nghiệp)
Theo quy trình E.C.Cooking (1960) và có cải tiến theo Thach et al. (1993) và Thieme (1997) (hình 2.1)
1. Nhân 10-20 cây in vitro/mỗi kiểu gen bố mẹ trong bình thủy tinh từ 3-4 tuần tuổi, trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 220C ; để các nguyên liệu này trong tối trước khi tiến hành các thí nghiệm dung hợp
2. Ngắt và thái nhỏ lá cây in vitro bằng một lưỡi dao sắc nhọn trong một đĩa petri chứa 10ml dung dịch rửa II (Washing solution II hay còn gọi là dung dịch gây co nguyên sinh), ủ trong dung dịch co nguyên sinh 10-15 phút, sau đó loại bỏ dung dịch này và bổ sung dung dịch enzym (Enzym solution), quấn parafilm.
Cách tính lượng enzym:
- Bổ sung 10ml dịch co nguyên sinh vào đĩa petri, quấn parafilm rồi mang đi cân (m1), sau đó ngắt lá cây in vtro vào đĩa, lại quấn parafilm và đem đi cân lần 1 (m2). Khối lượng lá cây in vitro cần tách = m2-m1= m ). Vậy thể tích enzym cần lấy = m x 10 (ml)
3. Ủ đĩa petri trong tối và qua đêm tại nhiệt độ phòng (20-220C) trong thời gian 14-16 giờ; kết thúc giai đoạn này, quan sát các tế bào dưới kính hiển vi, ghi lại chất lượng protoplast (trong một vài trường hợp tùy thuộc vào từng kiểu gen, có thế chuyển các đĩa petri vào lắc trong thời gian 5-15 phút).
4. Lọc dịch huyền phù tế bào qua rây rọc 2 lớp (100/50µm) vào 1 lọ vô trùng; dùng pipette hút 5-10ml dung dịch nổi (Rinsing Solution); sau đó bổ sung dịch huyền phù protoplast vào các ống ly tâm (từ bước này phải làm việc trên đá để tránh gây tổn thương protoplast).
6. Dùng một pippette Pasteur vô trùng hút cẩn thận lớp dịch nổi phía trên cùng vào một ống ly lâm khác, bổ sung 10ml dung dịch rửa I (Washing Solution I) và đem ly tâm lần 2 (8 phút, 80g = 700 rpm)
7. Protoplast kết tủa xuống phía đáy, loại bỏ lớp bên trên, bổ sung 10 ml dung dịch rửa II (Washing Solution II) rồi đem ly tâm lần 3 (8 phút, 80g = 700 rpm) 8. Hút bỏ dịch phía trên, bổ sung dung dịch dung hợp (Fusion Solution) hoặc
môi trường nuôi (tùy mục đich thí nghiệm) và tính mật độ protoplast
Hình 2.1. Các bước tách tế bào trần
1. Lá cây in vitro dùng làm nguyên liệu tách tế bào trần; 2. Lắc 5-10 phút; 3. Huyền phù tế bào trần sau khi ủ và lắc trong dung dịch enzym; 4. Lớp nổi tế
bào trần sau khi ly tâm lần 1; 5. Tế bào trần kết tủa sau ly tâm lần 2; 6. tế
bào trần sạch thu được
Phương pháp đếm và pha loãng mật độ protoplast
Dùng một pipette hút một lượng nhỏ dịch huyền phù protoplast vào một buồng đếm hồng cầu (Thomahaemocytometer)
Ví dụ: Dòng 1 (1ml): 29 protoplast = 3,0 x 105 Pp. Dòng (0,5 ml): 18 protoplast = 2,0 x 105 Pp.
Muốn pha loãng mật độ của dòng 1 thành mật độ 20 Pp.
1 2 3 4 5 6
(29 : 20) x 1 ml = 1,45 (hút thêm 1,45 ml môi trường nuôi vào dịch huyền phù protoplast ta có 2,45 ml huyền phù protoplast ở mật độ 2,0 x 105 Pps.)