SẢN XUẤT ETHANOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP lên MEN FED BACTH

Sản xuất ethanol từ glucose trong nuôi cấy mẻ và fedbatch đã được nghiên cứu. Trong nuôi cấy fedbatch, glucose bổ sung thêm vào ở giờ thứ 16 của quá trình lên men. Người ta đã nghiên cứu tỉ lệ khác nhau của nồng độ glucose thêm vào sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol trong nuôi cấy fedbatch. Lượng glucose bổ sung vào là 2gL1hr1 tạo ra sản phẩm ethanol cao hơn (2.47g ethanol1g glucose) so với 8gL1hr1 (0.23g ethanol1g glucose) và 4gL1hr1 (0.20g ethanol1g glucose). Sản phẩm ethanol thu được trong nuôi cấy mẻ là 0.81g ethanol1g glucose. Phương pháp nuôi cấy fedbatch với lượng glucose bổ sung vào là 2gL1hr1 được chứng minh là hệ thống lên men tốt hơn nuôi cấy mẻ. Tốc độ phát triển đặc trưng, tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng và tốc độ sản xuất ra ethanol đặc trưng trong phương pháp lên men fedbatch tại tốc độ bổ sung glucose 2gL1hr1 tương ứng là 0.065hr1, 1.20hr1 và 0.0009hr1.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP.HCM

Khoa: Công Nghệ Hoá Học Và Thực Phẩm

MÔN: CÔNG NGHỆ LÊN MEN

ĐỀ TÀI : SẢN XUẤT ETHANOL BẰNG

GVHD: TS Trịnh Khánh Sơn

SVTH :

Nguyễn Thị Diệp 11116013

Văn Thị Diệu 11116014

Nguyễn Thị Tánh 11116056

Lê Thị Thùy 11116063

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

………

MỤC LỤC

Trang

SẢN XUẤT ETHANOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN FED-BATCH

(Lên Men Bổ Sung Cơ Chất )

I. Tóm tắt:

Sản xuất ethanol từ glucose trong nuôi cấy mẻ và fed-batch đã được nghiên cứu Trong nuôi cấy fed-batch, glucose bổ sung thêm vào ở giờ thứ 16 của quá trình lên men Người ta đã nghiên cứu tỉ lệ khác nhau của nồng độ glucose thêm vào sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men ethanol trong nuôi cấy fed-batch Lượng glucose bổ sung vào là 2gL-1hr-1 tạo ra sản phẩm ethanol cao hơn (2.47g ethanol/1g glucose) so với 8gL-1hr-1 (0.23g ethanol/1g glucose) và 4gL-1hr-1 (0.20g ethanol/1g glucose) Sản phẩm ethanol thu được trong nuôi cấy mẻ là 0.81g ethanol/1g glucose Phương pháp nuôi cấy fed-batch với lượng glucose bổ sung vào là 2gL-1hr-1 được chứng minh là hệ thống lên men tốt hơn nuôi cấy mẻ Tốc độ phát triển đặc trưng, tốc độ tiêu thụ glucose đặc trưng và tốc độ sản xuất ra ethanol đặc trưng trong phương pháp lên men fed-batch tại tốc độ bổ sung glucose 2gL-1hr-1 tương ứng là 0.065hr-1, 1.20hr-1 và 0.0009hr-1

II. Giới thiệu:

Do nhiên liệu dự trữ trên thế giới đang giảm nhanh chóng và giá cả ngày một tăng lên, một nguồn hydrocacbon phải được tìm thấy để đáp ứng nhu cầu cần thiết cho ngành hóa học và năng lượng (Sitton và Gaddy,1980, Lee và các cộng sự,1983) Trong bối cảnh này, phương pháp lên men ethanol có thể thay thế vì nó có thể sản xuất từ các nguồn nguyên liệu đa dạng Tầm quan trọng của ethanol tăng lên do làm nguồn năng lượng thay thế cho hóa học và nhiên liệu lỏng Rất nhiều nghiên cứu thú vị về lên men ethanol đã được tìm kiếm 2 thập kỷ trước (Vega và các cộng sự, 1987; Converti và các cộng sự, 1985) Nhiều quá trình lên men ethanol khác nhau đã được đề xuất gồm lên men mẻ, lên men liên tục, lên men liên tục với tế bào tái tạo, nuôi cấy fed-batch và repeated-batch (Yoshida và các cộng sự, 1973) Nuôi cấy fed-batch với sự bổ sung liên tục glucose và không loại bỏ dịch lên men là một trong những phương pháp phổ biến

nhất trong sản xuất ethanol trong công nghiệp Một lợi ích của quá trình này là giảm

sự ức chế cơ chất Nồng độ glucose cao trong môi trường lên men sẽ ức chế sự phát triển của vi sinh vật và sản xuất ra ethanol Một lợi ích khác của quá trình này là cho năng xuất cao hơn, sự hòa tan oxi vào môi trường cao hơn, giảm thời gian lên men và giảm sự ảnh hưởng của chất độc trong thành phần môi trường (Stanbury và Whitaker.1984)

Sản xuất ethanol bằng phương pháp lên men fed-batch và sử dụng men bánh mì

Nấm men bánh mì một loại thuộc chủng S.cerevisiae, được sử dụng rất nhiều trong sản

xuất protein đơn bào (SCP cho người và động vật) và ethanol từ lên men glucose vì trạng thái của nó được coi là an toàn (Solomon và các cộng sự, 1997) Chủng nấm men này có thể sản xuất ethanol nồng độ cao và nó thích hợp nhất cho phương pháp lên men ethanol (Yan vá các cộng sự, 2006) Do đó, mục đích của bài nghiên cứu này là: (a) xác định thời gian thêm môi trường trong công nghệ lên men fed-batch, (b) nghiên

cứu lượng glucose tối thích bổ sung vào để sản xuất ethanol bằng S.cerevisiae trong

lên men fed-batch, sử dụng glucose như một nguồn cacbon, (c) nghiên cứu thông số động lực học của hệ thống gồm tốc độ sinh trưởng đặc trưng, tốc độ hấp thu glucose đặc trưng, tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng và sản xuất sản phẩm ethanol

III. Nguyên liệu và phương pháp:

1. Micro-organism :

S.cerevisiae (nấm men bánh mì, Mauri-pan) được sử dụng trong suốt ngiên cứu

này, được duy trì ở 40C trong môi trường agar nghiêng Thành phần của môi trường agar gồm: 5 gL-1 nấm men, 5 gL-1 dịch chiết malt, 5 gL-1 peptone, 20 gL-1 glucose và

20 gL-1 agar Môi trường được giữ bằng sub-culturing trong 20 ngày và được ủ ở 300C trong 24 giờ

2. Môi trường lên men:

Một lít môi trường được chuẩn bị theo nhu cầu của S.cerevisiae , chứa 50.0 gL-1 glucose, 1 gL-1 nấm men, 5 gL-1 KH2PO4, 2 gL-1 (NH4)2SO4 và 0.4 gL-1 MgSO47H2O Môi trường được làm lạnh và tại pH =5

3. Điều kiện lên men :

i) Nuôi cấy mẻ:

Quá trình lên men được thực hiện trong một cái bình khuấy lên men 2 lít với thể tích được lên men là 1.5 lít Trong bình chứa 900ml môi trường lên men và 100ml sinh khối vi sinh vật và được điều chỉnh ở pH =5.0 Lên men được thực hiện ở tốc độ khuấy trộn là 250 rpm và ở nhiệt độ là 30oC với tốc độ lưu lượng không khí là 1vvm Mẫu được đo 2 giờ một lần và quá trình lên men kết thúc sau 42 giờ

ii) Nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất ( Fed Batch Culture )

Cơ chất được cung cấp liên tục vào lò phản ứng sinh học bằng một máy bơm nhu động với tốc độ bổ sung glucose là 2 gL-1hr-1, 4 gL-1hr-1 và 8 gL-1hr-1 Tốc độ cánh quạt

là 250 rpm và 30oC với tốc độ lưu lượng không khí là 1vvm ở tất cả các lần thực hiện

4. Các kỹ thuật phân tích :

Dung dịch lên men được lấy khỏi bình lên men và được phân tích tại 1 thời gian xác định Sự tăng trưởng của nấm men được đánh giá bằng phép đo quang phổ tại bước sóng là 260 nm bằng máy quang phổ kế

Nồng độ glucose được xác định bằng phương pháp sử dụng acid 3,5 dinitrosalicylic (DNS), (Miller, 1959) Trong khi đó, nồng độ ethanol trong môi trường được xác định bằng phương pháp sắc ký với khí mang là Nitơ và sử dụng polyethylence glycol làm cột Phương pháp xác định ngọn lửa ion hóa với các điều kiện sau: nhiệt độ bơm là 250oC, nhiệt độ ban đầu của lò là 45 oC, nhiệt độ kết thúc của

lò là 3500C, tốc độ khí mang là 4 Ml min -1 và thể tích bơm là 1ML (Agilent Technologies, 2000)

5. Các thông số động lực học:

Sản lượng ethanol được tính bằng lượng glucose tiêu thụ và lượng glucose tạo ra sinh khối Các thông số động học tăng trưởng đặc trưng như: tốc độ hấp thụ cơ chất đặc trưng, tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng được xác định bằng phương pháp mô phỏng dựa trên chương trình MATLAB Tập hợp hệ thống phương trình được rút ra từ cân bằng vật chất tế bào, đường, ethanol cho lên men Fed batch

Trong đó X,S,P lần lượt biểu thị cho nồng độ tế bào, glucose, ethanol V là thể tích nuôi cấy, So là nồng độ đường và F là tốc độ cơ chất cho vào môi trường trong nồi lên men μ, ν và Q lần lượt là tốc độ tăng trưởng cụ thể, lượng glucose tiêu thụ, tốc độ tạo thành sản phẩm

IV. Kết quả và bàn luận:

1. Lên men mẻ:

Để tiến hành các đợt lên men mẻ có bổ sung cơ chất, người ta tiến hành thực hiện lên men mẻ để nghiên cứu xu hướng tăng trưởng của tế bào, tiêu thụ glucose và hình thành ethanol Thời gian bổ sung cơ chất cho quá trình lên men mẻ có bổ sung cơ chất

đã được xác định từ kết quả của quá trình lên men mẻ Dựa trên dữ liệu trình bày trong hình 1, một pha tăng trưởng ( growth phase ) điển hình được quan sát có thể bao gồm

các pha sau: lag phase ( 0 – 6 giờ ), pha tăng trưởng theo cấp số nhân ( exponential growth phase ) ( 6 -30 giờ ), pha giảm tốc ( deceleration phase ) ( 30 -34 giờ ) và pha

ổn định (stationary phase ) (34-42 giờ )

Trong 6 giờ đầu tiên của quá trình lên men, các loại nấm men thích nghi với điều kiện thì tự phát triển Trong suốt exponential phase, khoảng thời gian của giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân bị hạn chế do một số nguồn cơ chất giới hạn bị cạn kiệt Sau 34 giờ lên men tốc độ tăng trưởng chậm lại vì sự cạn kiệt glucose trong môi trường

Dựa trên hình 1, nồng độ glucose được duy trì gần như liên tục trong 6 giờ đầu tiên Nồng độ glucose sau đó giảm như dự kiến trong suốt quá trình lên men, trùng hợp với sự gia tăng sản xuất tế bào và ethanol Điều này là do các tế bào tiêu thụ glucose

để phát triển và sản xuất ethanol Sự bổ sung cơ chất được bắt đầu khi nấm men tiêu thụ hầu hết các cơ chất và phát triển trong exponential phase Có thể quan sát thấy rằng glucose trong hệ thống đã cạn kiệt sau 34 giờ

Nồng độ ethanol được tìm thấy thì tăng lên nhanh chóng trong suốt 20 giờ đầu tiên của quá trình lên men Nồng độ ethanol bắt đầu giảm sau khi đạt được nồng độ tối

đa là 18 gL-1 trong 22 giờ lên men Ethanol có thể đã được sử dụng như một nguồn carbon cho sự phát triển của các tế bào nấm men sau giờ thứ 22, khi nồng độ glucose bắt đầu cạn kiệt (Bauchop và Elsden, 1960; Coppella và Dhurjati, 1989) Bằng cách so sánh các tế bào và nồng độ ethanol, nó có thể được phân loại như một sản phẩm tăng trưởng liên quan trong đó sản phẩm được sản xuất đông thời với sư phát triển tế bào Hình 1, cho thấy từ quá trình lên men mẻ, người ta xác định thời gian bổ sung cơ chất tối thích trong quá trình lên men mẻ bổ sung cơ chất là từ giữa giờ thứ 14 – 18

Do đó, cơ chất đươc quyết định cho vào bắt đầu tại giờ thứ 16 của chu trình lên men cho tất cả các hệ thống

2. Lên men Fed batch:

i) So sánh nồng độ tế bào:

Hình 2, cho thấy nồng độ tế bào nói chung được giữ gần như liên tục trong khoảng 5 giờ đầu tiên và sau đó nó tăng dần trong suốt quá trình lên men Nhìn chung, pha ổn định không được quan sát thấy trong nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất ở tất cả các tốc độ cung cấp glucose khác nhau.Tương đương, tốc độ bổ sung glucose 2 gL-1hr

-1 thì cho một nồng độ tế bào tốt hơn so với 4 gL-1hr-1 và 8 gL-1hr-1 Điều này có thể do tốc độ bổ sung glucose 2 gL-1hr-1 này đã cung cấp một môi trường phát triển tốt hơn cho nấm men, vì thế các tế bào nấm men có thể phân chia nhanh chóng hơn

Nó cũng có thể là do nồng độ glucose cao góp phần ảnh hưởng đến thẩm thấu, dẫn đến sự phát triển chậm hơn của các tế bào nấm men (Thomas cùng các cộng sự, 1992.) Nồng độ cơ chất cao đã ảnh hưởng đến độ pH, độ nhớt và các hoạt động của môi trường Thời gian tiếp xúc dài dẫn đến nồng độ cơ chất cao có thể gây ra áp suất

dị hóa

Các thay đổi của môi trường bằng cách nào đó đã ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của tế bào, do đó mà khả năng tồn tại tế bào giảm khi nồng độ glucose tăng lên trong quá trình lên men ethanol Xu hướng này phù hợp với các báo cáo của Thomas và Ingledew (năm 1992)

ii) So sánh nồng độ glucose:

Nồng độ của glucose trong nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất được nghiên cứu tại

ba tốc độ bổ sung cơ chất và được biểu diễn tại Fig.3

Tại tốc độ bổ sung glucose là 8gL-1hr-1 thì người ta nhận thấy nồng độ glucose trong môi trường tăng theo cấp số nhân trong suốt quá trình lên men (tăng nhanh nhất bắt đầu từ giờ thứ 17 của quá trình lên men ) Điều này cũng chỉ ra rằng tốc độ bổ sung glucose cao hơn rất nhiều so với tốc độ tiêu thụ glucose của nấm men và lượng glucose dư thừa tạo thành chất tích lũy trong hệ thống

Fig.3 cũng chỉ ra tại tốc độ bổ sung glucose 4gL-1hr-1 nồng độ glucose nói chung cao hơn so với nồng độ glucose tại tốc độ bổ sung glucose là 2gL-1hr-1, nhưng thấp hơn

so với nồng độ glucose tại tốc độ bổ sung glucose là 8gL-1hr-1 Tại tốc độ bổ sung

glucose là 2gL-1hr-1, nồng độ glucose tăng một lượng nhỏ và duy trì với lượng hầu như không đổi là 10gL-1 sau 28 giờ lên men Nguyên nhân dẫn đến điều này là do lượng glucose bổ sung cho hệ thống được tiêu thụ một cách hoàn toàn bởi nấm men Có thể nhận ra tại tốc độ bổ sung glucose là 2gL-1hr-1 thì sự tiêu thụ glucose là tốt nhất

iii) So sánh nồng độ ethanol:

Từ Fig.4 có thể rút ra một cách tổng quát nồng độ ethanol như sau: Trong nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất, tại tốc độ bổ sung glucose là 2gL-1hr-1 thì nồng độ ethanol thu được cao hơn so với tại tốc độ bổ sung glucose là 4gL-1hr-1 và 8gL-1hr-1 Tại tốc độ

bổ sung glucose là 2gL-1hr-1, nồng độ ethanol tạo ra với lượng cao nhất lên đến 17gL-1 Nồng độ ethanol tạo ra khá ổn định,nó được duy trì hầu như không đổi trong suốt 14 giờ (bắt đầu từ giờ thứ 18) trước khi bắt đầu giảm ở giờ lên men thứ 32 Nguyên nhân dẫn đến nồng độ ethanol giảm là do quá trình oxi hóa ethanol tạo thành acid acetic và một số hợp chất khác (Mian et al., 1973)

Ở tại cả hai tốc độ bổ sung glucose là 4gL-1hr-1 và 8gL-1hr-1 thì đường biểu diễn nồng độ ethanol tạo ra biến động tương tự nhau nhưng ở tốc độ 4gL-1hr-1 thì lượng ethanol sinh ra cao hơn so với tại tốc độ bổ sung glucose là 8gL-1hr-1 Với tốc độ bổ sung glucose là 8gL-1hr-1 thì lượng ethanol sinh ra được cho là thấp nhất Nguyên nhân

có thể là do quá trình dị hóa và sự dư thừa glucose trong quá trình trao đổi chất Khi nồng độ glucose vượt quá giá trị giới hạn thì đây có thể là nguyên nhân dẫn đến hàm lượng ethanol giảm

iv) Nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất tại tốc độ bổ sung glucose là 2gL -1 hr -1 :

Nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất tại tốc độ bổ sung glucose là 2gL-1hr-1 được xác định là tạo ra ethanol với lượng cao nhất Theo khuynh hướng sinh trưởng của nấm men, sự tạo thành ethanol và sự tiêu thụ glucose được biểu diễn ở Fig.5

Mặc dù lượng glucose vẫn được bổ sung liên tục vào hệ thống, tuy nhiên nồng độ ethanol giảm tại giờ thứ 32 của quá trình lên men Lượng ethanol đạt được mức cao nhất là 17gL-1

Số lượng tế bào nấm men tăng theo hàm số mũ sau 6 giờ lên men và kéo dài mãi cho đến khi kết thúc quá trình lên men và không có pha ổn định Những kết quả này có được là nhờ vào sự bổ sung liên tục glucose vào môi trường Nồng độ glucose được duy trì với lượng hầu như không đổi bắt đầu từ giờ thứ 28 của quá trình lên men Lượng glucose thêm vào vừa đủ sẽ tạo ra một môi trường tối thích cho sự sinh trưởng của nấm men

So với nuôi cấy mẻ (Fig.1) thì lượng ethanol sinh ra trong nuôi cấy mẻ có bổ sung

cơ chất ổn định hơn trong một thời gian kéo dài Trong nuôi cấy mẻ thì ethanol chỉ được tạo ra với lượng nhiều nhất tại một thời điểm nhất định và nó không duy trì được năng suất này vì sự cạn kiệt của glucose trong môi trường theo thời gian

V. Các thông số động học:

Tốc độ tăng trưởng đặc trưng, tốc độ tiêu thụ glucose, tốc độ sản xuất và hệ số năng suất thường được áp dụng để đánh giá hoạt động của vi sinh vật Tốc độ tăng trưởng đặc trưng của tế bào, tốc độ hấp thu đường đặc trưng, tốc độ sản xuất ethanol đặc trưng, tốc độ bổ sung cơ chất tại 3 nồng độ glucose khác nhau, được xác định bằng cách sử dụng phương pháp mô hình Chương trình MATLAB thường được sử dụng để giải quyết 3 phương trình cân bằng vật chất khác nhau của tế bào, glucose và ethanol với các dữ liệu thu được từ các thí nghiệm Bảng 1 cho thấy tất cả các thông số động lực học đối với cả 2 quá trình lên men mẻ và lên men có bổ sung cơ chất Thể tích môi trường lên men thay đổi tương đối nhỏ và nó được cho là không đáng kể trong hệ thống này

Bảng 1 cũng cho thấy rằng tốc độ bổ sung cơ chất của một nồng độ glucose thấp hơn thì sẽ cho ra lượng sản phẩm cao hơn Nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất tại tốc độ

bổ sung nồng độ glucose là 2 gL-1hr-1 thì cho sản lượng cao nhất Tuy nhiên lượng sản phẩm tại tốc độ bổ sung glucose 4gL-1hr-1 và 8gL-1hr-1 thì thấp hơn nhiều so với lên

men mẻ Điều đó có vẻ như là phần nhỏ Cacbon để tổng hợp ethanol được bão hòa khi nồng độ glucose cao hơn Điều này chỉ ra rằng tốc độ bổ sung nồng độ

glucose cao hơn thì sẽ không làm tăng sản lượng ethanol Đó là do sự ức chế cơ chất tại một nồng độ glucose cao hơn trong hệ thống Lượng sản phẩm cao nhất trong quá trình lên men đạt được trong khoảng từ giờ thứ 18 đến giờ thứ 22

Sự suy giảm trong tốc độ tăng trưởng đặc trưng đã ức chế sự tăng trưởng của tế bào bằng cách tăng nồng độ glucose bổ sung Sự suy giảm trong tốc độ tăng trưởng đặc trưng cho thấy rằng tốc độ sinh tổng hợp thì thấp hơn tại nồng độ glucose cao khi

hệ số duy trì tăng Như vậy có thể kết luận rằng quá trình nuôi cấy mẻ có bổ sung cơ chất thì phù hợp nhất tại tốc độ có bổ sung nồng độ glucose là 2gL-1hr-1 đối với bài nghiên cứu này