004); giống Solara (nhập nội từ Đức 2001, công nhận năm 2007); giống Diamant và giống Nicola (nhập nội từ Hà Lan); giống Marabel và Esprit (nhập nội từ Đức và công nhận 2009) Một số giống khoai tây do Việt Nam chọn tạo từ nguồn vật liệu của CIP bao gồm: giống KT2 (công nhận 1995), giống P3 (công nhận 2001), giống

VC386 (công nhận tạm thời năm 2004), giống khoai tây hạt lai Hồng Hà 2 và

Hông Hà 7 chọn từ các tổ hợp lai của CIP (theo 575 giống cây trồng nông

nghiệp mới, Bộ NN&PTNT, nxb Nông nghiệp năm 2005) Các cơ quan chọn tạo

và khảo nghiệm giống khoai tây chủ yếu là: Trung tâm Nghiên cứu cây có củ - Viện KHNN VN, Bộ môn cây có củ - Viện cây lương thực và thực phẩm, Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung ương

Giai đoạn 1980-2000 quan hệ hợp tác nghiên cứu giữa CIP với Việt nam chương trình chọn giống đã giới thiệu, đánh giá và chọn lọc được một số dòng giống khoai tây kháng bệnh mốc sương như các giống Atzimba, CFK- 69.1, B-71.2902 và P3 đã được trồng rộng rãi tại Cao nguyên Đà lạt, thay thế những giống

cũ nhập từ Châu âu, sau đó phát triển thêm giống Hồng 07 rất được sự ưa chuộng của người sản xuất và người tiêu thụ Tại Đồng bằng Sông hồng 2 giống được đánh giá cao kháng bệnh mốc sương đó là P3 và KT3, các giống trên mang nguồn Gen S.demissum (P3) và S andijena (Atzimba, CFK-69.1,B-71-240-2, 07 và KT3

Như vậy, các nghiên cứu trên chủ yếu vẫn sử dụng các phương pháp chọn tạo giống truyền thống Cùng với những tiến bộ và thành tựu đạt được của thế giới trong nghiên cứu cải tạo giống cây trồng bằng dung hợp tế bào trần, Việt Nam đang dần kế thừa và bắt đầu nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần tạo giống khoai tây kháng virus và bệnh cũng như một số dịch hại nguy hiểm khác

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, Viện SHNN được Bộ NN&PTNT cho

phép tiến hành nghiên cứu đề tài “ Tạo giống khoai tây kháng bệnh virus bằng dung hợp tế bào trần” giai đoạn 2007-2010 Đề tài tập trung nghiên cứu xây

dựng quy trình trình công nghệ tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua

kỹ thuật dung hợp tế bào trần (protoplast), đồng thời tạo được các dòng lai soma

là vật liệu quan trọng cho chương trình chọn tạo giống khoai tây của Việt Nam

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.2 Các chủng virus sử dụng để lây nhiễm nhân tạo

Các chủng virus PVY được dùng cho thí nghiệm tồn tại trên giống thuốc

lá Nicotiana tabacum cv.Samsun Chúng được làm tinh khiết bằng phản ứng

IC-RT-PCR (Schubert và cộng sự 2007) Các chủng virus PVY bao gồm:

- Amigo-N150/1 (PVYN, K.Lindner, JKI, Braunschweig, Germany)

- Q3 (PVYC , I Browning, SASA, Edinburgh, Scotland)

- Linda (PVYNTN, JKI, Germany)

- Wilga O (PVYNW, M Chrzanowska, IHAR, Mlochow, Poland)

- CH605 (PVYN, P.Gugerli, RAC, Nyon, Switzerland)

- 205 (PVYO, JKI, Germany)

2.2 Nội dung nghiên cứu

(1) Thu thập, đánh giá và chọn lọc các dòng khoai tây nhị bội có khả năng kháng virus và mang các tính trạng nông sinh học tốt phục vụ cho quá trình

dung hợp tế bào trần

(2) Nghiên cứu phương pháp tạo cây khoai tây nhị bội (2x) từ cây tứ bội

(Solanum tuberosum theo hướng tạo cây trinh sinh khi sử dụng khoai tây dại Solanum phureja như cây cảm ứng

(3) Xây dựng quy trình tách, nuôi cấy và tái sinh tế bào trần

(4) Nghiên cứu xây dựng quy trình dung hợp tế bào trần bằng hóa chất và xung điện

(5) Chọn lọc con lai soma có mức bội thể 4x qua phân tích nhiễm sắc thể, isozyme và phân tích ADN

(6) Đánh giá đặc tính kháng virus của các con lai soma thông qua phương pháp lây bệnh nhân tạo, ELISA hoặc PCR

(7) Nhân nhanh in vitro các con lai soma, tạo củ của các con lai soma

(8) Đánh giá khả năng sinh trưởng, năng suất, chất lượng và tính chống chịu virus của các dòng trên đồng ruộng (khảo nghiệm diện hẹp)

(9) Đánh giá khả năng sinh trưởng, năng suất, chất lượng và tính chống chịu virus của các dòng trên đồng ruộng (khảo nghiệm diện rộng)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.Các phương pháp nghiên cứu trong phòng

2.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:

Các dòng khoai tây diploid được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS

có bổ sung thêm chất kháng etylen để tăng diện tích lá phù hợp, tạo nguyên liệu tách tế bào trần

Cây in vitro được đặt trong phòng nuôi theo chế độ nhiệt độ là 210C,

cường độ chiếu sáng 3000-4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngày

2.3.1.2 Phương pháp tách protoplast: (Được tiến hành tại Viện Sinh học Nông

2 Ngắt và thái nhỏ lá cây in vitro bằng một lưỡi dao sắc nhọn trong một đĩa petri chứa 10ml dung dịch rửa II (Washing solution II hay còn gọi là dung dịch gây co nguyên sinh), ủ trong dung dịch co nguyên sinh 10-15 phút, sau đó loại bỏ dung dịch này và bổ sung dung dịch enzym (Enzym solution), quấn parafilm

Cách tính lượng enzym:

- Bổ sung 10ml dịch co nguyên sinh vào đĩa petri, quấn parafilm rồi mang đi cân (m1), sau đó ngắt lá cây in vtro vào đĩa, lại quấn parafilm và đem đi cân lần 1 (m2) Khối lượng lá cây in vitro cần tách = m2-m1= m ) Vậy thể tích enzym cần lấy = m x 10 (ml)

3 Ủ đĩa petri trong tối và qua đêm tại nhiệt độ phòng (20-220C) trong thời gian 14-16 giờ; kết thúc giai đoạn này, quan sát các tế bào dưới kính hiển vi, ghi lại chất lượng protoplast (trong một vài trường hợp tùy thuộc vào từng kiểu gen,

có thế chuyển các đĩa petri vào lắc trong thời gian 5-15 phút)

4 Lọc dịch huyền phù tế bào qua rây rọc 2 lớp (100/50µm) vào 1 lọ vô trùng; dùng pipette hút 5-10ml dung dịch nổi (Rinsing Solution); sau đó

bổ sung dịch huyền phù protoplast vào các ống ly tâm (từ bước này phải

làm việc trên đá để tránh gây tổn thương protoplast)

5 Ly tâm lần 1 (15 phút, 50g = 600 rpm)

6 Dùng một pippette Pasteur vô trùng hút cẩn thận lớp dịch nổi phía trên cùng vào một ống ly lâm khác, bổ sung 10ml dung dịch rửa I (Washing Solution I) và đem ly tâm lần 2 (8 phút, 80g = 700 rpm)

7 Protoplast kết tủa xuống phía đáy, loại bỏ lớp bên trên, bổ sung 10 ml dung dịch rửa II (Washing Solution II) rồi đem ly tâm lần 3 (8 phút, 80g = 700 rpm)

8 Hút bỏ dịch phía trên, bổ sung dung dịch dung hợp (Fusion Solution) hoặc môi trường nuôi (tùy mục đich thí nghiệm) và tính mật độ protoplast

Hình 2.1 Các bước tách tế bào trần

1 Lá cây in vitro dùng làm nguyên liệu tách tế bào trần; 2 Lắc 5-10 phút; 3 Huyền phù tế bào trần sau khi ủ và lắc trong dung dịch enzym; 4 Lớp nổi tế bào trần sau khi ly tâm lần 1; 5 Tế bào trần kết tủa sau ly tâm lần 2; 6 tế bào trần sạch thu được

Phương pháp đếm và pha loãng mật độ protoplast

Dùng một pipette hút một lượng nhỏ dịch huyền phù protoplast vào một buồng đếm hồng cầu (Thomahaemocytometer)

(29 : 20) x 1 ml = 1,45 (hút thêm 1,45 ml môi trường nuôi vào dịch huyền phù protoplast ta có 2,45 ml huyền phù protoplast ở mật độ 2,0 x 105 Pps.)

2.3.1.3 Phương pháp dung hợp protoplast bằng PEG (được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp)

Quy trình dung hợp tế bào trần bằng PEG được tiến hành theo Kao và Michaylux (1974) và được cải tiến theo Menczel và cs (1981) bao gồm bước sau (hình 2.2):

- Trộn lẫn tế bào trần của hai dòng khoai tây nhị bội khác nhau có mật độ 3,5x105 tế bào/ml theo tỷ lệ 1:1 (trong môi trường nuôi VKM II)

- Tiến hành dung hợp tế bào trần bằng hóa chất PEG 8000 trên đĩa petri nhựa(φ 3,5cm): nhỏ 100 µl hỗn hợp tế bào trần vào đĩa dung hợp Để lắng tế bào trong 15 phút ở nhiệt độ phòng, nhỏ 25 µl PEG 22,5% (PEG 22,5%, Sucrose 1,8%, CaCl2.2H2O 0,15%, KH2PO4 0,01%) vào hỗn hợp tế bào trần Ủ hỗn hợp

tế bào bằng PEG 3-4 phút

- Sau 20 phút tiến hành rửa hai lần bằng dung dịch Ca2+ để loại bỏ PEG Các bước rửa được tiến hành như sau: nhẹ nhàng hút bỏ PEG, bổ sung 200 µl dung dịch rửa Ca2+ (11% Sucrose, 0,38% Glycinevà 0,74% CaCl2) vào mỗi giọt

tế bào trần dung hợp Sau 20 phút, dùng micropipet từ từ loại bỏ dung dịch Ca2+

Hình 2.2 Các bước dung hợp tế bào bằng PEG

1 Trộn lẫn tế bào trần của hai dòng khoai tây nhị bội; 2 Để lằng tế bào; 3 Trạng thái tế bào

khi bổ sung PEG; 4 Dung hợp tế bào; 5 Tế bào sau khi loại bỏ PEG; 6 Tế bào phân chia sau

dung hợp trong môi trường nuôi cấy

2.3.1.4 Phương pháp dung hợp protoplast bằng xung điện theo Thieme và cộng

2 Sử dụng máy xung điện (electrofusion machine) của công ty Krϋss, Đức Đặt

buồng dung hợp vào dưới kính hiển vi trong một tủ cấy vô trùng; trước khi dung

hợp và trong quá trinh dung hợp phải khử trùng buồng xung điện bằng cồn 70%;

hút 400 µm hỗn hợp protoplast trong dung dịch dung hợp (Fusion Solution) vào

buồng xung điện

3 Khởi động máy xung điện với các thông số như sau:

2 Sau một pha cực nhanh theo một chương trình đã được cài đặt sẵn, dưới

tác dụng của luồng xung điện, các protoplast kết hợp với nhau (có thể

quan sát được dưới kính hiển vi), khi chương trình ngừng lại, dùng pipette

hút dịch protoplast vào đĩa petri (Ø = 3,5 cm) và bổ sung 1,8 ml môi trường nuôi: VKM II hoặc VKM II + BSA; quấn parafilm rồi đem nuôi cấy ở điều kiện 250C và tối

2.3.1.5 Phương pháp nuôi cấy và tái sinh tế bào trần sau dung hợp (Theo Thieme et al., 2008) (Được tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp)

Các tế bào trần được nuôi cấy trong đĩa petri nhỏ (φ 3.5cm hoặc φ 5cm) với môi trường lỏng phù hợp trong điều kiện tối 250C Sau 3-4 tuần có thể thấy các microcallus xuất hiện Các microcallus này sẽ được cấy chuyển sang đĩa petri lớn (φ 9cm) chứa môi trường cứng Cul-medium (Haberlach et al., 1985) Các đĩa petri này được đặt trong phòng nuôi với quang chu kỳ là 16h chiếu sáng/ngày, nhiệt độ là 220C

Sau 3-8 tuần có thể thu được các marcocallus với kích thước 0,5-1,5mm nằm trên bề mặt thạch Các marcocallus được cấy chuyển tiếp sang môi trường tái sinh RJM (Möllers và Wenzel, 1992), đặt trong điều kiện nuôi cấy macrocallus Khoảng 8-12 tuần sau khi cấy chuyển, marcocallus sẽ tái sinh thể chồi Các thể chồi được chuyển sang môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) để tạo cây hoàn chỉnh

2.3.1.6 Phương pháp xác định con lai bằng đếm độ bội flow cytometry (Tiến hành tại Khoa CNSH- Đại học Nông nghiệp Hà Nội)

Thí nghiệm được tiến hành theo Thieme và cs (2008) trên máy Partec cell analyzer CA II (PARTEC GmbH, Munster): sử dụng High resolution DNA kit

(PARTEC) với nguyên liệu là lá cây in vitro của các dòng khoai tây tái sinh sau

dung hợp tế bào trần và các dòng khoai tây nhị bội “bố mẹ” Đỉnh chuẩn được xác định ở vị trí có cường độ huỳnh quang tương đối gần 200 khi phân tích cây

đối chứng (2x)

2.3.1.7 Phương pháp xác định con lao soma bằng chỉ thị phân tử ISOZYM (theo Thach et al., 1993) (Tiến hành tại Viện Sinh học Nông nghiệp)

Sử dụng mẫu lá từ cây invitro sau khoảng 3 tuần tuổi, cân khoảng

200-300 mg mẫu cho vào cối sứ, bổ sung đệm nghiền theo tỷ lệ 1:1, tiến hành nghiền đều cho tới khi đồng nhất Sau đó đưa toàn bộ dịch mẫu vào ống eppendof, đem ly tâm mẫu 1 lần ở 12000 rpm trong điều kiện lạnh (40C) trong

10 phút; ly tâm lần 2 trong 5 phút, Dịch enzyme thu được giữ trong tủ lạnh sâu

-200C để dùng làm nhiều lần

* Thành phần đệm nghiền mẫu:

+ Sacaroza 5% (w/v) + 2-mercaptotannol 1% (v/v)

- Chuẩn bị gel polyacrylamide và điện di Sau điện di gel được lấy ra và

nhuộm vào dung dịch nhuộm phù hợp,

- Phương pháp nhuộm isozym

Tùy từng loại isozym mà sử dụng cơ chất và thuốc nhuộm đặc trưng

Nhuộm isozym esterase :

Sau khi lấy bản gel ra khỏi khuôn để gel vào đĩa thủy tinh, đổ dung dịch I vào ủ gel trong 30 phút trong tối, Bỏ dung dịch I, sau đó đổ dung dịch II vào ủ trong tối cho tới khi xuất hiện vạch thì bỏ dung dịch nhuộm, rửa bằng nước cất nhiều lần, Cố định gel bằng dung dịch axit axetic 7%,

Nhuộm isozym peroxidase:

Cách nhuộm: Hòa tan Bezidin trong axit acetic, gel sau khi lấy ra đem ủ trong tối khoảng 1 tiếng, Trước khi nhuộm cho H2O2 vào, khi xuất hiện vạch thì

đổ dung dịch nhuộm đi và cố định mẫu bằng cồn 70%, Lưu ý băng chuẩn (màu xanh) chỉ xuất hiện trong vài phút,

2.3.1.8 Phương pháp xác định con lai soma bằng chỉ thị SSR: dựa trên chỉ thị

phân tử SSR kết hợp sử dụng hệ thống phân tích di truyền đa năng GenomeLab

GeXP 8800 (Beckman GenomeLab Coulters ):

Phương pháp tách chiết ADN:

+ DNA được chiết tách từ cây khoai tây in vitro Cân khoảng 50 mg lá tươi,

sử dụng máy hòa tan (Retsch GmbH Co KG) để tạo dung dịch đồng nhất Áp dụng phương pháp chiết tách CTAB đã được chỉnh sửa theo Doyle và Doyle (1990)

+ Hàm lượng và độ tinh khiết của mẫu DNA thu được sẽ được xác định bởi máy đo quang phổ (spectrophotometer) NanoDrop 8000 (Thermo

Scientific), sau đó dung dịch DNA được pha loãng đến 20 ng/ul

có đánh dấu đuôi, 0.17 uM mồi ngược, 0.07 uM mồi đánh dấu M13 và 0.5 đơn

vị enzyme Taq DNA polymerase

- Chu kỳ PCR bao gồm: bước đầu tiên 5 phút; 30 chu kỳ với mỗi chu kỳ kéo dài 30 giây ở 94oC, 45 giây ở 60oC, 45 giây ở 72oC; 8 chu kỳ với 30 giây ở 94oC, 45 giây ở 56oC, 45 giây ở 72oC; và bước kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 10 phút

- Sản phẩm PCR được cho vào ống mao quản và phân tích theo thiết bị GenomeLab GeXP 8800 (Beckman Coulter) Kích thước của các đoạn ADN được xác định tự động bởi phần mềm phân tích chuyên dụng đi kèm với máy 2.3.1.9 Phương pháp đánh giá khả năng kháng virus bằng phương pháp DAS –

ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme – linked imunosorbent assay)

Bước 1: Cố định kháng thể IgG đặc hiệu của virus vào bản ELISA

IgG hòa trong dung dịch đệm carbonat, cho vào mỗi giếng 200µl Đặt bản ELISA trong hộp ẩm có nắp đậy, để vào tủ ấm ở nhiệt độ 370C trong 2 giờ Sau khi ủ, các giếng được rửa bằng dung dịch đệm rửa (PBS-T) 4 lần

Bước 2: Cố định dịch cây vào bản ELISA

Nghiền mỗi mẫu 1g trong đệm chiết với độ pha loãng 1/10 Dịch cây được nhỏ vào bản ELISA với lượng 200µl/1giếng Đồng thời cho 200µl dung dịch đối chứng âm và 200µl dung dịch đối chứng dương vào các giếng đánh dấu riêng Ủ bản Elisa ở 370C trong 2 giờ Sau khi ủ các giếng được rửa bằng dung dịch đệm rửa (PBS-T) 4 lần, mỗi lần trong 5 phút

Bước 3: Cố định IgG liên kết Enzyme

Hòa IgG liên kết enzyme (IgG – E) trong dung dịch đệm liên kết Cho vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA được ủ trong 2 giờ và rửa như bước 2

Bước 4: Cố định chất nền vào bản ELISA

Hòa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch đệm subtra theo

tỷ lệ đã cho Sau đó nhỏ vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA để trong hộp ẩm được đặt ở nhiệt độ phòng Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng Sau 1 giờ các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng dương tính, giếng không có màu là không có phản ứng Kết quả được đọc chính xác hơn trên máy đọc ELISA ở bước sóng 405nm

2.3.1.10 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng: (Tiến hành tại Viện SInh học Nông nghiệp)

Hàm lượng đường khử (theo phương pháp Ixekut), hàm lượng vitamin C (được định lượng theo phương pháp chuẩn độ Iot), hàm lượng tinh bột (được xác định dựa vào hàm lượng đường khử sau khi thủy phân tinh bột bằng HCl)

2.3.2 Các phương pháp ngoài đồng

2.3.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm chậu vại

Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCB với 3 lần

nhắc lại, mỗi dòng 30 cây Các dòng cây lai soma và các dòng "bố mẹ" sau nuôi

cấy in vitro 4 tuần được trồng trong chậu vại và đặt trong điều kiện nhà màn để theo dõi và đánh giá các đặc tính sinh trưởng, phát triển, năng suất và khả năng

kháng virus Theo dõi định kỳ 1 tuần/lần

2.3.2.2 Phương pháp đánh giá tính kháng virus bằng lây nhiễm nhân tạo với virus PVY theo Dr Jorg Schubert – Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng – Đức- Năm 2011) (Được tiến hành tại Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trông – CHLB Đức)

- Dùng bột carborundum (silicon carbide, Aldrich 357391) chà nhẹ lên lá non của các cây thuốc lá (Nicotiana tabacum)

- Nghiền khoảng 20mg nguyên liệu lá nhiễm bệnh đông khô trong một cối chày

- Rửa sạch lá đã lây nhiễm bằng cách phun nước sạch

- Lây nhiễm mỗi dòng 4 cây, lây trên lá đang phát triển tốt Lây vào lúc chiều mát, thời gian lây nhanh (khoảng 15 phút) để đảm bảo khả năng lây nhiễm virus

- Sau khi lây nhiễm quan sát triệu chứng biểu hiện của từng dòng và tinhs tỷ lệ phần trăm số cây không nhiễm /tổng số cây lây nhiễm

2.3.2.3 Phương pháp tạo cây khoai tây nhị bội (2x) từ cây tứ bội (Solanum tuberosum theo hướng tạo cây trinh sinh (Theo phương pháp của Viện JKI- CHLB Đức) (Được tiến hành tại Viện nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng – CHLB Đức)

Phương pháp trồng cây mẹ: cây mẹ được trồng trong chậu vại và chăm

sóc trong nhà màn hạn chế các nguồn bệnh từ bên ngoài Một trong những thao tác quan trọng trên cây mẹ là kìm hãm sự sinh trưởng tạo củ, kích thích sự sinh trưởng thân lá (hình 2.3)

Hình 2.3 Trồng cây mẹ phục vụ lai tạo Phương pháp lấy hạt phấn của dòng cho phấn (khoai dại Solanum phureja): tiến hành lấy bao phấn từ những bông hoa đã nở, đem phơi khô 2

ngày dưới ánh sáng đèn sợi đốt, sau đó tiến hành thu hạt phấn

Hình 2.4 Các bước lấy hạt phấn của dòng Solanum phureja

1- Thu hoa S.Sphureja; 2- Thu bao phấn; 3- Phơi khô bao phấn; 4- Thu hạt phấn

4

Hình 2.5 Các bước khử trên cây mẹ

1- Chùm hoa được khử đực; 2- Hoa sau khử đực

Phương pháp lai: 1 ngày sau khử đực, các chùm hoa này được thụ phấn, đeo

biển và bao kín bằng túi thoáng khí

Hình 2.6 Các bước lai tạo

1- Hoa 1 ngày sau khi khử đực; 2- Thụ phấn, 3- Chùm hoa sau lai tạo được đeo biển và bao kín

Phương pháp bảo quản quả lai và hạt lai: thu các quả lai bị rụng trong

quá trình nuôi dưỡng quả, đem phơi khô dưới ánh sáng tán xạ, để quả trong điều kiện 210C 1-2 tháng, rồi bảo quản quả ở nhiệt độ 4-80C Đối với các quả lai sinh trưởng phát triển tốt trên cây mẹ, sau 2-3 tháng hạt chín sinh lý thu hoạch quả và bảo quản quả trong điều kiện 4-80C

Phương pháp tạo cây hoàn chỉnh từ hạt lai trong điều kiện in vitro:

khử trùng vỏ quả lai, tách vỏ quả lấy hạt lai và gieo trên môi trường MS

(Murashige and Skoog, 1962)

2.3.2.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm trên đồng ruộng

Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh RCB với 3 lần nhắc lại, mỗi dòng lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 30 cây.Theo dõi và đánh giá các đặc tính

sinh trưởng, phát triển, hình thái, các đặc tính năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất bao gồm các chỉ tiêu cụ thể sau:

- Chiều cao cây (cm)

- Số lá

- Đường kính thân

- Diện tích lá (LAI)

- Thời gian sinh trưởng

- Hình thái về lá, thân, củ, độ sâu mắt củ, màu sắc củ

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Thu thập, đánh giá và chọn lọc các dòng khoai tây nhị bội có khả năng

kháng virus và mang các tính trạng nông sinh học tốt phục vụ cho quá

trình dung hợp tế bào trần

Nghiên cứu này nhằm thu thập, đánh giá và chọn lọc được mẫu giống có

đặc tính kháng bệnh virus PVY và virus PVX đồng thời mang các đặc tính nông

sinh học có giá trị ở dạng nhị bội làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống, từ đó đề

xuất các tổ hợp lai cho dung hợp; đồng thời bước đầu xác định được các chỉ thị

phân tử có thể sử dụng trong việc thanh lọc con lai

Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi đã thu thập được 17 dòng

khoai tây nhị bội (2n = 2x = 24) bao gồm (bảng 3.1):

+ 08 dòng khoai tây nhị bội (A15, A16, A41, A56, B186, B208,

H1959/195 và H1929/34) từ Viện nghiên cứu Tài nguyên cây trồng- Bavaria-

Cộng hòa liên bang Đức

+ 06 dòng khoai tây nhị bội (9139, 9169, 9183, 9170, 9174, 9201 từ Viện

Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng – JKI- Đức)

+ 03 dòng khoai tây nhị bội từ CIP

Bảng 3.1 Các dòng khoai tây nhị bội thu thập được