Tổng quan về sản xuất Butanol bằng phương pháp lên men tĩnh

Kể từ đó, những nỗ lực nghiên cứu đáng kể về quá trình lên men ABE sản xuất butanol đã được thực hiện trong nhiều lĩnh vực, cụ thể là trong ngành công nghệ vi sinh vật, tạo ra các chủng

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

Do sự gia tăng liên tục giá thành của dầu thô-nguồn năng lượng chính trên thế giới hiện nay, rất nhiều đề tài nghiên cứu gần đây quan tâm đến việc phát triển các nguồn nhiên liệu mới có giá trị về mặt kinh tế và môi trường Có thể nói nhiên liệu sinh học là một nguồn nhiên liệu đầy tiềm năng hứa hẹn thay thế cho nguồn xăng dầu sắp cạn kiệt trong tương lai, đặc biệt là những nhiên liệu được sản xuất thông qua quá trình lên men từ các nguồn nguyên liệu tái tạo, điển hình là butanol Hiện nay butanol thương mại được sản xuất chủ yếu từ con đường hóa dầu nhưng kết quả nghiên cứu cho thấy quá trình lên men từ vi sinh vật để thu nhận butanol có rất nhiều triển vọng Quá trình lên men sản xuất butanol hay còn gọi là quá trình lên men Ethanol-Butanol-Acetone (ABE) được thực hiện

bởi giống vi khuẩn Clostridium, đặc biệt là loài Acetobutylicum (Lin và Blaschek, 1983)

Loài vi sinh vật này được xem là lâu đời nhất trong nghành công nghiệp lên men kỵ khí bắt buộc Nó được xếp ở vị trí thứ hai chỉ sau lên men ethanol từ nấm men Saccharomyces cerevisiae ở quy mô sản xuất Quá trình lên men ABE được thực hiện rộng rãi trong công nghiệp đến nửa đầu thế kỷ 20 với 66% sản lượng tiêu thụ trên toàn thế giới của butanol được sản xuất từ phương pháp sinh học (Dürre, 2008) Tuy nhiên, với sự ra đời của Thế chiến thứ hai và sự phát triển leo thang của ngành công nghiệp hóa dầu, sản xuất butanol từ phương pháp sinh học nhanh chóng giảm dần Đến năm 1960, hiệu quả thấp của quá trình lên men ABE so ngành công nghiệp hóa dầu cùng với các chi phí cao hơn khi sử dụng các nguồn carbohydrate làm cơ chất dẫn tới kết quả là việc đã xoá bỏ hoàn toàn các hoạt động công nghiệp từ quá trình lên men này Tuy nhiên, khi giá dầu bắt đầu tăng từ đầu những năm 1970 do "cuộc khủng hoảng dầu thô" cùng với sự suy giảm dần về nguồn dầu và hơn nữa là sự thúc đẩy xã hội trên toàn thế giới nhận thức về các vấn đề môi trường đang trong tình trạng cấp cứu, đã làm cho con người quan tâm đến ngành công nghiệp sinh học (Dürre, năm 1998; Dürre, 2008) Kể từ đó, những nỗ lực nghiên cứu đáng kể về quá trình lên men ABE sản xuất butanol đã được thực hiện trong nhiều lĩnh vực, cụ thể là trong ngành công nghệ vi sinh vật, tạo ra các chủng đột biến mới nhằm nâng cao sản lượng dung môi, nghiên cứu thay đổi các điều kiện lên men nhằm cải thiện năng suất thấp và nồng độ butanol trong dịch lên men

Giống như trong mọi quá trình sinh học khác, quá trình lên men ABE thể hiện một số hạn chế về kinh tế và khả năng cạnh tranh so với các quá trình sản xuất bằng phương pháp hóa học tinh khiết Những bất lợi chính trong trường hợp này liên quan đến con đường trao đổi chất khá phức tạp bởi các vi khuẩn sản xuất butanol

Trong một chu trình lên men ABE tiêu biểu từ nguồn carbohydrate: axit butyric,

propionic và acetic trước hết được sinh tổng hợp bởi C acetobutylicum (acidogenesis)

trong giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân của tế bào Khi vi sinh vật bước vào giai

đoạn ổn định sẽ bắt đầu giai đoạn tạo thành acetone, butanol và ethanol theo tỷ lệ 3:6:1 tương ứng (solventogenesis) (Fond et al, 1985.) Quá trìnhchuyển pha từ acidogenesis sang solventogenesis được điều khiển bằng cách thay đổi hoặc làm giảm pH (<5) ở cuối giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân hoặc tăng nồng độ acid butyric (> 2 gl-1) (Gottschalk và Morris, 1981; Gottwald và Gottschalk, 1985; Monot etal., 1984) Tuy nhiên, quá trình lên men trong thực tế khá phức tạp cần phải kiểm soát chặt chẽ các điều kiện lên men để đạt hiệu quả cao (Chauvatcharin et al., 1998).

Trong quá trình lên men ABE truyền thống, mật độ tế bào vi sinh vật thấp trong môi trường lên men làm hiệu suất sinh tổng hợp butanol từ glucose nói chung là khá thấp thường khoảng 15% (w / w) và hiếm khi vượt quá 25% (w / w) Ngoài ra, việc sinh tổng hợp butanol còn bị giới hạn bởi nhiều yếu tố ức chế khác, trong đó butanol là yếu tố chính gây ức chế ngược lên sự tăng trưởng của tế bào làm ngừng quá trình lên men Trong thực tế, vi khuẩn khó có thể duy trì hoạt tính khi nồng độ butanol trong dịch lên men xấp xỉ 10 gl-1 Kết quả là nồng độ butanol trong dịch lên men ABE thường xấp xỉ 13

gl-1 Do đó, việc sản xuất butanol từ quá trình lên men ABE truyền thống cho hiệu quả kinh tế rất thấp (Maddox, 1989)

Nội dung bài viết này sẽ giới thiệu chung về butanol cũng như các ứng dụng của nó trong thực tiễn Dựa trên các nghiên cứu gần đây về quá trình lên men tĩnh sản xuất butanol sẽ trình bày một số chủng Clostridium đã được phân lập có khả năng sinh tổng hợp và chịu được nồng độ butanol cao Giới thiệu các nguồn cơ chất khác nhau mà vi sinh vật có thể sử dụng để lên men cũng như các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo butanol, qua đó có thể so sánh hiệu suất sinh tổng hợp butanol Trình bày một số kết quả nghiên cứu đạt được khi lên men sử dụng tế bào vi khuẩn cố định trên một số chất mang Các phương pháp tách chiết butanol từ dịch sau lên men cũng sẽ được giới thiệu trong bài viết này

CHƯƠNG 2: BUTANOL

2.1 Giới thiệu chung

Butanol (danh pháp IUPAC, 1-butanol; CAS no.71-36-3) còn được gọi là rượu butylic, n-butanol hoặc methylolpropane, là một rượu gồm 4 cacbon có công thức phân tử

C4H9OH (KLPT = 74,12 g.mol-1) Butanol là một chất lỏng không màu, dễ cháy, kỵ lỏng,

có mùi thơm như chuối hương và có mùi cồn mạnh Khi tiếp xúc trực tiếp nó có thể gây kích ứng mắt và da.Hơi của nó có tác dụng kích thích vào niêm mạcmàng và có khả năng gây mê khi hít phải ở nồng độ cao.Butanol hầu như hòa tan hoàn toànvới các dung môi hữu cơ phổ biến, nhưng lại ít hòa tan trong nước (Lee và cộng sự, 2008a)

Hình 1: Cấu trúc không gian của butanol

Bảng 1: Tính chất vật lý của n- butanol

2.2 Ứng dụng của butanol trong thực tiễn

Một trong những ứng dụng ưu việt lớn của biobutanol (butanol sinh học) là được sử dụng để pha trộn vào xăng dầu làm nhiên liệu chính cho các động cơ Trong khi ethanol

đã nhận được rất nhiều sự quan tâm như là một nguồn nhiên liệu hỗ trợ bởi nhiều lý do (Hansen et al., 2005 và Niven, 2005) thì butanol lại cho thấy nó có thể là một lựa chọn tốt hơnso với ethanol vì có các tính chất hóa học và vật lý phù hợp

Bảng 2: Bảng so sánh tính chất của butanol với xăng và ethanol

Khả năng tan trong 100g

Nhiệt dung riêng

- Dựa vào áp suất hơi có thể thấy butanol sử dụng an toàn hơn so với ethanol do butanol ít bay hơi hơn ethanol và xăng

- Butanol ít gây ăn mòn hơn so với ethanol, không ảnh hưởngđến các thiết bị chứa đựng như bể chứa, đường ống, máy bơm… khi sử dụng lâu dài

- Khả năng hòa tan thấp trong nước của butanol cho phép nó có thể được pha trong xăng dầu ở nồng độ cao hơn bất kì loại nhiên liệu sinh học nào mà không

sợ bị tách pha làm xuất hiện nước, trong khi ethanol chỉ có thể được pha thêm vào xăng khoảng 25% vàchỉ được giữ trong một thời gian ngắn để sử dụng Áp suất hơi của butanol (4 mmHg ở 20°C) là thấp hơn so với ethanol 11 lần (45 mmHg ở 20°C) cho phép nó có thể pha trực tiếp vào xăng mà không cần quan tâm đến sự bay hơi

- Trong quá trình đốt cháy, butanol không thải ra bất kì hợp chất khí nào chứa sulphur và các oxit nitơ, đây là một ưu điểm vượt trội về môi trường so với các nguồn nhiên liệu khác

Với những ưu điểm trên cùng với một nguồn cơ chất phong phú có thể được sử dụng trong quá trình lên men ABE, biobutanol sẽ là một tiềm năng lớn trong việc thay thế nguồn nhiên liệu xăng dầu đang cạn kiệt và góp phần làm giảm hiệu ứng nhà kính.

Bên cạnh vai trò là nhiên liệu sinh học cho động cơ, butanol thực sự là một hóa chất quan trọng được sử dụng với lượng lớn trong các ngành công nghiệp Gần một nửa sản lượng butanol được sản xuất trên toàn thế giới được sử dụng làm dung môi ở dạng butyl acrylate và este methacrylate trong sản xuất các loại sơn nhưenamel,nitrocellulose; keo dán, chất đàn hồi, công nghệ dệt may, sản xuất sợi, nhựa, sản xuất kính an toàn, chất tẩy rửa Các hợp chất quan trọng có nguồn gốc từ butanol như butyl ete glycol, butylacetate,amin butyl,nhựa amin và chất dẻo

Nó cũng được sử dụng làm dung môi trong ngành công nghiệp mỹ phẩm như nước hoa, các sản phẩm trang điểm cho mắt, sơn móng tay…và được dùng cho việc sản xuất các loại thuốc kháng sinh, vitamin và hormone

CHƯƠNG 3: VI SINH VẬT TRONG LÊN MEN SẢN XUẤT

BUTANOL – CLOSTRIDIUM

3.1 Đặc điểm hình thái

Clostridium là một giống trực khuẩn Gram dương, thuộc ngành Firmicutes Đây là

những vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, có khả năng sinh nha bào khi môi trường sống bất lợi

Đại diện tiêu biểu đó là loài Clostridium acetobutylicum có dạng hình que thẳng, kích thước khác nhau từ 0,5-1,5 × 1,5-6 μm (Robinson, 2000) Clostridium acetobutylicum là

vi khuẩn Gram dương khi đang phát triển trong giai đoạn logarite trong canh trường,và chuyển thành Gram âm khi bước sang giai đoạn ổn định và sinh bào tử, lên men dị dưỡng, di động bằng roi Trong quá trình hình thành bào tử, tế bào phình lên rõ rệt và tích trữ các hạt, một polysaccharide cung cấp nguồn carbon và năng lượng trong giai đoạn solventogenesis Bào tử được hình thành có dạng bầu dục Các vi sinh vật thuộc giống

Clostridium lên men thường được xếp thành bốn nhóm khác nhau dựa trên đặc tính sinh

hóa và di truyền của chúng (Woods, 1995) bao gồm: Clostridium acetobutylicum,

C.beijerinckii,C.saccharobutylicum, và C saccharoperbutylacetonicum Hai loài được

biết đến với nhiều ưu điểm vượt trội là C acetobutylicum và C beijerinckii (trước đây gọi là C butylicum) và hầu hết các tài liệu nghiên cứu về lên men ABE đều dựa trên hai

loài này

Hình 2: Hình ảnh của C.acetobutylicum và C.beijerinckii trên kính hiển vi điện tử (SEM)

3.2 Đặc điểm sinh lý của vi khuẩn Clostridium

3.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng

- Nguồn Carbon :

Quá trình tổng hợp acetone, butanol, and ethanol từ các loài thuộc giống Clostridium

đều bắt nguồn từ cơ chất là carbohydrate Nhóm vi sinh vật này có khả năng sử dụng nguồn dinh dưỡng rất đa dạng, có thể sử dụng gần như hoàn toàn các loại đường như glucose, fructose, mannose, sucrose, lactose và sử dụng một phần các đường xylose,

galactose, arabinose, raffinose… Nhiều nghiên cứu cho thấy glucose vẫn là loại đường

tốt nhất cho Clostridium sử dụng.

- Nguồn Nitơ :

Nitơ là thành phần quan trọng của protein và enzyme, có thể được cung cấp vào môi trường nhân giống và lên men cho vi sinh vật sử dụng dưới dạng các muối NH4+ và NO3- hay các hợp chất hữu cơ phức tạp từ chất chiết nấm men, sản phẩm thủy phân từ đậu nành… Việc bổ sung nitơ là cần thiết cho việc tạo sinh khối vi sinh vật, tuy nhiên nếu bổ sung quá nhiều có thể làm ức chế việc sinh tổng hợp sản phẩm

- Khoáng :

Sự phát triển tế bào của vi khuẩn phụ thuộc vào các muối khoáng trong môi trường như Mg2+, Fe2+, Mn2+ và K+ Chúng được cung cấp dưới dạng các muối như MgSO4, MnSO4, FeSO4, KCl, KH2PO4 và K2HPO4;…Nếu nồng độ của Mg2+ và Mn2+ trong môi trường quá cao sẽ gây ức chế đến sự sinh trưởng của tế bào

- Yếu tố sinh trưởng :

Cũng giống như các loài vi khuẩn khác, quá trình sinh trưởng và phát triển của

Clostridium đòi hỏi cung cấp một số yếu tố sinh trưởng như biotin, thiamine

hydrochloride, p-aminobenzoic, resazurin… Các yếu tố này hiện diện trong môi trường ở

nồng độ tương đối thấp từ 0.1-1 mg/L, nhưng ảnh hưởng nhiều đến hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn trong quá trình lên men

Các loại môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy và nhân giống vi khuẩn

Clostridium:

- Môi trường P2: là môi trường tối ưu cho tất cả các loài của Clostidium phát

triển, được sử dụng làm môi trường giữ giống và lên men với các nồng độ glucose khác nhau

- Môi trường Tryptone-yeast extract-sucrose(TYS):

- Môi trường CAB: là môi trường được sử dụng làm môi trường giữ giống và

lên men tối ưu cho loài Clostridium acetobutylicum

3.2.2 Điều kiện nuôi

Nhiệt độ hoạt động của Clostridium nằm trong khoảng từ 29-37oC, tùy thuộc vào

từng loài mà có nhiệt độ tối thích khác nhau.Clostridium acetobutylicum có nhiệt độ tối

thích nằm trong khoảng 35-37 oC, trong khi đó đối với loài Clostridium beijerinckii lại là

31-32 oC và Clostridium saccharobutylicum là 30 oC Đa số các quá trình nhân giống và

lên men sử dụng vi khuẩn Clostridium acetobutylicum đều được duy trì ở 35 oC

pH là yếu tố quan trọng ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng và tạo sản phẩm

của Clostridium Khoảng pH tối thích của các loài thuộc giống Clostridium nằm trong

khoảng từ 5.0-6.5, bất kì một sự thay đổi nào làm giảm pH dưới 4.5 đều có khả năng gây

ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Đa số các môi trường ban đầu đều được chỉnh về pH=6.5, tuy nhiên cùng với quá trình sinh trưởng thì vi khuẩn lại sinh ra các hợp chất

như axit butyric, propionic và acetic làm giảm pH môi trường Vì vậy, cần kiểm soát và điều chỉnh pH trong suốt quá trình sinh trưởng của vi khuẩn.

3.3 Các loài vi sinh vật được dùng trong sản xuất butanol

Như đã giới thiệu ở trên, các loài có khả năng sinh tổng hợp butanol bao gồm bốn

loài chính là: Clostridium acetobutylicum, C beijerinckii, C saccharobutylicum và

Clostridium saccharoperbutylacetonicum.

Clostridium acetobutylicum là loài có đặc tính di truyền khác biệt nhất và ít liên quan

đến ba loài còn lại Những chủng thuộc loài này phát triển tốt trên các môi trường cơ chất

từ dịch thủy phân tinh bột nên được sử dụng phổ biến ở quy mô công nghiệp để sản xuất

dung môi Clostridium acetobutylicum là loài được nghiên cứu trong sản xuất dung môi

nhiều nhất, nhiều chủng được phát triển từ loài này cho khả năng tổng hợp butanol khá

cao Cho đến nay, một trong số những kết quả lên men tốt nhất là từ chủng C

acetobutylicum PCSIR-10 có khả năng kháng butanol, sử dụng cơ chất là rỉ đường mía

được thực hiện bởi Syed (1994) Theo đó, tổng nồng độ dung môi đạt được là 19.2 g/L với hiệu suất là 34%

Loài Clostridium beijerinckii liên quan nhiều đến hai loài C saccharobutylicum và

C saccharoperbutylacetonicum Cả ba được biết đến như là các vi sinh vật

saccharolytic-sử dụng các loại đường làm cơ chất lên men và hầu hết các chủng lên men đường ở quy

mô công nghiệp đều thuộc loài C beijerinckii Mặc dù C.acetobutylicum được nghiên cứu nhiều nhất trong sản xuất dung môi nhưng C beijerinckii lại cho thấy nhiều ưu điểm

và có tiềm năng trong việc ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp C beijerinckii có

một khoảng pH tối thích rộng trong việc sinh trưởng và tạo dung môi Bên cạnh đó C beijerinckii là một đối tượng tiềm năng trong việc ứng dụng các kĩ thuật chuyển gene nhằm tạo ra các chủng có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn carbohydrate (Ezeji, et

al., 2004) Với C beijerinckii, người ta cho rằng các chủng này có khả năng chịu được

tác động của acid ở nồng độ cao nên thích hợp trong các quá trình lên men liên tục hơn so

với các chủng từ C.acetobutylicum (theo Grube & Gapes, 2002; Zverlov và các cộng sự, 2006) Trong nghiên cứu của Ezeji và các cộng sự (2004), chủng C beijerinckii BA101

sử dụng rất linh hoạt nhiều nguồn cơ chất khác nhau và cho nồng độ dung môi đạt từ 14.8-26.1 g/L với năng suất từ 37-50%

Có khá ít nghiên cứu về hai loài C saccharobutylicum và C

saccharoperbutylacetonicum được sử dụng để lên men ABE Shaheen và cộng sự (2000)

đã tập hợp những chủng đã được sử dụng để lên men và nhận thấy rằng chúng phát triển tốt hơn trên môi trường glucose và rỉ đường mía so với trên môi trường dịch ngô Kết quả

lên men tốt nhất được thực hiện trên chủng C saccharobutylicum BAS/B3/SW/336(S),

khi sử dụng mật rỉ mía với nồng độ dường lên men là 6.5% Nồng độ trung bình đạt 19.6g/L với hiệu suất 30%.

Bảng 3: So sánh khả năng lên men của một số chủng đã được phân lập

trường/cơ chất( 6%

đường lên men)

Nồng

độ các dung môi(g/L)

Hiệu suất( % ) suấtNăng

CHƯƠNG 4: QUÁ TRÌNH LÊN MEN

ACETON-BUTANOL-ETHANOL

4.1 Sự trao đổi chất trong quá trình lên men của vi khuẩn Clostridium

Trong quá trình lên men của Clostridium, hai giai đoạn sinh trưởng riêng biệt xảy ra:

giai đoạn acidogenic và giai đoạn solventogenic Giai đoạn acidogenic xảy ra đầu tiên,

khi Clostridium thực hiện quá trình lên men butyrat điển hình và phát triển trên môi

trường cơ chất là tinh bột hoặc đường Các sản phẩm chính trong giai đoạn này là butyrat (butyric acid), acetate (acid acetic), carbon dioxide và hydrogen Ethanol và acetone được hình thành với một lượng nhỏ Việc sinh ra các hợp chất có tính acid đã làm giảm pH của môi trường lên men xuống thấp, có thể làm chết tế bào vi khuẩn Để tránh bị tiêu diệt, vi khuẩn đã bắt đầu một sự thay đổi chuyển hóa diễn ra ở cuối giai đoạn tăng trưởng theo cấp số nhân Điều này cũng đánh dấu sự kết thúc của giai đoạn acidogenic và bắt đầu giai đoạn solventogenic Các acid bài tiết được sử dụng trong giai đoạn này và được chuyển đổi thành các sản phẩm trung tính, bao gồm aceton và butanol (theo tỷ lệ thông thường là 1:2) Sự chuyển đổi butyrate và acetate thành dung môi làm tăng pH trở lại, nghĩa là các

tế bào có thể trở lại hoạt động trao đổi chất trong một thời gian dài hơn Tuy nhiên, các dung môi này lại cũng gây ức chế các tế bào vi khuẩn, đặc biệt là butanol Dung môi gây bất hoạt các protein màng tế bào và phá hủy các màng của tế bào, do đó có một giới hạn

về nồng độ dung môi tối đa có thể đạt được trong quá trình lên men (khoảng 2% về khối lượng) Quá trình trao đổi chất diễn ra cụ thể theo sơ đồ như sau:

Hình 3: Sơ đồ trao đổi chất trong quá trình lên men của Clostidium

Quá trình tiền xử lý sinh khối chứa lignocellulosic hoặc thủy phân tinh bột được thực hiện nhờ các enzyme α-amylase, β-amylase, pullulanase, enzym glucoamylase, α-glucosidase do vi khuẩn tiết ra, (1,2) Sự thủy phân cellulose nhờ enzyme cellulase, β-glucosidase tạo ra glucose Glucose được hấp thu bởi hệ enzyme phophotransferase (PTS) và chuyển đổi thành pyruvate theo con đường EMP (Embden-Meyerhof-Parnas), (3,6) Sự thủy phân hemixenlulose tạo ra các đường xylose / arabinose được hấp thu, dưới tác dụng của enzyme transketolase-transaldolase tạo thành fructose 6-phosphate và glyceraldehydes 3-phosphate theo con đường EMP, (4,5) Sau đó pyruvate được ferrodoxin oxidoreductase chuyển hóa thành Acetyl-CoA, chất này sau đó được chuyển hóa thành Acetoacetyl- CoA nhờ enzyme thiolase, (7,10) Sự tạo thành acetate từ Acetyl-CoA được thực hiện nhờ các enzyme phosphate acetyltransferase và acetate kinase, (8)

và tạo ethanol nhờ các enzyme là acetaldehyde dehydrogenase và ethanol dehydrogenase, (9) Dưới tác dụng của enzyme Acetoacetyl-CoA transferase, Acetoacetyl-CoA đươc chuyển hóa thành acetoacetic Sự loại bỏ CO2 của acetoacetic khi được xúc tác bởi enzyme acetoacetic decaboxylase dẫn đến sự tạo thành acetone ở pH tối ưu vào khoảng 5.0 Sự tạo thành acetone qua acetoacetyl-CoA không tiêu thụ NADPH nên vi khuẩn chỉ

có thể tạo acetone ở một mức độ giới hạn, (11)

Từ nhánh acetoacetyl-CoA nhận H2 nhờ enzyme β- Hydroxibutiryl CoA hydrogenase tạo thành β- Hydroxibutiryl CoA Sau đó loại H2O dưới tác dụng của enzyme crotanase tạo thành crotonyl-CoA Nhờ enzyme butyryl-CoA hydrogenase chuyển thành Butyryl-CoA, (12).

Butyryl-CoA chuyển nhóm Co-A tạo thành Butyric nhờ enzyme Butyric transferase, (13) Mặt khác butyryl-CoA vừa nhận H2 và đồng thời tách nhóm Co-A tạo thành Butyraldehit, chất này sau đó nhận H2 tạo thành butanol, (14)

4.2 Lên men của vi khuẩn tự do

4.2.1 Khả năng sử dụng các nguồn cơ chất trong lên men

a Khảo sát khả năng sử dụng các loại đường đơn pentose và hexose

Để khảo sát khả năng sử dụng các loại đường khác nhau của Clostridium, Nasib

Qureshi và các cộng sự (2006) đã thực hiện các quá trình lên men với các loại đường là

glucose, xylose, arabinose, galactose sử dụng chủng Clostridium acetobutylicum P260

Trong thí nghiệm này, 60g mỗi loại đường trên sẽ được pha vào 1L môi trường P2 thực hiện lên men song song trong vòng 72h ở nhiệt độ 35oC Kết quả thu được sau 72h lên men, canh trường đã tổng hợp được 21.37, 11.12, 10.09, và 15.18 g/L ABE tương ứng với các dịch lên men của glucose, xylose, galactose và arabinose (bảng 4)

Bảng 4: Các thông số của quá trình lên men ABE trong 72h sử dụng các loại đường glucose,

xylose, galactose và arabinose

Glucose Xylose Galactose Arabinose

Trong suốt quá trình lên men, lượng glucose, xylose, galactose và arabinose được sử

dụng tương ứng là 59.4, 36.2, 31.9 và 37.0 g/L Mặc dù Clostridium acetobutylicum P260

có thể sử dụng được cả bốn loại đường nhưng kết quả đã cho thấy canh trường vi sinh vật

đã sử dụng glucose nhiều hơn những loại đường khác Glucose hầu như không còn trong dịch sau lên men, trong khi galactose được sử dụng ít nhất trong bốn loại đường (37.0 g/L) Tuy nhiên, hiệu suất lần lượt đạt 0.36, 0.31, 0.32 và 0.41 tương ứng của các dung dịch glucose, xylose, galactose và arabinose Như vậy, arabinose dù không lên men được hoàn toàn nhưng lại cho hiệu suất sinh butanol cao nhất Nồng độ tế bào vi sinh vật từ

dịch lên men của glucose cũng cho kết quả cao nhất (2.50 g/L), điều này cho thấy glucose tạo môi trường thuận lợi nhất cho sự phát triển của tế bào vi khuẩn.

Để đánh giá tốc độ sử dụng glucose, xylose, galactose và arabinose trong quá trình lên men, Nasib Qureshi và các cộng sự đã thực hiện lên men hỗn hợp 15g mỗi loại đường trên pha trong 1L môi trường P2 ở 35oC Kết quả được biểu diễn trên đồ thị hình 4:

Hình 4: Quá trình lên men từ hỗn hợp chứa 15 g/L các loại đường glucose, xylose, galactose

và arabinose sử dụng Clostridium acetobutylicum P260 (A): nồng độ sản phẩm của quá trình lên

men ở các thời điểm khác nhau, (♦) Acetone, (■): butanol, (▲): ethanol, ( ): acid acetic, (□): acid butylic (B): nồng độ đường còn lại trong dịch lên men ở các thời điểm khác nhau, (♦):

glucose, (■): xylose, (▲): arabinose, (●): galactose.

Hình 4B cho thấy, glucose được sử dụng nhanh hơn các loại đường còn lại, tất cả 15g glucose được sử dụng hết trong 35h lên men Sự tiêu thụ arabinose ngừng lại sau 53h lên men và còn sót lại hơn 0.6 g/L Quá trình sử dụng xylose và galactose diễn ra khá chậm, sau 70h lên men 8.7 g/L xylose và 9.4 g/L galactose vẫn chưa được sử dụng hết Nồng độ ABE đạt được sau 70h lên men từ hỗn hợp đường trên là 16.25 g/L với nồng độ butanol đạt xấp xỉ 12 g/L, năng suất là 0.23g/L.h và hiệu suất là 0.40 Với những kết quả này cho

thấy Clostridium acetobutylicum P260 tuy có thể sử dụng được nhiều loại đường khác

nhau nhưng việc tiêu thụ các loại đường xylose và galactose diễn ra khá chậm, hàm lượng đường sót còn nhiều làm giảm nồng độ butanol Phát triển các chủng mới từ loài

Clostridium acetobutylicum có khả năng sử dụng đường xylose và galactose tương đương

với glucose và arabinose sẽ mang lại hiệu quả cao hơn trong lên men

Một nghiên cứu khác trên loài Clostridium beijerincki, đã khảo sát khả năng sử dụng các loại đường đơn khác nhau Ezeji và cộng sự (2007) đã sử dụng chủng Clostridium

beijerinckii BA101 để lên men các loại đường glucose, xylose, cellobiose, mannose,

arabinose và galactose Dịch lên men được chuẩn bị trong môi trường P2, 55g mỗi loại

đường sẽ được pha vào 1L môi trường P2 ở 35oC không kiểm soát pH trong suốt quá trình lên men Kết quả được biểu diễn trên hình 5:

Hình 5: Nồng độ dung môi ABE đạt được khi lên men các đường đơn (55g/L: glucose,

xylose, cellobiose, mannose, arabinose và galactose) sử dụng Clostridium beijerinckii BA101 Quá trình lên men được thực hiện sau 60h thì Clostridium beijerinckii ngừng tạo sản phẩm

Nồng độ dung môi ABE đạt được cao nhất trong dịch lên men của cellobiose 19.1 g/L, đạt hiệu suất 0.35 Trong khi đó, dịch lên men từ glucose cho nồng độ dung môi cuối là 17.8 g/L đạt năng suất 0.30 g/L.h, nồng độ các acid trong dịch lên men chỉ còn 2.5 g/L Năng suất tạo dung môi của các loại đường còn lại dao động trong khoảng 0.23-0.32 g/L.h Galactose tiếp tục thể hiện là loại đường cho hiệu suất thấp khi được sử dụng để lên men ABE khi cho nồng độ dung môi thấp nhất Nồng độ acid trong dịch lên men của galactose khá cao (>7 g/L), điều này cho thấy sự giảm khả năng hấp thu và chuyển hóa các acid của vi khuẩn trong dịch lên men của galactose, từ đó làm giảm nồng độ dung môi ABE cuối

Để đánh giá khả năng lên men hỗn hợp các loại đường khác nhau của Clostridium

beijerinckii, Ezeji và cộng sự đã thực hiện quá trình lên men hỗn hợp đường gồm glucose,

mannose, arabinose và xylose bổ sung vào dịch lên men với tỉ lệ tương ứng là 5:1:2:4 Sau 84h lên men (khi quá trình lên men dừng lại), nồng độ dung môi ABE đạt được là 17.9 g/L với nồng

độ butanol đạt tối đa là 13.9 g/L ( hình 6) Mặc dù lượng butanol và tổng lượng ABE được tạo ra xấp xỉ như trong quá trình lên men từ đường glucose nhưng thời gian lên men lại dài hơn ( 84h

so với 60h của glucose), do đó dẫn tới kết quả là tốc độ sinh tổng hợp sản phẩm tương đối thấp (0.21 g/L.h)

Hình 6: Lên men ABE từ hỗn hợp đường glucose, mannose, arabinose và xylose với tỉ lệ

5:1:2:4 bởi Clostridium beijerinckii BA101 (A): nồng độ các sản phẩm đạt được trong suốt quá

trình lên men (B): nồng độ các loại đường còn lại HAc: acid acetic, HBu: acid butylic, HAB:

tổng acid acetic vả acid butylic

Trong suốt quá trình lên men, nồng độ các acid trong dịch lên men tương đối thấp (hình 6A), điều này cho thấy quá trình lên men cho hiệu quả tốt Tất cả các loại đường được sử dụng đồng thời trong suốt quá trình lên men mặc dù tốc độ sử dụng là khác nhau (hình 6B) Khả năng sử dụng đường glucose nhanh tiếp tục được thể hiện ở loài

Clostridium beijerinckii, điều này cho thấy glucose là cơ chất ưa thích trong quá trình

trao đổi chất của hầu hết các loài Khi nồng độ glucose dần cạn kiệt, loại đường tiếp theo

được Clostridium beijerinckii sử dụng nhiều hơn là xylose Có thể sắp xếp thứ tự ưu tiên

sử dụng các loại đường trong hỗn hợp của Clostridium beijerinckii theo thứ tự là glucose

> xylose > arabinose > mannose Kết thúc quá trình lên men, nồng độ các loại đường còn lại không được sử dụng trong dịch lên men là 0 g/L glucose, 4.0 g/L xylose, 3.3 g/L arabinose và 1.7 g/L mannose Như vậy, sự khác nhau về khả năng sử dụng các loại

đường giữa hai loài C.acetobutylicum và C.beijerincki đã được ghi nhận: sau glucose thì

C.acetobutylicum thể hiện khả năng sử dụng đường arabinose tốt hơn nhiều so với đường

xylose

Để so sánh rõ hơn về khả năng sử dụng đường glucose và đường pentose (xylose) trên

loài Clostridium beijerinckii, N Qureshi và cộng sự (2008) đã tiến hành hai thí nghiệm lên men Chủng C.beijerinckii BA101 được sử dụng, hai môi trường lên men lần lượt

chứa 25 g/L glucose và 25 g/L xylose Sau 60 giờ lên men, tất cả đường glucose đã được

sử dụng và tạo ra 9.9 ± 0.4 g/L ABE trong đó có 6.1 g/L butanol Nồng độ acetone và ethanol lần lượt là 3.9 và 0.4 g/L Năng suất đạt được là 0.17 ± 0.006 g/L.h và hiệu suất

là 0.39 ± 0.025 Trong khi đó quá trình lên men từ đường xylose cho nồng độ ABE đạt 9.6 ± 0.4 g/L với năng suất trong 60 giờ lên men đạt 0.16 ± 0.01 g/L.h và hiệu suất là 0.39 ± 0.011

Hình 7: Nồng độ các sản phẩm thu được trong quá trình lên men ABE từ chủng

C.beijerinckii BA101, (A): Glucose, (B): Xylose

Kết quả lên men đã cho thấy nồng độ ABE thu được từ glucose và xylose xấp xỉ bằng nhau, N Qureshi và cộng sự đã kết luận khả năng sử dụng đường xylose của

C.beijerinckii là tương đương so với glucose.

Những kết quả trên cho thấy các loài Clostridium đều có khả năng sử dụng đa dạng

nhiều loại đường khác nhau (hexose và pentose) đặc biệt phát triển rất tốt trên cơ chất là

đường glucose Trên môi trường là hỗn hợp nhiều loại đường khác nhau, Clostridium

cũng cho thấy khả năng lên men khá tốt Điều này chứng tỏ việc sử dụng các nguồn phế phẩm nông nghiệp có chứa sinh khối lignocellulosic (biomass) làm cơ chất cho quá trình lên men ABE là khả thi Khi thủy phân các nguồn sinh khối chứa lignocellulosic sẽ cho

ra hỗn hợp nhiều loại đường, việc thủy phân có thể tách riêng hoặc thực hiện đồng thời với quá trình lên men Nhiều nghiên cứu đã thực hiện trên các nguồn cơ chất khác nhau với mục đích làm giảm chi phí cho quá trình lên men tổng hợp butanol Việc xử lý các nguồn biomass trước khi sử dụng làm dịch lên men là khá phức tạp, có thể ảnh hưởng và làm giảm nồng độ dung môi đạt được Vì vậy, việc tối ưu hóa các điều kiện lên men với từng loại cơ chất để đạt hiệu quả cao nhất là tương đối phức tạp

b Lên men từ bột sắn (cassava flour CF)

Trong một nghiên cứu của Leonardo và cộng sự (2010), bột sắn được sử dụng làm cơ

chất cho quá trình lên men sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101 Bột sắn sẽ

được xử lý bằng hai phương pháp sử dụng enzyme (α-amylase và β-glucoamylase)và acid (HCl) Bột sắn được pha vào nước cất thành dung dịch huyền phù ở các nồng độ 60,

80 g/L Với phương pháp xử lý bằng acid (CT: acid chemical treatment), dung dịch HCl 1M được bổ sung vào dung dịch CF đến khi pH đạt 1.5 Quá trình thủy phân thực hiện trong 2h ở nhiệt độ 121oC, sau đó được làm lạnh đến 4oC để ngừng quá trình thủy phân Với phương pháp xử lý bằng enzyme (E1), CaCl2 (1g/L) được bổ sung vào dung dịch huyền phù để đạt 40 mgCa/L, điều chỉnh pH đến 6.5 bằng NaOH 1M α-amylase được bổ sung vào ( 1ml/kg bột) và thực hiện quá trình hồ hóa ở 93oC trong 2h Sau đó, bổ sung β-glucoamylase (1.7 ml/kg bột) thực hiện quá trình dịch hóa ở 60oC, tốc độ khuấy đảo 150 rpm trong 1h Cuối cùng hỗn hợp được đưa về 40oC giữ trong 39h trước khi lên men Quá trình lên men được thực hiện ở các nhiệt độ 35 và 40oC với nồng độ CF là 60 và 80 g/L Kết quả thu được thể hiện trong bảng 5:

Bảng 5: Kết quả lên men ABE của chủng Clostridium beijerinckii BA101 trên cơ chất bột

sắn ở các điều kiện khác nhau

Butanol (g/L)

Ethanol (g/L)

Acetone (g/L)

Tổng lượng dung môi (g/L)

c Lên men từ Xơ bắp ( corn fiber)

Xơ bắp là phụ phẩm từ trái bắp, không có giá trị về mặt kinh tế được sử dụng làm thức ăn gia súc Tuy nhiên trong xơ bắp chứa tới 60-70 % các thành phần carbohydrate, 30% trong số đó là arabinoxylan hoặc hemicellulose Nhiều nghiên cứu đã sử dụng xơ bắp như là nguồn cơ chất cho quá trình lên men sản xuất butanol Trong nghiên cứu của

N Qureshi và cộng sự (2008) sử dụng chủng Clostridium beijerinckii BA101, xơ bắp

trước khi lên men được thủy phân bằng hai phương pháp sử dụng enzyme và acid

sulfuric Các tác giả đã so sánh khả năng tổng hợp butanol từ dịch thủy phân của hai phương pháp trên Kết quả thu được từ quá trình lên men dịch thủy phân bằng acid sulfuric ( nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 29.8 g/L; glucose chiếm 4.3 g/L) cho bởi bảng sau:

Bảng 6: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ xơ bắp được thủy phân

Trong khi đó, quá trình lên men từ dịch thủy phân xơ bắp được thủy phân bằng enzyme cho kết quả tốt hơn Nồng độ đường đạt được sau quá trình thủy phân là 25 g/L Sau 72 giờ lên men 24.6 g/L đường đã được sử dụng

Hình 8: Nồng độ sản phẩm tạo thành trong quá trình lên men ABE từ dịch thủy phân xơ bắp

bằng enzyme.

Tổng nồng độ ABE đạt được là 8.6 ± 1.0 g/L trong đó butanol đạt 6.5 g/L tương ứng với tốc độ sinh tổng hợp 0.1 ± 0.011 g/L.h và hiệu suất 0.35 Kết quả đã cho thấy phương

pháp thủy phân xơ bắp bằng enzyme đã hạn chế các chất ức chế so với phương pháp thủy phân bằng acid Nồng độ tế bào đạt được trong dịch lên men là 1.65 ± 0.40 g/L Hàm lượng đường sót chỉ còn 0.4 g/L cho thấy sơ bắp được thủy phân bằng enzyme là nguồn

cơ chất tiềm năng cho sản xuất butanol ở quy mô lớn

Trong một nghiên cứu khác của Xin-Liang Li và cộng sự (2006), xylan lấy từ xơ bắp ( corn fiber xylan) được tiến hành đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chủng

C.acetobutylicum P260 Mục đích của nghiên cứu là xác định khả năng tự thủy phân các

hợp chất carbohydrate phức tạp thành đường đơn của C.acetobutylicum.Thí nghiện tiến

hành với môi trường ban đầu chứa 60 g xylan trong 1 lít môi trường P2, lên men ở 35oC Tuy nhiên, quá trình lên men đã không diễn ra, canh trường vi sinh vật không phát triển

và không tổng hợp được bất cứ dung môi nào Điều này chứng tỏ C.acetobutylicum

không có khả năng thủy phân xylan Xin-Liang Li và cộng sự (2006) tiếp tục quá trình lên men như trên có bổ sung 0.5 ml enzyme xylanase hỗ trợ cho quá trình thủy phân Kết quả cho thấy vẫn không có sự phát triển của tế bào trong canh trường, điều này được giải thích là do enzyme thủy phân xylan không đủ nhanh và đủ lớn để vi sinh vật sử dụng Thí nghiệm tiếp theo, 5 g/L xylose được bổ sung vào môi trường trên nhằm cung cấp cơ chất cho vi sinh vật có thể sống sót trong quá trình xylanase thủy phân xylan trong môi trường Kết quả là vi khuẩn đã phát triển và tổng hợp được 9.6 g/L ABE (hình 9)

Hình 9: Nồng độ các sản phẩm đạt được trong quá trình lên men ABE chứa

60 g/L xylan + 5g xylose + 0.5ml xylanase