“Nghiên cứu, xác định nấm gây bệnh loét trên cây Thanh long”.

Trên thế giới Thanh long là cây ăn quả lâu năm được trồng nhiều ở Mỹ, Nhật, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc, Đài Loan.Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thế giới. Vì vậy, việc nâng cao năng xuất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm, đã có rất nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long. Thanh long bị gây hại bởi một số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.) bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.) tuy nhiên những năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm N. dimidiatum đây là một bệnh có ảnh hưởng lớn nhất đến năng xuất chất lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho người trồng Thanh long. Trước vấn đề cấp thiết trên nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và tìm hiểu về nấm N. dimidiatum....

Lời cảm ơn

Sau một thời gian thực tập tại Bộ môn bệnh cây khoa nông học và Trungtâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, dưới sựgiúp đỡ, chỉ bảo và dìu dắt tận tình của thầy và các cán bộ tại Trung tâm, cùng với

sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp củamình

Em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đức Huy

đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quan trọng,quý báu trong suốt quá trình học tập cũng như nghiên cứu Em xin chân thành cảm

ơn thầy giáo cô giáo trong bộ môn Bệnh cây khoa Nông học Học Viện NôngNghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn tới anh Lê Quang Khải, cán bộ nghiên cứu của ViệnBảo vệ thực vật đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu thập mẫu bệnh Thanhlong Qua đây em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô trong Bộmôn Bệnh cây cũng như các thầy cô trong khoa Nông học đã tận tình giảng dạy,dìu dắt em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường

Cuối cùng, với tất cả lòng kính trọng và biết ơn, em xin gửi lời cảm ơn tới

Bố, Mẹ, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, hết lòng giúp

đỡ em trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Hà Nội, Ngày 25 tháng 07 năm 2014

Sinh viên

Lý Phương Ngà

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Cây Thanh long (Hylocereus undulatus Haw.) thuộc họ Xương rồng có

nguồn gốc ở các vùng sa mạc thuộc Mehico và Colombia Đây là cây ăn quả nhiệt

đới, thích hợp khí hậu nắng nóng, chịu hạn tốt nhưng không chịu được úng, sau khitrồng một năm cây bắt đầu cho quả Cây Thanh long thích hợp với nhiều chân đấtnhư đất xám, đất phù sa, đất đỏ và đất phèn, quả có nhiều chất dinh dưỡng nên cóhiệu quả kinh tế cao do giá bán cao và có giá trị xuất khẩu Trên thế giới, Thanhlong đã và đang là cây ăn quả quan trọng đem lại hiệu quả kinh tế lớn cho nhiềunước như Đài Loan, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc,

Tại Việt Nam, Thanh long được trồng nhiều ở các tỉnh như Bình Thuận,Tiền Giang, Long An với diện tích khoảng 10.000 ha và đem lại hiệu quả kinh tếrất cao Việt Nam là nước duy nhất ở Đông Nam Á có trồng Thanh long tương đốitập trung trên quy mô thương mại với diện tích ước lượng 4.000 hecta (1998), tậptrung tại Bình Thuận 2.716 hecta, phần còn lại là Long An, Tiền Giang, TP HCM,Khánh Hòa và rải rác ở một số tỉnh khác Ở miền Bắc, cây Thanh long mới đượctrồng ở một số vùng như Hòa Bình, Hà Tây, Phú Thọ và rải rác trong các hộ giađình với diện tích còn thấp (khoảng 20-30 ha) Hiện nay, nước ta đã xuất khẩuThanh long sang nhiều nước dưới dạng quả tươi và dạng đông lạnh

Thanh long được người Pháp đưa vào trồng ở Việt Nam khoảng 100 nămnay, nhưng mới được đưa lên thành hàng hóa từ những năm 1980 Thanh long gồm

có 3 loại: Ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ và ruột trắng vỏ vàng nhưng phổ biến ởViệt Nam là hai giống ruột trắng vỏ đỏ, ruột đỏ vỏ đỏ

Việt Nam là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thích hợp cho cây Thanhlong sinh trưởng phát triển tốt Tuy nhiên nhiệt độ cao, lượng mưa lớn cũng là điềukiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển và gây hại Trong quá trình sinhtrưởng, cây Thanh long bị gây hại bởi một số loại dịch hại như kiến, bọ xít, ruồi

vàng và bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.) bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.) và gần đây là bệnh loét do nấm gây ra.

Bệnh loét mới được phát hiện tại nước ta từ tháng 6 năm 2013 (báo điện tử

Cà Mau), gây hại trên thân, quả và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch Bệnh gây ảnh

hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây, làm giảm năng suất, chất lượng quả

ở các vùng sản xuất Thanh long tập trung như Bình Thuận, An Giang Đặc biệt,các vết loét tồn tại trên quả đã làm giảm giá trị thương phẩm Bệnh loét gây hại rất

ít tại các vùng trồng Thanh long ở miền Bắc

Các nghiên cứu về bệnh loét trên cây Thanh long ở Việt Nam hầu như rất ít.Cho đến nay, chưa có công trình nghiên cứu nào được đăng trên các tạp chí chuyênngành trong nước hoặc trên thế giới Xuất phát từ thực trạng trên, việc tìm hiểunghiên cứu tình trạng dịch bệnh đặc biệt là bệnh loét trên cây Thanh long là vấn đềrất quan trọng được các nhà chuyên môn, tổ chức trong nước và quốc tế quan tâm

Trên thế giới đã có một số nghiên cứu và công bố về nấm Neoscytalidium dimidiatum (N dimidiatum) gây bệnh loét trên Thanh long, nhưng tại Việt Nam có

rất ít công bố cũng như nghiên cứu chuyên sâu về bệnh dẫn đến chưa có giải phápquản lý bệnh hiệu quả, làm cho tình trạng bệnh ngày càng nặng, lây lan ngày càngrộng gây thiệt hại lớn về năng suất, chất lượng, ô nhiễm môi trường và ảnh hưởngtới xuất khẩu Vì vậy, xuất phát từ thực trạng trên và sự phân công của khoa Nônghọc – Học viện Nông nghiệp Việt Nam cùng với sự hướng dẫn của TS Nguyễn

Đức Huy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu, xác định nấm gây bệnh loét trên cây Thanh long”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Xác định, nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân tử của nấm gây bệnh loét trêncây Thanh long và thử hiệu lực ức chế nấm bằng một số loại thuốc hóa học và thảomộc trên môi trường nhân tạo PDA

1.2.2 Yêu cầu

Thu thập mẫu loét trên thân, quả Thanh long (tại các chợ Hà Nội và vùngphụ cận), Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc (Bình Thuận), Long An

Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh

Xác định nấm gây bệnh loét dựa trên kỹ thuật PCR và giải trình tự vùngITS của nấm

Xác định đặc điểm sinh học và phân tử của nấm gây bệnh loét trên câyThanh long

Thử nghiệm hiệu lực ức chế nấm bằng nấm đối kháng, thuốc thảo mộc (cónguồn gốc từ cây nghệ) và một số thuốc hóa học

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Vai trò của Thanh long

Thanh long là cây ăn quả nhiệt đới cho năng suất cao, có giá trị xuất khẩumang lại hiệu quả kinh tế cao Tại Việt Nam, Thanh long đã góp phần thay đổicuộc sống của nhiều nông dân ở các tỉnh như Bình Thuận, Long An, TiềnGiang,

Thanh long là cây ăn quả ngon, là thực phẩm quan trọng đối với con người.Thanh long có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, trung bình một quả Thanh longchứa khoảng 60 đơn vị calo, 60mg natri, 8g đường và 1g chất xơ Không giốngnhư các loại trái cây khác, ngoài các chất dinh dưỡng kể trên, Thanh long còn chứa2g chất béo không bão hòa và 2g protein Hầu hết hàm lượng chất béo và proteinđược tìm thấy trong các hạt màu đen, nhỏ li ti của quả Thanh long Thanh longchứa một hàm lượng đáng kể vitamin C, carotin, canxi, một số loại vitamin B, một

số chất dinh dưỡng và chất chống oxy hóa khác Những dưỡng chất này giúp hệthống tiêu hóa trong cơ thể hoạt động tốt hơn, tăng cường hệ miễn dịch, nănglượng dồi dào Ngoài ra, ăn Thanh long còn rất tốt cho da và thị lực thậm chí có thểgiúp nhanh khỏi và giảm mức độ nghiêm trọng của cảm lạnh thông thường Đốivới những người đang cố gắng để tăng lượng chất xơ trong khẩu phần ăn hàngngày, Thanh long có thể là một lựa chọn thay thế tuyệt vời Các chất xơ hòa tan cótrong Thanh long có thể giúp mọi người giảm cân, giảm lượng đường trong máu,nuôi dưỡng ruột và ngăn ngừa ung thư ruột kết Thanh long cung cấp đầy đủ chất

xơ, giúp giảm cholesterol, kiểm soát trọng lượng và loại bỏ các độc tố một cáchhiệu quả cho con người Thanh long được chứa đầy đủ các chất chống oxy hóa,giúp bảo vệ các tế bào của cơ thể trước sự tấn công của các gốc tự do, đẩy lùi tốc

độ lão hóa và thậm chí là ngăn chặn bệnh ung thư Hàm lượng anthocyanin cótrong Thanh long là rất cao Anthocyanin là một loại chất chống oxy hóa Nó cóthể giúp mọi người ngăn chặn xơ cứng mạch máu, bệnh tim và nguy cơ xuất huyếtnão Đồng thời, anthocyanin có thể chống lại các gốc tự do để trì hoãn sự lão hóa

của cơ thể con người và ngăn chặn sự hình thành của bệnh mất trí nhớ do tuổi già.Hàm lượng sắt có trong Thanh long cũng là cao, sắt là nguyên liệu cần thiết để sảnxuất hemoglobin trong cơ thể con người vì vậy chúng ta có thể bổ sung sắt để ngănchặn bệnh thiếu máu bằng cách ăn Thanh long Ngoài ra protein chay chứa trongquả Thanh long có thể được tích hợp tích cực với các kim loại nặng trong cơ thểcon người để loại bỏ các độc tố và bảo vệ thành dạ dày.

2.2 Những nghiên cứu về Neoscytalidium dimidiatum

2.2.1 Nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới Thanh long là cây ăn quả lâu năm được trồng nhiều ở Mỹ,Nhật, Thái Lan, Malaysia, Trung Quốc, Đài Loan

Thanh long là cây ăn quả phổ biến và được sử dụng rộng rãi nhất trên thếgiới Vì vậy, việc nâng cao năng xuất và chất lượng sản phẩm đang được quan tâm,

đã có rất nhiều nghiên cứu về tình hình bệnh hại trên Thanh long Thanh long bị

gây hại bởi một số bệnh như bệnh thối đầu cành (Alternaria sp.) bệnh đốm nâu trên cành (Gleosporium agaves), bệnh đốm xám hay còn gọi là nám cành (Sphaceloma sp.) tuy nhiên những năm gần đây Thanh long lại bị gây hại nặng bởi nấm N dimidiatum đây là một bệnh có ảnh hưởng lớn nhất đến năng xuất chất

lượng sản phẩm gây thiệt hại lớn cho người trồng Thanh long Trước vấn đề cấp

thiết trên nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và tìm hiểu về nấm N dimidiatum.

Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, cành bào tử, kích thước bào tử và hìnhthái tản nấm dựa vào khóa phân loại của Ellis (1976) đã xác định tác nhân gây

bệnh loét trên Thanh long là do nấm Scytalidium dimidiatum (Penz.) B Sutton & Dyko (1989), hiện nay nấm còn được gọi tên là Neoscytalidium dimidiatum (Penz.)

Crous & Slippers (2006)

Đặc điểm vị trí phân loại của nấm N dimidiatum (Agrios 2005), (Crous &

Slippers 2006)

Ngành Ascomyta

Lớp Dothideomycetes

Họ Botryosphaeriaceae

Chi Neoscytalidium

Loài: Neoscytalidium dimidiatum

N dimidiatum thuộc ngành nấm túi (Ascomycota), Ascomyta có cơ thể sinh

dưỡng dạng sợi đa bào, phân nhánh phức tạp, có vách ngăn, một tế bào thường cómột nhân đôi khi có nhiều nhân, dạng chuyên hóa dạng sợi bắt đầu đứt đoạn ra tạothành cơ thể đơn bào hình tròn, bầu dục chứa nhiều nhân hay một nhân Vách tếbào cấu tạo bằng chitin hay glucan, đa số hoại sinh gây mục gỗ, hoại sinh trên đất,trong nước, trên cạn, thực vật động vật, một số lại ký sinh gây bệnh trên thực vật,động vật, người gây nên những thiệt hại lớn Ascomyta sinh sản sinh dưỡng bằng

sự chia đôi tế bào nảy chồi, đứt đoạn sợi nấm, bào tử áo, bào tử màng dày, sinh sản

vô tính bằng bào tử đính (conidia), và sinh sản hữu tính bằng bào tử túi Các bào tửkhác tính (+, -) sợi nấm đơn bội, phân nhánh thành hệ sợi nấm hình thành các cặp

cơ quan sinh sản, giao phối sinh chất, hình thành sợi sinh túi đa bào, sau đó phânchia nguyên nhiễm kết hợp thành nhân lưỡng bội rồi giảm nhiễm tạo thành bào

tử túi Chu trình sống của Ascomyta gồm 3 giai đoạn: giai đoạn đơn bội, giaiđoạn song hạch và giai đoạn lưỡng bội, trong đó giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế.Một số Ascomyta hình thành quả thể trong đó có quả thể kín, quả thể mở lỗ vàquả thể hở

Chi Neoscytalidium được mô tả đầu tiên của Crous & Slippers vào năm 2006.

N dimidiatum có cơ thể dạng sợi, đơn bào, phân nhánh có vách ngăn sinh

sản bằng hình thức sinh dưỡng đứt đoạn sợi nấm tạo cơ thể đơn bào hình tròn, bầudục, chứa một hay nhiều nhân

Theo báo cáo đầu tiên về nấm N dimidiatum trên cây có múi tại Italya (G.

Polizzi & cs., 2008) Vào tháng 9 năm 2008 một căn bệnh mới đã được phát hiện

và chú ý ở phía Sicily, Italy trong vườn cây có múi (cam ngọt (Citrus sinensis (L.)Osbeck cv.Tarocco Scirè ) 2 tuổi đã xuất hiện một bệnh mới với triệu chứng điểnhình là chồi kém phát triển và thối trên thân, cành, gốc ghép, vết thối chảy gôm.Trong một thời gian ngắn xuất hiện khối bào tử của nấm màu đen dưới lớp vỏ cây

và trên bề mặt vết thối Sau khi phân lập trên môi trường PDA, xác định nấm có

đặc điểm giống nấm Scytalidium với các đặc điểm như sợi nấm màu nâu phân

nhánh có vách ngăn, bào tử hình trứng, elip, đỉnh tròn có 0 – 2 vách ngăn, màunâu Sau khi phân lập tiến hành kiểm tra bằng phương pháp PCR, DNA được chiếtsuất từ sợi nấm sau đó sử dụng các mồi V9G và ITS4 để khuếch đại operon rRNAhạt nhân kéo dài đầu 3' của gen 18S rRNA, các miếng đệm bên trong sao chép, genrRNA 5.8S, và một phần của kết thúc 5' của gen 28S rRNA Sau khi phân tích trình

tự DNA trên cơ sở đặc điểm hình thái và các dữ liệu phân tử, bệnh đã được xác

định là do nấm N dimidiatum gây ra Bệnh đã được kiểm tra lại bằng phương pháp

lây nhân tạo trên cây cam ngọt 2 tuổi

Theo báo cáo đầu tiên của về nấm N dimidiatum và N novaehollandiae trên cây xoài tại Australia (J D Ray, T Burgess anh V M Lanoiselet 2010) N dimidiatum là loài nấm có phạm vi phân bố và có nhiều ký chủ: cây dương mai, hạt

dẻ, sung, vả, cây có múi, chuối, mận, và nhiều cây trồng khác ở Mỹ (Farret al

1989) N dimidiatum còn gây hại trên xoài (Reckhaus 1987) và nhất là trên Thanh long (Brown 2012) N dimidiatum gây nên các triệu chứng như héo cành, chết

mầm, thối, chảy gôm và làm cây chết Yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự

phát triển của nấm N dimidiatum là độ ẩm (Punithalingam and Waterson 1970;

Reckhaus 1987; Elshafie and Ba-Omar 2001)

N dimidiatum được báo cáo lần đầu tiên tại Australia liên quan đến bệnh

chết mầm của xoài (2010) Tại Australia đã tiến hành khảo sát về sức khỏe câytrồng do Bộ nông nghiệp và thực phẩm Tây Australia kết hợp với kiểm dịch viênAustralia thực hiện Tháng 8 năm 2008 trong cuộc khảo sát này các nhà nghiên cứu

đã tiến hành phân lập các triệu chứng chết mầm trên cây xoài và rễ của cây sung,sau khi tiến hành phân lập đã phát hiện nguyên nhân gây bệnh làm chết mầm, thối

rễ, thối cây là do nấm Neoscytalidium spp gây ra Neoscytalidium spp tiếp tục

được phân lập và tiến hành giải trình tự một phần DNA của vùng ITS kết quả xác

Scytalidium dimidiatum, Hendersonula toruloidea) gây ra Trong cuộc khảo sát, N dimidiatum cũng được phân lập từ các mẫu xoài lấy tại Derby, trong tháng 9 năm

2008, Broome vào tháng 9 năm 2008 và Đảo Bathurst, Northern Territory vàotháng 10 năm 2008 Sau khi phân lập các nhà khảo sát đã tiến hành lây bệnh nhântạo và tái phân lập theo quy tắc Koch đã thu được kết quả tốt Tiến hành kiểm tralại các chủng thu thập với các cuộc điều tra trước (2005) các nhà khảo sát đã phát

hiện rằng N dimidiatum đã xuất hiện và gây hại tại Australia trong thời gian dài

trước đó (phân lập từ cây có múi (Torula dimidiata 1914)) Theo báo cáo này, yếu

tố nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển gây hại của bệnh

Trước đây N dimidiatum có nhiều tên gọi khác nhau như: Fusicoccum dimidiatum, Scytalidium dimidiatum, Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, (Crous et al 2006).

Theo nghiên cứu của Mohd và ctv 2013 viện nghiên cứu sở nông nghiệp,

Đại học quốc gia Đài Loan, Trung Quốc, vào tháng 9 năm 2009 và 2010 bệnh loét

đã xuất hiện ở một số cây Thanh long tại Đài Loan Triệu chứng của bệnh là các

vết nhỏ, tròn, vết bệnh lõm, màu cam Bệnh được xác định do nấm N dimidiatum

gây ra

Năm 2008, 2009 nấm N dimidiatum đã phát hiện trên các quả Thanh long trồng ở Malaysia N dimidiatum đã gây triệu chứng như chấm tròn nhỏ, thối và sau

đó mục nát Mẫu bệnh đã được khử trùng và nuôi cấy trên môi trường PDA và ủ ở

250C trong 7 ngày Nấm thu được nuôi cấy trên môi trường PDA, nấm có quả cànhmàu đen, đường kính 90.0mm, hình elip, hình trứng, hình que hoặc hình tròn trongpha lê có 2 vách ngăn DNA chiết từ sợi nấm được nuôi cấy trên môi trường PDAthực hiện phản ứng khuếch đại sử dụng mồi ITS4 và ITS5 Cuối cùng thực hiện lâybệnh nhân tạo để so sánh và đánh giá bệnh

Đến tháng 7 năm 2011 bệnh loét trên Thanh long đã được phát hiện ở TrungQuốc với các đặc điểm là có nhiều vết nhỏ đốm nâu đỏ nhỏ hơn các vết bệnh banđầu, các vết này lan rộng và hình thành các vùng rộng lớn gây chết hoại Nấm

được nuôi cấy trên môi trường thạch đường khoai tây (PDA) và ủ ở 28oC trong 3ngày Sau khi phân lập tiến hành phản ứng PCR (phản ứng khuếch đại gen), DNAđược chiết từ sợi nấm đã được nuối cấy trong 7 ngày sử dụng Kit DNAsecure thựcvật, miếng đệm ghi chép nội bộ (ITS) khu vực của rDNAs từ phân lập đượckhuếch đại bởi mồi ITS1 và ITS4.

Đến năm 2012, Brown đã công bố báo cáo đầu tiên về nấm Neoscytalidium dimidiatum gây hại trên Thanh long tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc.

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện nay tại Việt Nam có rất ít thông tin về nấm gấy bện loét trên cây Thanhlong, chỉ có thông tin nghiên cứu của Viện nghiên cứu cây ăn quả Miền Nam

(2011) rằng bệnh loét (đốm trắng hay đốm nâu ) do nấm Neoscytalidium dimidiatum gây ra Nấm này còn có tên khác là Scytalidium dimidiatum hay Scytalidium lignicola, Hendersonula toruloidea, bệnh chủ yếu xuất hiện và tấn

công mạnh vào mùa mưa, nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là từ 20 – 30oC

Ẩm độ càng cao càng tạo điều kiện thuận lợi cho bệnh tấn công và lây lan mạnh.Bệnh lây theo gió và nguồn nước nhiễm bệnh Qua theo dõi thấy bệnh hại nặng ởnhững vườn có mực nước ngầm cao, những vườn vệ sinh kém, rậm rạp và bị chemát nhiều, vườn sử dụng nhiều phân đạm hay bón phân chuồng chưa ủ hoai, vườn

sử dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng hay vườn bón thiếu trung vi lượng đều

có tỉ lệ bệnh cao hơn bình thường và khi có bệnh thì khó phòng trừ hơn Vết bệnhban đầu là những đốm tròn nhỏ màu trắng, hơi lõm, về sau chuyển sang màu vàngcam và khi bệnh phát triển nặng đốm bệnh trở thành vết loét có màu nâu, hơi nổilên và gây ảnh hưởng nặng đến sinh trưởng của cây, năng suất và giá trị thươngphẩm của quả Bệnh thường gây hại trên bẹ non, nụ bông, quả non và giai đoạnchuẩn bị thu hoạch

Bệnh loét (đốm trắng hay bệnh đốm nâu) Thanh long, trong dân gian bà connông dân còn gọi là bệnh đốm tắc kè, bệnh ma do đặc điểm hình dạng, màu sắc

và giai đoạn phát triển của vết bệnh Bệnh loét được coi là “bệnh lạ chưa có tên

trong y văn”, thứ “bệnh phong chưa có thuốc trị” Tại Việt Nam, bệnh đốm trắngxuất hiện rải rác vào năm 2008 ở Bình Thuận với diện tích và tỉ lệ nhiễm rất ít.Hiện nay vẫn có rất ít nghiên cứu về bệnh loét trên cây Thanh long.

Năm 2009, khi những ổ dịch đầu tiên được phát hiện ở Bình Thuận thì một

số nhà chuyên môn nhận định trên báo chí rằng: “Đây là bệnh do sinh lý, do thâmcanh kém và thắp đèn quá mức” (Báo điện tử nông nghiệp)

Tại Việt Nam mặc dù cũng có vài báo cáo công bố sơ lược về tác nhân gâybệnh loét trên Thanh long nhưng vẫn còn tồn tại nhiều vấn đề nghiên cứu cần làmsáng tỏ thêm ( Nguyễn Thành Hiếu và ctv., 2011)

Đến đầu mùa mưa năm 2012 bệnh lây lan mạnh, với diện tích gần 1.000 ha,

tỷ lệ nhiễm nặng từ 10% trở lên chiếm trên 80% và bệnh đã có mặt ở khắp cácvùng trồng Thanh long tập trung của Việt Nam như Bình Thuận, Tiền Giang vàLong An, đến tháng 6/2013 diện tích nhiễm bệnh đốm trắng đã lên đến gần 3.000

ha, tỷ lệ gây hại từ 20 – 50%

Theo thống kê đến cuối năm 2013, diện tích Thanh long bị nhiễm bệnh đốmtrắng nhẹ ở tỉnh Bình Thuận là 800 ha, nặng 400 ha, trong tổng số 21 nghìn ha.Tiền Giang, với gần 3.000 ha Thanh long thì có đến 2.420 ha nhiễm bệnh đốmtrắng nhẹ, diện tích nhiễm nặng 80 ha Long An, nhiễm đốm trắng nhẹ 766 ha,nặng 41 ha, trong tổng số gần 2.700 ha và đang có xu hướng lây lan nhanh

Theo báo điện tử nông nghiệp Việt Nam 28/11/2013 Thạc sĩ Nguyễn Mỹ PhiLong, người phụ trách kỹ thuật của công ty Điền Trang cho biết đã phân lập vànhân nuôi thành công bào tử của nấm gây nên bệnh loét Mặc dù chưa khẳng định

100% nhưng có thể chắc chắn đến 90% rằng đấy là nấm N dimiditatum Nấm bệnh

này không mới nhưng là mới khi nó gây hại nặng trên cây Thanh long Các báo cáokhoa học về bệnh hại trên cây Thanh long của cả trong và ngoài nước đến hiện nay

vẫn chưa ghi tên nấm N dimiditatum N dimiditatum chẳng những có mặt trên

thân, cành, lá, hoa, quả thực vật mà tồn tại cả trong đất Trong quá trình nuôi câybào tử nấm bệnh, nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra một loài vi khuẩn đối kháng

Bacillus subtilis có khả năng kiềm chế quá trình phát triển của nấm này Công ty

Điền Trang đã nhanh chóng đưa ra ứng dụng tại Long Trì, An Lục Long và DươngXuân Hội - Châu Thành - Long An đã thu được nhiều kết quả rất khả quan.

Qua thực tế thành công của nhiều nhà vườn tại Long An, Tiền Giang, Công

ty Điền Trang cùng nhà vườn trồng Thanh long đã đúc kết và đưa ra được biệnpháp khắc phục và phòng ngừa bệnh đốm trắng (đốm nâu) theo phương châm quản

lý dịch hại tổng hợp gồm 03 bước Biện pháp này bước đầu đã mang lại hiệu quảtích cực và khả quan đáng ghi nhận:

Bước 1:

Vệ sinh vườn, tạo thông thoáng cho vườn: Cắt tỉa cành bệnh, trái bệnh, thugom tập trung lại một chỗ, đào hố, dùng vôi để xử lý Không vứt cành bệnh, tráibệnh xuống mương, rạch hoặc trong vườn vì sẽ tạo điều kiện cho bệnh lây lannhanh

Quản lý chặt nguồn nước: đánh rãnh thoát nước, không để ứ đọng nước trênvườn

Bước 3: Sau khi thực hiện xong bước 2 được 7 ngày

Phun men vi sinh siêu đậm đặc TRICHOMIX-DT chuyên dùng cho Thanhlong (nhãn hiệu 02 trái Thanh long) trên khắp tán cây, gốc cây và đỉnh trụ (liềudùng 01 gói 500 gr/100 lít nước), phun liên tục 5 - 7 ngày/1lần Chú ý phun lặp lạisau khi mưa Khi cây đã hết bệnh phun và tưới gốc định kỳ 10 - 15 ngày/lần

Trong trường hợp lấy trái thì phải phun men TRICHOMIX- DT trực tiếp vào

nụ và trái 4 lần, lần 1 ở giai đoạn nụ 10 - 15 ngày tuổi, lần 2 khi rứt râu (bẻ hoa) vàlần 3, lần 4 trong giai đoạn nuôi trái, cách nhau 7 - 10 ngày/1lần

Bón phân chuồng đã ủ hoai bằng nấm Trichoderma (3 - 5 kg/trụ) hoặc phân

xung quanh gốc và nên tủ cỏ mục, rơm hoặc lấp đất ở gốc để giữ ẩm, bón 2 - 3 lầnliên tục cách nhau 20 - 30 ngày/lần.

Đến 25/2/2014 báo điện tử nông nghiệp Việt Nam cho biết ngày 23/2/2014thứ trưởng Bộ NN-PTNT Lê Quốc Doanh đã có buổi làm việc với Viện Nghiêncứu cây ăn quả miền Nam về kết quả nghiên cứu và biện pháp phòng trừ bệnh loét(đốm trắng) trên cây Thanh long

Ông Nguyễn Thành Hiếu, đại diện nhóm nghiên cứu bệnh loét (đốm trắng)trên cây Thanh long (Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam) cho biết: Bệnh đốm trắngtrên cây Thanh long còn gọi là bệnh đốm nâu, tắc kè… gây thiệt hại nghiêm trọng

và có xu hướng ngày càng lan rộng Bệnh do nấm N dimidiatum gây ra Bắt đầu

xuất hiện rải rác vào năm 2008 tại Bình Thuận, Tiền Giang, từ 2011 trở lại đây thìbệnh tấn công mạnh và lây lan nhanh hơn Mức độ bệnh xuất hiện ở các vườn daođộng từ 20 - 25%, có vườn mất trắng làm tổn thất về kinh tế khá lớn

Bệnh gây hại trên bẹ non, nụ bông, trái non và giai đoạn chuẩn bị thu hoạch.Lúc đầu triệu chứng trên bẹ/trái là những chấm nhỏ li ti như kim, phát triển thànhđốm tròn nhỏ màu trắng, vết bệnh trũng thấp so với bẹ, về sau vết bệnh có màuvàng cam và phát triển nhô lên những vết ghẻ màu nâu và đôi khi gây thối nhũnnếu bị bệnh tấn công nặng

Trước thực trạng dịch bệnh ngày càng gây hại nghiêm trọng, Viện Nghiêncứu CĂQ miền Nam đã tiến hành nghiên cứu, khảo nghiệm bằng nhiều phươngpháp khoa học, chuyển giao kỹ thuật và triển khai tập huấn “Quy trình quản lý tổnghợp sâu bệnh hại quan trọng trên Thanh long” cho 480 nông dân ở Bình Thuận và

79 nông dân ở Tiền Giang

Ngoài ra, Viện còn cử nhiều cán bộ đi kiểm tra, theo dõi định kỳ tại một số

xã trồng Thanh long ở huyện Chợ Gạo, Tiền Giang Đồng thời đưa ra quy trình

“Quản lý bệnh đốm trắng trên Thanh long tạm thời” để giúp nhà vườn nắm bắt vàứng dụng vào sản xuất

Tại buổi làm việc, lãnh đạo Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam đã đề xuất với

Bộ NN-PTNT cho Viện tiếp tục nghiên cứu điều kiện phát sinh, phát triển của dịch

bệnh đốm trắng, nghiên cứu biện pháp vệ sinh vườn, xây dựng và chuyển giao môhình sản xuất phân hữu cơ vi sinh, sử dụng thuốc BVTV…

Đề nghị Bộ sớm ban hành quy trình quản lý bệnh đốm trắng tạm thời Phâncông nhiệm vụ triển khai công tác phòng chống bệnh cho các đơn vị Ban hànhmột số loại thuốc BVTV trước mắt để phòng trừ kịp thời Tổ chức tập huấn trêndiện rộng và xây dựng mô hình quản lý bệnh theo từng vùng

Thứ trưởng Lê Quốc Doanh chỉ đạo: Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam cầnđiều chỉnh bổ sung thêm vấn đề nghiên cứu canh tác tổng hợp vào đề tài nghiêncứu giống Thanh long đang thực hiện Bệnh đốm trắng Thanh long là vấn đề

"nóng" cần phải làm ngay, không nhất thiết chờ kết quả nghiên cứu cuối cùng

Cục BVTV tập hợp kết quả nghiên cứu quy trình quản lý bệnh đốm trắng trênThanh long tạm thời của Viện Nghiên cứu CĂQ miền Nam, Viện BVTV và Trungtâm BVTV phía Nam để nhanh sớm đưa ra quy trình quản lý tạm thời trước15/3/2014 Trung tâm Khuyến nông Quốc gia bố trí kinh phí để tập huấn, chuyểngiao quy trình quản lý dịch bệnh tạm thời tại Bình Thuận, Long An và Tiền Giang

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG,VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Bệnh loét trên cây Thanh long

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

• Mẫu bệnh và các giống Thanh long dùng trong nghiên cứu

- Các mẫu bệnh loét trên cây Thanh long được thu thập trên cả hai giốngThanh long ruột trắng và ruột đỏ tại một số vùng trồng Thanh long chính

ở Bình Thuận, Long An và Tiền Giang năm 2013 và 2014

- Các giống Thanh long được dùng trong lây nhiễm bệnh nhân tạo là cáccây Thanh long khỏe của cả giống ruột trắng và ruột đỏ (Thu thập từBình Thuận)

• Dụng cụ, hóa chất

tủ định ôn, giấy quỳ, cân điện, buồng cấy vi sinh, đĩa petri, ống nghiệm,đĩa petri, dao mổ, que cấy nấm, khay đựng mẫu, bình phun,…

(WA, PDA): Agar, khoai tây, đường glucose, cồn, nước cất, và các hóacần thiết khác

PCR như đệm CTAB, cặp mồi chung ITS4 và ITS5,

nghiệp Việt Nam cung cấp

thuốc bảo vệ thực vật cũng như hiệu lực phòng trừ nấm gây bệnh loéttrên cây Thanh long, chúng tôi sử dụng một số thuốc sau: Alvil 5SC,Vicarben S 70 BTN, Dipcy 750WP

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm điều tra, thu thập mẫu bệnh: Các vùng trồng Thanh long chínhtại Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc của tỉnh Bình Thuận, Long An vàmột số chợ bán Thanh long cũng như vườn Thanh long của một số hộ giađình thuộc một số tỉnh miền Bắc

- Các nghiên cứu trong phòng: Được tiến hành tại phòng thí nghiệm của bộmôn Bệnh cây và Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Khoa Nônghọc, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

- Thí nghiệm lây bệnh nhân tạo: Được tiến hành tại nhà lưới No.3 của bộmôn Bệnh cây, Khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

- Đề tài được thực hiện từ tháng 1 đến tháng hết 6/2014

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Thu thập mẫu bệnh

- Tiến hành thu thập mẫu bệnh loét trên cây Thanh long từ cuối năm

2013 và đầu năm 2014

3.2.2 Trong phòng thí nghiệm

- Phân lập và nuôi cấy trên môi trường PDA

- Quan sát đặc điểm hình thái của nấm gây bệnh loét

- Tìm hiểu đặc điểm sinh học của nấm gây bệnh

- Xác định nấm gây bệnh bằng PCR và giải trình tự vùng ITS của nấm gâybệnh loét

- Khảo sát hiệu lực ức chế nấm gây bệnh bằng nấm đối kháng, một số thuốchóa học và thuốc thảo mộc trên môi trường PDA

3.2.3 Nhà lưới

Lây bệnh nhân tạo lên các cây Thanh long khỏe gồm 2 giống ruột trắng vàruột đỏ và tính tỷ lệ bệnh sau khi lây nhiễm nhân tạo

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp điều tra, thu thập mẫu bệnh

Thu thập ngẫu nhiên mẫu quả có triệu chứng từ các chợ bán Thanh long tại

3.3.3 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng các loại môi trường nhântạo PDA, WA

• Môi trường WA (Water agar)

Thành phần: Nước cất :1000ml

Agar :20 g

• Môi trường PDA - Potato Glucose Agar

Thành phần : Khoai tây: 200 gam

Glucose : 20 gam Agar : 20 gam Nước : 1000mlCách điều chế:

Chọn củ khoai tây sạch bệnh, rửa sạch, gọt sạch vỏ, thái nhỏ kích thước 1 x

2 x 1 cm cho vào nồi chứa 1000ml nước cất đun sôi, sau khi đun sôi được 30 phútthì lọc lấy phần nước, bổ sung thêm nước cho đủ 1000ml Cho từ từ 20g đườngglucose và 20g agar vào dung dịch nước trên Môi trường được cho vào bình tamgiác có đậy nút giấy bạc (bình tam giác đĩa petri đã được rửa sạch và sấy khô ởnhiệt độ 160oC trong 2 giờ) sau đó hấp khử trùng ở 121oC, 1.5 atm trong thời gian

20 - 25 phút, để nguội 55 - 60oC trước khi rót vào đĩa peptri đã được khử trùng

3.3.4 Phương pháp phân lập, nuôi cấy nấm

Mẫu bệnh thu thập từ các vườn Thanh long là những mẫu bệnh điển hình,còn tươi Đem về phòng thí nghiệm phân lập ngay hoặc bảo quản trong điều kiệnkhô mát hoặc bảo quản trong tủ lạnh 4oC nhằm tránh các loại nấm hoại sinh và vikhuẩn phát triển Khử trùng bề mặt mẫu bệnh bằng cồn 70% (C2H5OH) rồi cấytrên môi trường WA Hoặc khử trùng bề mặt mẫu bệnh trong dung dịch NaOCl 1%trong 3 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng (trong 1 phút) rồi cấy mẫubệnh trên môi trường WA quan sát hằng ngày Khi sợi nấm mọc thì cấy truyềnsang môi trường PDA Kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định nấm gây bệnh Toàn

bộ quá trình phân lập được thực hiện trong điều kiện vô trùng và cách ly trongbuồng cấy.

3.3.5 Nghiên cứu đặc điểm hình thái của nấm

Cấy các mẫu nấm trên đĩa môi trường PDA và ủ ở 25oC trong 7 ngày Quansát các đặc điểm của nấm như tản nấm, sợi nấm và bào tử của nấm sau các ngàynuôi cấy

3.3.6 Xác định nấm bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự vùng ITS

Chọn các mẫu nấm nấm đại diện theo vùng và theo giống cây trồng (tổngcộng 6 mẫu) được nuôi cấy trên môi trường PDA từ 3 - 5 ngày ở nhiệt độ phòng 27

- 30oC DNA của nấm được chiết theo phương pháp CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide) của Doyle & Doyle (1987)

Thành phần đệm chiết CTAB (100ml) gồm:

NaCl 2M : 11.68gEDTA 25mM : 5mlTris HCl 100mM pH8 : 10mlCTAB 2% : 2gPVP 2% : 2gPhương pháp chiết DNA bằng phương pháp CTAB (Doyle & Doyle 1987) gồm các bước sau:

Bước 1 : Lấy sợi nấm cho vào ống Eppendorf 1.5 ml Sau đó, nghiền bằng chày

nhựa trong đệm CTAB (thể tích khoảng 700µl) Ủ đệm CTAB + βME (100μl PME+ 10ml CTAB) ở 65oC trong 10 phút

Bước 2 : Cho mẫu bệnh cần chuẩn đoán vào ống 1.5 ml theo tỷ lệ 0.1g/1ml đệm

CTAB + βME

Bước 3 : Cho vào ống 500μl CTAB + βME Nghiền nhỏ mẫu, lắc nhẹ.

Bước 4 : Ủ ống trong điều kiện 60 - 65oC, trong khoảng 5 phút

Bước 5 : Ly tâm trong 10 phút.

Bước 6 : Hút dịch trên tủa V = 700μl, cho sang ống mới.

Bước 7 : Bổ sung một thể tích tương đương Chloroform : isoamyl (24 :1) lắc đều

cho thành 1 dung dịch đồng nhất vào ống mới hút dịch

Bước 8 : Ly tâm trong 10 phút.

Bước 9 : Lấy dịch trên tủa thể tích khoảng 500 - 600μl Bổ sung tiếp một thể tích

tương đương Chloroform : isoamyl (24 :1) Lắc đều, sau đó ly tâm 10 phút

Bước 10 : Lấy dịch trên tủa V = 400 - 500μl cho sang ống mới Bổ sung tiếp một

thể tích tương đương Chloroform : isoamyl (24 :1)

Bước 11 : Lắc đều, để lạnh - 20oC trong 30 phút (tối thiểu)

Bước 12 : Lấy ra ly tâm trong 15 phút , bỏ dịch thu cặn.

Bước 13 : Rửa với cồn 75o (2 lần)

Bước 14 : Để khô trong không khí (box cấy).

Bước 15 : Bổ sung 30 - 50μl TE, búng để DNA tan hết, giữ tube ở điều kiện nhiệt

độ - 20oC

Phản ứng PCR được thực hiện với cặp mồi

ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)

ITS5 (5′GAAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′) cho vùng ITS của rDNA (White

ống 0.5 ml với tổng thể tích phản ứng 15μl, thành phần của mỗi phản ứng PCR:

H2O :8.5μl

Go Taq 2x :10μlITS4 :0,5μlITS5 :0,5μlDNA :0,5μlTổng thể tích: :20μlQuy trình thực hiện phản ứng PCR:

Chuẩn bị bản gel: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100ml TAE0.5x, sau đó lắc nhẹ lọ để hòa tan agarose, sau khi agarose đã tan hoàn toàn đuntrong lò vi sóng 2 - 3 phút, bổ sung Ethidium Bromide theo tỷ lệ cứ 100ml dungdịch gel cho 5μl, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng.

Lấy các ống 0.5ml đã hấp khử trùng, đánh số thứ tự Cho vào mỗi tube 4μlLoading Dye X6, đảo đều và Spin trong 5s Nếu sử dụng cách 2 không cần choLoading Dye

Cắm nguồn điện di, đặt ở hiệu điện thế 100V trong 15 - 20 phút, tắt máyđiện di đặt bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại, quán sát các vệt DNAhiện lên và chụp ảnh

Phản ứng PCR được thực hiện với DreamTaq polymerase của hãngFermentas với nhiệt độ gắn mồi ở 50oC

Sản phẩm PCR được tinh chiết từ gel agarose 1% dùng kít tinh chiết thươngmại theo hướng dẫn của nhà sản xuất Hàm lượng DNA được ước lượng nồng độbằng điện di agarose Sản phẩm PCR được giải trình tự trực tiếp Sử dụng cặp mồiPCR đặc hiệu và gửi đọc tại hãng Macrogen (Hàn Quốc)

3.3.7 So sánh trình tự vùng ITS của các mẫu nấm

Dựa cơ sở dữ liệu Genbank bằng dùng phần mềm trực tuyến BLAST tại NCBI (the National Centerfor Biotechnology Information)

3.3.8 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm

• Ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau đến sự phát triển của nấm

Neoscytalidium dimidiatum.

Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate) Cấy nấm vào giữa hộp petri(đường kính lỗ đục 6mm) trên các nhiệt độ 5oC, 10oC, 15oC, 20oC, 25oC, 30oC,

• Ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến sự phát triển của nấm

3.3.9 Lây bệnh nhân tạo

Thí nghiệm thực hiện trên các cây Thanh long được trồng từ 1 - 2 thángtrong nhà lưới

Giống Thanh long: 2 giống (vỏ đỏ ruột trắng, vỏ đỏ ruột đỏ) Mỗi giống lây

10 - 20 cây

Sử dụng hai phương pháp lây sát thương châm kim (Hildebrand, 1953), lâykhông sát thương bằng cách phun bào tử và trực tiếp từ sợi nấm cấy trên môitrường

Thí nghiệm gồm 5 công thức mỗi công thức 2 phương pháp lây (trong đó có

CT1: Đối chứng.

CT2: Lây bằng sợi nấm

CT3: Lây bằng cách phun bào tử

CT4: Lây bằng cách nhỏ trực tiếp bào tử

Đối với phương pháp lây sát thương, dùng kim châm các chấm nhỏ lênthân sau đó dán nấm được cấy trên môi trường PDA và vết châm hoặc phun bào

tử vào các vết châm, nhỏ bào tử trực tiếp vào vết châm Đối với phương pháplây không sát thương dán sợi nấm hoặc phun, nhỏ trực tiếp bào tử vào thân câykhông có vết thương

Nguồn nấm được lấy từ đĩa nấm đã được cấy thuần trên môi trường sau đósoi trên kính hiển vi mật độ bào tử khoảng 106

Quan sát triệu chứng và nhận xét mức độ nhiễm bệnh trên từng cây ký chủ.Chỉ tiêu theo dõi:

Quan sát triệu chứng biểu hiện trên thân

Nhận xét khả năng gây bệnh của nấm Neoscytalidium dimidiatum trong nhà

lưới so với ngoài đồng ruộng

Tính tỷ lệ bệnh:

Tổng số cây bị bệnhTLB (%) = - x 100

Tổng số cây lâySau khi lây bệnh tiến hành phân lập lại tác nhân từ các triệu chứng theoquy tắc Koch

3.3.10 Thử hiệu lực ức chế nấm bằng nấm đối kháng Trichoderma viride

Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết (Isolate) Cấy nấm vào giữa hộp petri(đường kính lỗ đục 6mm) Sau khi cấy xong đặt ở nhiệt độ 30oC

Thí nghiệm gồm 4 công thức mỗi công thức 3 lần nhắc lại:

CT1 (Đối chứng): Chỉ cấy T viride và chỉ cấy N dimidiatum.

CT2: Cấy T viride trước sau 24 giờ cấy tiếp N dimidiatum vào.

CT3: Cấy N dimidiatum trước sau 24 giờ cấy tiếp T viride vào.

CT4: Cùng cấy T viride và N dimidiatum.

Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm của N dimidiatum và T viride sau

các ngày nuôi cấy Đường kính trung bình (d) mỗi loại nấm được tính theo côngthức: d = (d1 + d2)/2 Trong đó, d1 và d2 là kích thước hai đường chéo của tảnnấm

3.3.12 Thử hiệu lực ức chế nấm bằng thuốc thảo mộc trên môi trường nhân PDA

Sau khi cấy được nấm thuần trên môi trường PDA, sử dụng các nguồn nấmthuần khiết (Isolate) Cấy nấm vào giữa hộp petri đã đổ sẵn môi trường được phathuốc thảo mộc với các nồng độ khác nhau (đường kính lỗ đục 6mm).

Thí nghiệm gồm 5 công thức, 1 công thức đối chứng và 4 nồng độ thuốc

CT1: Đối chứng, cấy trên môi trường PDA

CT2: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.05 CT3: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.1 CT4: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.2 CT5: Cấy N.dimidiatum trên môi trường PDA pha thuốc với nồng độ 0.3.

Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm sau các ngày nuôi cấy Đườngkính trung bình (d) được tính theo công thức: d = (d1 + d2)/2 Trong đó, d1 và d2

là kích thước hai đường chéo của tản nấm

3.3.11 Khảo sát hiệu lực ức chế nấm bằng thuốc hóa học trên môi trường PDA.

Loại thuốc: Một số loại thuốc trừ nấm như: Anvil 5SC, Dipcy 750WP,Vicarben - S 70WP

Hiệu lực ức chế nấm của thuốc được tính theo công thức ABBOTT

C - T

H (%) = - x 100 C

Ghi chú: C : Đường kính tản nấm ở công thức đối chứng

H(%) : Hiệu lực ức chế nấm của thuốc

T : Đường kính tản nấm ở công thức thí nghiệm

Trên ruộng Thanh long, bệnh hại trên thân và quả Trên quả, vết bệnh lúc đầu

là những đốm tròn nhỏ màu trắng, vết lõm thấp hơn so với bề mặt quả, sau 7 - 10ngày những đốm trắng lõm xuống tạo thành mảng, vết bệnh có màu vàng cam và pháttriển nhô lên nếu bị nặng gây thối, quả nhũn Trên thân, có nhiều triệu chứng khácnhau như vết loét to và có nhiều chấm đen trên bề mặt vết bệnh, vết trắng nhỏ lõm vàvết nâu đỏ lồi

Bệnh thích hợp trong điều kiện nhiệt độ 20 - 35oC Bệnh hại thân và quả làmcây sinh trưởng, phát triển kém, giảm năng suất chất lượng quả

Việc thu mẫu bệnh là một bước đầu có ý nghĩa quan trọng để làm cơ sở chocông tác nghiên cứu trong bảo vệ thực vật, từ đó cơ sở xây dựng phương phápphòng trừ hiệu quả giúp tăng năng suất và chất lượng Vì vậy với sự giúp đỡ củaanh Lê Quang Khải chúng tôi đã tiến hành thu thập các mẫu bệnh loét tại các vườnThanh long ở các tỉnh Bình Thuận, Long An Kết quả thu mẫu bệnh tại một sốvườn Thanh long được trình bày ở bảng 4.1.

Qua kết quả thu mẫu được trình bày trên bảng 4.1, chúng tôi có một sốnhận xét như sau:

+ Bệnh loét gây hại phổ biến trên các vườn Thanh long tại một số vùng trồngThanh long như Bình Thuận (Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc) và một số tỉnhkhác như Long An và Tiền Giang Qua theo dõi, tỷ lệ bệnh tại các địa điểm thumẫu khoảng 70 - 80%

Bảng 4.1 Kết quả thu thập mẫu bệnh loét hại Thanh long năm 2014 tại một số

vườn Thanh long phía Nam.

Địa điểm Giống Số mẫu thu Đặc điểm triệu chứng Mức độ

10 - Vết màu nâu (màu gỉ sắt) nhỏ

như kim châm

- Vết màu nâu (màu gỉ sắt)nhỏ, lồi, có quầng vàng xungquanh

- Vết loét loang to, khô, màutrắng xám, trên bề mặt có các

+++

theo đường đồng tâm.

- Vết màu nâu nhỏ, lồi, trên cóchấm tròn nhỏ màu đen

- Vết loét loang to, khô, màutrắng xám, trên bề mặt có cácchấm tròn nhỏ màu đen xếptheo đường đồng tâm

+++

Ruột 10 - Vết loét loang to, khô, màu +++

trắng xám, trên bề mặt có cácchấm tròn nhỏ màu đen xếptheo đường đồng tâm

bề mặt vết bệnh thấy các chấm đen đó là quả cành của nấm gây bệnh, có lỗ mởnhỏ, hình cầu, màu đậm

Hình 4.1(a) Vết loét to, trên bề mặt có

các quả canh màu đen, đậm

Hình 4.1(b) Vết bệnh màu trắng, sauchuyển thành vết nâu nhỏ và lồi