Sinh học phân tử - CHƯƠNG IV.doc

Sinh học phân tử

CHƯƠNG IV TÍNH ỔN ĐỊNH CỦA DNA

Để đảm nhận chức năng mang và truyền thông tin di truyên một cách chính xác

và ổn định từ tế bào này sang tế bào khác, từ thế hệ này sang thế hệ khác nhng đồng thời phải có sự biến đổi để tiến hóa và thích nghi thì DNA cần phải có một số đặc tính nhất định đó là: tái bản, sửa sai và đột biến

Trong chu trỡnh sinh trởng và phát triển, tế bào chỉ tiến hành phõn chia sau khi DNA được nhõn đụi, để ổn định lợng DNA trong mọi tế bào Quỏ trỡnh này gọi là sự sao chộp DNA, kết quả từ 1 phõn tử DNA ban đầu sau một lần tỏi bản sẽ tạo thành 2 phõn tử DNA con giống hệt nhau và giống hệt với phõn tử ban đầu

Tuy nhiờn trong quỏ trỡnh tỏi bản cũng cú thể xẩy ra những sai sút Để đảm bảo cho việc lưu trữ và truyền đạt thụng di truyền một cỏch trung thành từ tế bào này sang

tế bào khỏc thỡ tế bào phải tự trang bị cho mỡnh một hệ thống bảo vệ và sửa chữa cỏc sai lầm trong quỏ trỡnh sao chộp gặp phải

Mặc dự vậy ớt nhiều cũng cú quỏ trỡnh biến đổi xảy ra tạo cơ sở cho tiến húa của sinh giới Biến đổi này do đột biến gen, do gen nhẩy hay do tỏi tổ hợp di truyền trờn phõn tử DNA Chương IV và V chỳng ta sẽ lần lượt đề cập đến cỏc vấn đề trờn

I Quá trình sao chộp DNA

1 Xẩy ra ở prokaryote

a Nguyờn tắc bỏn bảo thủ

Sự sao chép DNA được thực hiện theo nguyên lý bỏn bảo toàn (semiconservative) do Watson và Crick đề xuất (1953) dựa trên cơ sở tính đặc thù liên kết hydro giữa các bazơ bổ sung của 2 mạch Hãy tởng tợng sợi DNA kép giống nh một cái khoá dây xéc măng tuya, 2 dây tách rời nhau từ một đầu, mỗi dây l à một mạch đơn được dựng làm khuụn để tổng hợp thờm mạch đơn mới trên cơ sở nguyên

lí ghép cặp bổ sung giữa các bazơ, kết quả tạo ra 2 phân tử DNA trong đó mỗi phân

tử có 1 mạch đơn cũ và 1 mạch đơn mới

Chứng minh cho điều này là thớ nghiệm của 2 nhà khoa học trẻ Matthew

Meselson và Franklin Stahl tiến hành vào năm 1958 Họ đó nuụi vi khuẩn E.coli trong

mụi trường chỉ cú nguồn N nặng đỏnh dấu phúng xạ N15 Các N15 đợc nhập vào các bazơ nitơ của nucleotide, khi tỏi bản vi khuẩn sẽ phải sử dụng để tổng hợp sợi DNA, qua một số thế hệ tớnh theo thời gian nuụi sẽ tạo ra toàn bộ DNA cú chứa N15 này Sau

đú nếu đưa vi khuẩn vào mụi trường chứa N14 nhẹ, thỡ vi khuẩn sẽ phải lấy nguồn nitơ nhẹ để tổng hợp, qua lần tỏi bản thứ 2 sẽ cú 1 nửa số sợi đơn (ban đầu) cũn sợi đơn kia mang nitơ nhẹ Quay li tõm trong ống gradient tỷ trọng khỏc nhau chứa chất cesium chloride (CsCl) sẽ phõn tỏch DNA nặng (H) và nhẹ (L), kết quả sẽ thu đợc cỏc vạch

trên ống tỷ trọng, chứng tỏ quá trình tái bản theo phương thức bán bảo thủ (hình 1 4

và 2.4)

Hình 1.4 Sơ đồ sử dụng

phương pháp li tâm các

DNAs tái bản được đánh dấu

N15 trong nền dung dịch CsCl

tạo tỷ trọng tăng dần nhằm

chứng minh quá trình tổng

hợp DNA theo nguyên tắc

bán bảo thủ

Hình 2.4 Sơ đồ chứng

minh cơ chÕ tổng hợp

DNA E.coli theo nguyên

tắc bán bảo toàn Thế hệ

đầu các bazơ đánh dấu

của DNA E.coli chứa

toàn bộ N15 , sau đó

E.coli đó được nuôi trong

môi trường chứa các nu

có N14 bình thường, theo

thế hệ DNA được tổng

hợp sẽ nhẹ dần nhờ sử

dụng các bazơ chứa N14 ,

các bazơ này sẽ thay thế

dần N15 làm DNA nhẹ

dần đi

b Quá trình sao chép khởi đầu bằng sự tháo xoắn

Trong tù nhiªn có 3 mô hình cÊu tróc phân tử DNA tån t¹i, dạng 1: siêu xoắn, dạng 2: xoắn (vòng) và dạng 3: thẳng ở sinh vật nhân thật bậc cao DNA vòng, ở sinh

vật tiền nhõn, chỳng cú thể ở trạng thỏi xoắn và siờu xoắn, khi tỏi bản thường bắt đầu

từ việc đứt tại một điểm của 1 trong 2 mạch đơn DNA Cũn dạng thẳng thỡ cũng bắt đầu cắt đứt ở 1 điểm nhưng đứt ở cả hai mạch đơn và cú thể đứt ở nhiều vị trớ khỏc nhau trờn một nhiễm sắc thể Vị trí đứt khởi đầu tái bản thờng nằm ở những vùng DNA có chứa nhiều trình tự AT, dài từ 100 đến 200 bp Tiếp đến là quỏ trỡnh thỏo xoắn do nhiều enzyme tham gia cú tờn gọi là topoisomerase, enzyme này cú 2 loại là: topoisomerase I thỏo xoắn dạng DNA siờu xoắn, chỳng gắn vào DNA và cắt 1 trong 2 sợi, sau khi tạo được sợi DNA thỏo xoắn thỡ enzyme này nối chỗ đứt lại, điển hỡnh của

enzyme này là protein  của E.coli.

Topoisomerase II cắt cả 2 mạch của phõn tử DNA, thớ dụ như enzyme gyrase

của E.coli thuộc loại này Sau khi thỏo xoắn tạo ra DNA thẳng thỡ cỏc enzyme này lại

cú nhiệm vụ tự nối cỏc vị trớ vừa cắt lại Kết quả của quá trình tháo xoắn đã tạo lên

chạc tái bản, sẵn sàng cho quá trình tổng hợp sợi đơn mới Sơ đồ chạc 3 sao chộp DNA (hình 3.4)

Hỡnh 3.4 Sơ đồ quỏ trỡnh tỏi bản DNA theo Okazaki (1968)

c Quỏ trỡnh sao chộp là một cơ chế sinh húa phức tạp cú sự tham gia bởi nhiều nhõn tố

Ở nhiễm sắc thể vũng của vi khuẩn, quỏ trỡnh sao chộp bắt đầu từ một điểm sau

đú lan ra theo 2 hướng đến khi đụng vào nhau ở điểm nối đối diện, tạo thành 2 nhiễm sắc thể vũng xoắn Quỏ trỡnh sao chộp đũi hỏi sự tham gia của nhiều protein khỏc

nhau E.coli cần ớt nhất 2 tỏ sản phẩm gen khỏc nhau (bảng 1.4).

Ở sinh vật nhõn thật do kớch thước sợi DNA quỏ lớn và có nhiều sợi nờn quỏ trỡnh sao chộp khụng chỉ từ 1 điểm mà bắt đầu từ nhiều điểm Thớ dụ ở người cú từ 20.000 đến 30.000 điểm, đõy gọi là đơn vị sao chộp Đơn vị sao chộp là vựng DNA được sao chộp từ 1 điểm khởi đầu được gọi là replicon, chiều dài của một replicon ở người từ 100 đến 200 kb Mỗi nhiễm sắc thể của 1 vi khuẩn là 1 replicon Mỗi nhiễm sắc thể cú nhiều replicon và tỏi bản từ điểm khởi đầu cũng theo 2 hướng tỏi bản đến 2 đoạn DNA cuối

Hai mạch đơn của phõn tử DNA được tỏch rời nhau nhờ những enzyme gọi là

helicase hay cũn gọi là deroulase, ở E.coli cú 2 helicase Enzym này phỏ vỡ liờn kết

hydro giữa cỏc bazơ trờn 2 sợi đơn bổ sung, giỳp chỳng xoắn kộp vào nhau Cú nhiều loại helicase cựng đồng thời hoạt động, một số gắn trờn mạch theo hướng 3’-5’ như

(cỏc protein của gen Rep), một số khỏc gắn trờn mạch theo hướng 5’-3’ như helicase II

và III Cỏc mạch đơn sau đú tỏch rời nhau một cỏch ổn định là nhờ cỏc protein SSB (single strand binding proteins, SSBPs) Những protein này gắn lờn khắp cỏc nơi của mạch đơn đang được kộo dài làm 2 mạch đơn khụng kết hợp lại với nhau Nhờ vậy mà tốc độ sao chộp tăng lờn hàng 100 lần so với ngoài cơ thể khi khụng cú SSB trợ giỳp

Cả 2 mạch đơn đều cú thể dựng được làm khuụn để tổng hợp lờn sợi DNA mới tuỳ theo vị trí của promoter Nếu promoter đặt ở đầu 5’ của sợi DNA thì tổng hợp sẽ theo hướng từ mạch đơn đầu 3’ nguyờn bản (leading strand) sẽ tiến hành tổng hợp liờn tục, còn mạch nguyờn bản kia từ đầu 5’ sẽ tổng hợp đứt đoạn theo từng đoạn Okazaki

d Sao chép bắt đầu từ việc tổng hợp mồi (primer) RNA

Sợi đơn DNA mới được tổng hợp bắt đầu từ đoạn RNA mồi, việc tổng hợp RNA mồi do enzym có tên là primase tiến hành Måi RNA lµ mét chuçi RNA ng¾n chøa tõ 8 - 12 nucleotide Để enzyme này hoạt động được cần phải hình thành được một phức hợp giữa enzym primase với ít nhất là 6 protein khác nhau Phức hợp này gọi là primosome Ngoài men primase, primosome còn chứa những protein tiền tạo

mồi đặt tên là protein i, n, n’ và n’’ cộng thêm sản phẩm của những gen dna B và dna

C (bảng 1.4)

Bảng 1.4 Các protein và gen liên quan đến tái bản DNA ở E.coli

Primosome tiến hành phản ứng sinh mồi đầu tiờn cho sợi tiến (leading) và tổng hợp mồi lặp lại để tổng hợp những đoạn Okazaki cho mạch lựi Tuy nhiờn chức năng của mỗi protein trong primosome vẫn chưa rừ

Hỡnh 4.4 Thành phần và cấu trỳc của enzyme DNA polymerase III

Tham gia tổng hợp DNA ở vi khuẩn cú 2 enzyme DNA polymerase là DNA polymerase I và III Enzym tổng hợp kộo dài sợi mới trong quỏ trỡnh sao chộp nhiễm

sắc thể ở E.coli là enzym DNA polymerase III

DNA polymerase I chỉ chứa một chuỗi polypeptide trong khi đú DNA polymerase III (hình 4.4) là một holoenzym phức chứa 7 polypeptide khỏc nhau

chớnh xỏc, với sai sót rất thấp chỉ bằng 10-10

, tức cứ 10 tỷ nu nhập vào chuỗi thì chỉ sai

có 1 nu Điều này là do cả DNA pol I và III đều có chức năng đọc sửa 3’ – 5’ exonuclease (proofreading) Hoạt tớnh tổng hợp và phần ró theo hướng 5’-3’, cả 2 đặc tớnh này đều cú ở polypeptide  của DNA polymerase III Hoạt tớnh đọc sửa do polypeptide  đảm nhận Cũn chức năng cỏc tiểu đơn vị khỏc vẫn chưa rừ

e Sự tổng hợp hai mạch đơn mới xảy ra liờn tục trờn mạch bổ sung với sợi leading

và giỏn đoạn trờn sợi lagging

- Enzyme DNA polymerase III tổng hợp mạch bổ sung từ đầu 3’OH tự do của mỗi mồi RNA

- Mạch khuụn được sử dụng đến đõu cỏc protein SSB được giải phúng ra đến đú

- Vỡ chiều tổng hợp DNA luụn từ hướng 5’-3’, cho nờn sự hỡnh thành chuỗi polynucleotide mới trờn 2 mạch khuụn diễn ra theo 2 hướng ngược chiều nhau

- Trờn mạch khuụn hướng 3’-5’, sinh tổng hợp mạch đơn mới diễn ra theo chiều cựng hướng với hướng thỏo xoắn, mạch này được tổng hợp liờn tục được gọi là mạch tới

- Trờn mạch khuụn 5’-3’ sinh tổng hợp mạch đơn mới diễn ra theo hướng ngược với hướng thỏo xoắn, xẩy ra khụng liờn tục mà dưới dạng những đoạn ngắn gọi

là đoạn Okazaki (kớch thước mỗi đoạn dài từ 1000 đến 2000 bp) mạch này được gọi là mạch chậm hay lựi Tuy nhiờn, theo CA Wu và cộng sự năm 1992 (J Biol Chem Vol 276 issue 6, 4074 -4083, 02 1992), thỡ kớch thước đoạn Okazaki ở E.coli dài ngắn cũn phụ thuộc vào nồng độ NTPs hoặc enzyme primase và điều kiện mụi trường ảnh hưởng đến việc hỡnh thành mồi trờn sợi lựi Nếu lượng Pol III ớt kết hợp với primase thấp thỡ đoạn Okazaki cú thể dài hơn 7 kb

f Quỏ trỡnh hoàn chỉnh sợi mới tổng hợp

- Sau khi sao chộp kết thỳc, cỏc mồi RNA bị phân rã bởi hoạt tính 5’ – 3’ exonuclease của DNA pol I, để lại cỏc lỗ hổng, sau đú cỏc lỗ hổng này được lấp đầy nhờ chớnh enzym DNA polymerase I, enzym này kết hợp với đầu 3’ của các

đoạn Okazaki rồi tổng hợp sợi đơn DNA thay thế vị trí mồi RNA

- Tiếp theo enzym ligase sẽ nối đầu 3’ của đoạn DNA vừa đợc thế vào đoạn môi với đầu 5’ đoạn Okazaki của tất cả cỏc chỗ giỏn đoạn trờn mạch mới

- E.coli chứa khoảng 5 triệu bp, cần 40 phút để tái bản xong toàn bô genome Vi khuẩn tái bản theo phơng thức vòng lăn, một nhiễm sắc thể vòng có 2 chạc tái bản xẩy ra đồng thời, nh vậy tốc độ tái bản trung bình của vi khuẩn là khoảng 1000 nu trong một giây Tốc độ này khỏ cao là do Polymerase III chứa 2 tâm xỳc tỏc cú khả năng tổng hợp đồng thời cựng một lỳc trờn cả 2 mạch tiến và lựi với tốc độ cao, là do được kết hợp với protein β, giỳp pol III gắn vào DNA nguyờn bản và chuyển từ một enzyme cú tớnh liờn tục thấp(cứ thờm 10 nu lại tỏch rời nguyờn bản) thành một enzyme cú tớnh liờn tục cao, cú thể kộo dài liờn tục hàng 10 ngàn nu

2 Sao chộp DNA ở Eukaryote

a Thành phần tham gia

Cơ chế sao chộp ở sinh vật nhõn thật cũng giống nh sinh vật tiền nhõn theo cơ chế bán bảo thủ, có một sợi tiến và một sợi lùi quỏ trỡnh sao chộp chưa được hiểu rừ Tuy nhiờn bằng nhiều dữ liệu cho thấy chỳng cũng cú cơ chế tương tự như ở sinh vật tiền nhõn Điều khỏc biệt chủ yếu cú thể là thời gian hoàn thành một chu kỳ phân chia

tái bản genome, biến động từ 1,4 giờ đối với nấm men (có16 nhiễm sắc thể) đến 24 giờ

ở một số tế bào động vật nuôi cấy mô, thậm trí có tế bào kéo dài từ 100 đến 200 giờ Khác biệt nữa là ở thành phần tham gia vào bộ mỏy tổng hợp Nếu ở E coli cú 13 thành phần thỡ ở nấm men và động vật cú vỳ cú ớt nhất là 27 thành phần Lý do cần nhiều thành phần là do độ phức tạp của DNA bậc cao, chỳng được tổ chức trong cỏc nucleosome (histone bọc DNA) Cú nhiều loại DNA polymerase tham gia vào quỏ trỡnh sao chộp là:

- Polymerase /primase cú chức nprimase cú chức năng tổng hợp mồi RNA cho mạch chậm, enzyme này khụng cú khả năng sửa sai (exonuclease) do đú khụng phải là thành phần duy nhất tham gia vào quỏ trỡnh sao chộp

- Polymerase  cú chức năng giống DNA polymerase I ở sinh vật tiền nhõn, nghĩa

là cú đặc tớnh vừa tổng hợp đi liền với sửa chữa và hoàn chỉnh sợi đơn DNA sau khi mồi RNA được loại bỏ

- Polymerase  được tỡm thấy ở ty thể cú chức năng chưa rừ

- Polymerase  dường như cú chức năng gần với DNA polymerase III ở sinh vật tiền nhõn

- Polymerase  mới được phỏt hiện gần đõy cú vai trũ chưa rừ

Ngoài cỏc enzyme kể trờn hệ thống sao chộp ở sinh vật nhõn chuẩn cũn cú sự tham gia của nhiều protein chuyờn biệt như nhõn tố kết gắn nhiễm sắc CAF-1 Nhõn

tố này kết hợp và mang một số histone mới được tổng hợp đến chạc tỏi bản, ở đõy chỳng kết hợp tiếp với protein β tạo thành một tổ chức lắp ghộp trung gian cú tờn là PCNA (proliferating cell nuclease antigen: khỏng nguyờn nhõn tế bào đang phõn chia) Phức hợp protein này làm nhiệm vụ thỏo bỏ và lắp ghộp lại cỏc protein nằm trong nucleosome để giỳp quỏ trỡnh tỏi bản và tõn tạo lại cỏc nucleosome mới thụng quỏ việc hoạt húa cỏc polymerase  và  và cỏc nhõn tố sao chộp A và C (Replication Factor, RF-A, RF-C) cần cho hoạt động của cỏc DNA polymerase  và 

Đoạn khởi đầu tái bản dài từ hàng chục ngàn đến hàng trăm ngàn bp, cũng giầu

AT và có nhiều điểm khởi đầu trên một nhiễm sắc thể và trong genome Từ cỏc điểm này DNA cũng đợc tổng hợp về cả 2 hớng

b Một mụ hỡnh sao chộp ở sinh vật nhõn thật được đề xuất như sau:

- Đầu tiờn, phức hợp nhận biết vùng khởi đầu tái bản (origin recognition complex, ORC) bọc lấy những điểm khởi đầu, dới tác dụng của enzyme topoisomerase và nhõn tố sao chộp (RF-A) làm DNA đợc thỏo xoắn

- Trờn mạch chậm, polymerase /primase cú chức nprimase tương tỏc với RF-A để tổng hợp lờn cỏc mồi RNA dài độ 10 nucleotit, mồi này sau đú được nối dài thờm độ 20 deoxynuleotide nữa nhờ enzyme polymerase  kết hợp với nhõn tố sao chộp C

(RF-C) Khi đú phức hợp PCNA-ATP đó chặn polymerase  lại, để cho phộp enzyme polymerase  gắn vào chuỗi và tổng hợp đoạn Okazaki

- Enzyme polymerase  sau khi được giải phúng sẽ chuyển đến mạch đối diện và tổng hợp liờn tục mạch tiến

- Vấn đề đối với sinh vật nhõn thật là có quỏ trỡnh hỡnh thành lờn cấu trỳc nhiễm sắc chất, nhiều nghiờn cứu sử dụng đồng vị phúng xạ cho thấy cỏc phõn tử DNA ngay sau khi được sao chộp đó tổ chức lại ngay thành cỏc nucleosome trong vũng vài phỳt Cỏc nucleosome mới hỡnh thành chỉ chứa cỏc histone mới tổng hợp, vậy nucleosome mới hỡnh thành này nằm hoàn toàn trờn một mạch cũn nucleosome cũ trờn mạch kia hay chỳng phõn bố đều trờn cả 2 mạch thỡ vẫn chưa rừ

c Kết thúc tổng hợp tại đầu telomere của mỗi nhiễm sắc thể

Tại đây ở mạch tiến sợi đơn mới đợc kéo dài từ điểm khởi đầu đến hết đầu mút nhiễm sắc, riêng đối với mạch lùi thì có hiện tợng còn một đọan kết thúc trống cha chạm đến đầu mút 3’ kia Làm thế nào để khi hoàn chỉnh sợi DNA kép mới, đoạn này không bị mất đi, muốn thế tế bào phải có một cơ chế chống lại nguy cơ mất này

Hình 5.4 Quá trình tái

bản mỗi đoạn Okazaki

đầu 3’ nguyên bản cheo

Sợi mới tổng hợp có màu

vàng, sợi nguyên bản

màu xanh

Elizabeth Blackburn và

Joe Gall đã phát hiện ở

các đầu telomere có chứa nhiều đoạn lặp lại giống nhau Đầu cuối của các đọan DNA

ở đầu nhiễm sắc thể, nơi sinh ra rRNA chứa một dẫy ngẫu nhiên gồm nhiều đoạn lặp lại TTGGGG Đặc điểm này có ở hầu hết các nhiễm sắc thể của sinh vật nhân chuẩn Tuy nhiên trình tự lặp lại của các loài khác nhau có khác nhau Thí dụ nh ở đầu cuối các nhiễm sắc thể của ngời dài 10 – 15 kb chứa nhiều đoạn lặp lại TTAGGG Để không bị mất đoạn DNA telomere ở đầu 3’ thì cần có một enzyme có tên là telomerase

để gắn thêm những đoạn 3’ AACCCCAAC 5’ vào đầu 3’ của DNA telomere, bổ sung với đoạn lặp lại

Sau khi thêm 3’ AACCCCAAC 5’ vào đầu cheo 3’, enzyme telomerase RNA sẽ

di chuyển dọc theo phân tử DNA (sang phải) vì thế đầu 3’ có thể kéo dài thêm nhờ hoạt tính trùng phân Đầu 3’ tiếp tục đợc kéo dài do sự di chuyển tiếp tục của enzyme RNA telomerase Sau đó, enzyme primase, xúc tác tạo mồi 3’AAC 5’ và DNA polymerase sử dụng đầu 3’ cheo rất dài này làm nguyên bản để lấp đầy đầu cuối cho mạch đơn DNA kia Cuối cùng mồi bị loại bỏ và ligase sẽ nối chỗ trống lại Kết quả giữ nguyên đợc chiều dài của nhiễm sắc thể qua mỗi lần tái bản

Hình 6.4 Cơ chế kéo

dài đầu telomere nhờ

enzyme telomerase mang

phân tử RNA ngắn làm

mồi

d Telomere, bệnh ung

th và cơ chế già hoá

Để tránh mất vật

liệu di truyền sau mỗi lần

tái bản, telomere cần phải

kết hợp với một số

protein để hình thành lên mũ bảo vệ Cấu tạo của mũ bảo vệ telomere (hình 8.4) gồm 3 protein là TRF1, TRF2 và WRN, chúng liên kết với nhau rồi bọc lấy những trình tự lặp lại ở telomere, ẩn dấu đầu cheo 3’, đoạn này nhiều khi dài đến 100 nu Mũ bảo vệ ở telomere có 3 chức năng: 1) ngăn cản không cho enzyme deoxyribonuclease phân giải

đầu mut cua phân tử DNA, 2) ngăn cản không cho các nhiễm sắc thể trong nhân dính vào nhau, 3) tạo sự ổn định trong quá trình tái bản DNA ở phần cuối nhiễm sắc thể Nếu không có mũ bảo vệ telomere thì đầu cuối sợi nhiễm sắc thể sẽ bị gẫy, dẫn đến