Sinh học phân tử - CHƯƠNG VIII.doc

Sinh học phân tử

CHƯƠNG VIII SỰ ĐIỀU HÒA BIỂU HIỆN CỦA GEN I Điều hoà biểu gen Đặt vấn ®ề Ở chương trên, đề cập đến trình thiết yếu tế bào mức phân tử là: chép DNA, phiên mã tạo mRNA dịch mã tạo polypeptide Ba trình xảy nội tế bào Trong chơng đề cặp đến trình điều hòa biểu gen hai hệ thống sinh vật, nội tế bào, tế bào, toàn thể dới tác động môi trờng Thng thỡ t bo khụng th tồn cách độc lập tách rời với môi trường xung quanh mà thường xuyên liên tục có trao đổi chất c¸c tế bào với với mơi trường bªn ngồi Đây mét đặc tính sống Đối với tế bào sinh vật tiền nhân, mơi trường ngoµi mét tập hợp nhân tố vật lý hóa học bao quanh bên ngồi tế bào Cịn sinh vật nhân thật đa bào, mơi trường ngồi tế bào tập hợp tất tế bào bao xung quanh, ngoại gian bào, quan mô khác nội thể sinh vật thống Như vấn đề nảy sinh cách tế bào điều chỉnh hoạt động cho phù hợp với biến đổi mơi trường ngồi để tồn tại, thích ứng vµ ph¸t triĨn Q trình điều hịa có khác v c ch v cỏch thc gia hệ thống sinh vật, cụ thể tóm tắt So sánh khác sinh vật tiền nhân nhân thật a Khác động điều hòa biểu gen Sinh vật tiền nhân Sinh vật nhân thật - ĐĨ ®iều chỉnh hệ enzyme cho phù hợp với tác nhân môi trường bên ngồi như: dinh dưỡng, lý hóa tính để tế bào tăng trưởng sinh sản - Sự điều hịa xảy cách linh động, có tính thuận nghịch, tức thời tuỳ thc vµo - Do tế bào không tiếp xúc trực tiếp với môi trường bên ngồi q trình điều hịa khơng mang tính chất thụ động với biến động ngoại bào - Vì tế bào thành phần thể sống chúng phải tuân thủ cách nghiêm ngặt theo chương trình phát triển chun biệt từ thể cịn phơi thai đến lúc trưởng thành - Sự điều hòa hoạt động gen 100 môi trường mà gen có biểu hay khơng - Có thể ngừng thời điểm chu trình tế bào Một enzyme sinh ra, ngừng sinh lại sinh cách dễ dàng Tất q trình điều khiển mức độ hoạt hóa khác - §iỊu hòa chủ yếu theo mô hình operon nhm hng n việc chuyên biệt hóa loại tế bào thành cấu trúc chức riêng khơng mang tính thuận nghịch - Khi tế bào vào biệt hóa khơng cịn có khả quay trở lại trạng thái ban đầu hay chuyển sang hướng phân hóa khác Thí dụ tế bào phơi thai chuyển thành tế bào gan khơng thể quay lại thành tế bào phôi thai không trở thnh t bo rut c - Mô hình điều hòa đa dạng phức tạp, tùy gen, tế bào, mô, giai đoạn sinh trởng phát triển sinh vËt b Nguyên nhân dẫn đến khác - Sự khác biệt cấu trúc tế bào loại sinh vật dẫn đến khác biệt q trình điều hịa biểu gen Ở sinh vật tiền nhân, tế bào khơng có màng nhân, mRNA vừa phiên mã từ DNA tiếp xúc với máy dịch mã, kết trình tổng hợp protein tiến hành ngay, phiên mã dịch mã tiến hành đồng thời Chính mà điều hịa biểu gen chủ yếu diễn giai đoạn phiên mã - Trong tế bào sinh vËt nhân thật, tÕ bµo cấu tạo cã màng nhân, phiên mã xảy nhân, dịch mã xảy tế bào chất nên trình xảy khơng đồng thời dẫn đến q trình điều hịa biểu gen xảy phức tạp hơn, phải tiến hành qua nhiều giai đoạn công đoạn khác - Sinh vật tiền nhân có cấu tạo đơn bào sinh vật nhân thật cấu tạo đa bào, mơ quan phận c¬ thể đợc bit hoỏ m nhn nhng chc phn khác c Các thành phần tham gia vào trình biểu gen Có thành phần tham gia vào q trình biĨu gen: - Những tín hiệu chúng phải có khả gây đủ mạnh để làm thay đổi hoạt hóa biểu gen - Sự điều hòa biểu gen tiến hành số giai on chui cỏc phn ng t trình DNA chép sinh mRNA chín đến viƯc dịch mó để to thnh polypeptide chức - C ch phân tử q trình điều hịa biểu gen chế đề cập đến trình điều hòa tham gia phân tử thành phần 101 II mô hình điều hòa biểu gen Prokaryote Khái niệm - Tín hiệu điều hịa chủ yếu yếu tố, hợp chất dinh dưỡng hay yếu tố vật lý, hãa hoc môi trường ni cấy vi sinh vật Gen biểu ngừng biểu hoạt động mạnh hay yếu sản phẩm gen cần thiết hay không cần thiết cần thiết nhiều hay cần thiết cho tế bào sinh trưởng mơi trường định Như cho phép sinh vật thích ứng cách kỳ diệu với mơi trường ngồi ln biến đổi Các q trình thích ứng cần thiết phải có lượng Hình 1.8 Tác động chất cảm ứng (a) chất ức chế (b) đến trình tổng hợp enzyme vi khuẩn a) mơi trường khơng có lactose tế bào tiến hành tổng hợp lượng nhỏ enzyme để sử dụng lactose Cũng tế bào chuyển sang mơi trường có lactose tốc độ tổng hợp enzyme tăng mạnh b) trường hợp ngược lại ch iu ho c ch điều khiển trình tng hợp trytophan ngược lại Khi mơi trường khơng có tryptophan tế bào E.coli lại tổng hợp mạnh enzyme để sinh tổng hợp tryptophan, thêm tryptophan vào mơi trường tốc độ tổng hợp enzyme giảm nhanh theo thời gian sau dừng lại trì ổn định lượng nhỏ - Cơ chế điều hịa chủ yếu thực thơng qua operon Khái niêm operon tồn sinh vật tiền nhân Mỗi operon lại bao gồm thành phần sau: số gen cấu trúc gen mã hóa tạo thành polypeptide, gen cấu trúc cịn gọi cistron có nhiều cistron nằm kề cận Các trình tự DNA khác 102 tham gia vào hoạt động điều hịa trình tự ®iỊu khiĨn nằm promoter operator - Có kiểu operon operon cảm ứng (induction) operon ức chế (repression) trình bày h×nh 1.8 Operon cảm ứng có đặc tính liên quan đến q trình dị hóa tức q trình phân giải hợp chất phức tạp thành hợp chất đơn giản thí dụ hoạt tính c¸c enzyme liên quan đến việc sử dụng đường lactose, galactose hay arabinose Khi khơng có lactose mơi trường ni cấy enzyme β-galactosidase khơng sinh mét lỵng Cịn thêm đường lactose vào mơi trường ni cấy trình tổng hợp enzyme tăng lên cách đột ngột đến thời điểm (khoảng phút) tốc độ tổng hợp enzyme dừng lại ổn định (hình 1.8a) - Operon ức chế, thí dụ enzyme tổng hợp tryptophan Khi tryptophan khơng có mặt mơi trường vi khuẩn E.coli xúc tiến trình tổng hợp enzyme mạnh để tổng hợp axit amin tryptophan cần cho nhu cầu Nếu thêm axit amin tryptophan vào mơi trường việc tổng hợp c¸c enzyme để tổng hợp tryptophan b c ch v lng enzyme ny gim dần theo thời gian đến lúc (khoảng 15 phút) ổn định biểu diễn đồ thị hình 1.8b Operon cảm ứng mã hố tạo enzyme xúc tác cho q trình dị hóa - Q trình dị hóa q trình chất hữu phức biến đổi thành thành phần đơn giản nhờ hoạt tính số enzyme Thí dụ đường lactose biến thành đường glucose galactose Đây kiểu operon cảm ứng, tín hiệu điều hịa đường lactose Khi khơng có mặt đường lactose mơi trường nu«i cÊy vi khn gen mã hóa cho enzyme xúc tác việc chuyển hóa ®êng lactose khơng biểu Khi mơi trường có đường lactose vi khuẩn phải thích ứng cách sản sinh loại enzyme β-galactosidase (gen Z) β-galactoside permease (gen Y) β-galactoside transacetylase (gen A) - Enzyme β-galactosidase enzyme xúc tác cho phản ứng phân giải đường phức lactose thành hai hướng: 1/ cắt đường lactose thành đường đơn glucose galactose, vi khuẩn sử dụng đường glucose; 2/ hình thành lên chất cảm ứng lac (Lac inducer) allolactose, chất bọc lấy protein điều hồ làm rời khỏi operator Trong trường hợp lại kích thích q trình phiên mã gen cấu trúc, mét chóng tạo βgalactosidase (h×nh 3.8) Ba gen cấu trúc phiên mã cách đồng thời ®Ĩ tạo mRNA gọi polycistronic message (h×nh 2.8) để phân giải đường lactose Cấu trúc operon trình bày hình 2.8 gồm promoter (promoter vị trí mà men RNA polymerase bọc lấy để tiến hành phiên mã), operator gen cấu trúc Z, Y A Còn promoter cđa gen điều hịa sù biĨu hiƯn cđa Lac operon nằm v trí khác khơng cố định genome cđa vi khuẩn (h×nh 2.8) 103 - Cơ chế điều hòa dựa vào tương tác protein điều hòa với trình tự DNA đầu 5’ khơng mã hóa gen cấu trúc gọi operator Hình Cấu trúc mơ hình điều hồ operon biểu gen a) thành phần Operon gồm từ đến nhiều gen cấu trúc thí dụ có gen cÊu tróc: SG1, SG2 SG3, operator (O), promoter (P), gen điều hồ promoter PO nơi enzyme RNA polymerase phải bọc lấy phiên mã gen cấu trúc Cịn vị trí operator nơi bäc cđa protein ức chế b) Cơ chế điều hồ lac operon, có mặt chất cảm ứng (lactose) mụi trng (điều hòa âm tính) 104 Hỡnh 2.8c Mơ hình điều hồ operon theo chế tác động ca cht ng c ch (điều hòa dơng tính) C chế điều hồ có mặt cđa chất đồng ức chế (tryptophan) mơi trường (trp operon) protein ức chế kết hợp với chất đồng ức chế nên có khả bọc operator (O) lµm q trình phiên mã dừng, c¸c enzyme khơng tạo 105 Hình 3.8 Hai hướng phản ứng xẩy quan trọng lactose có tham gia xúc tác enzyme β-galactosidase 1) chuyển đường lactose thành chất cảm ứng allolactose 2) cắt đường lactose tạo đường đơn glucose galactose - Protein điều hòa gọi nhân tố kìm hãm (repressor) Bình thường tế bào vi khuẩn lu«n sản sinh protein cách đặn nhng với lượng nhỏ Protein điều hòa tạo từ gen điều hịa, gen nằm vị trí genome cđa vi khuẩn - Lac promoter cha vị trí bọc đặc thù: v trớ đầu cho phộp RNA polymerase bc vo, vị trí tiÕp sau cho phép phøc hỵp (CAP-cAMP), phức hợp gi÷a protein hoạt tính dị hóa (CAP, catabolite activator protein) phân tử hiệu ứng nhỏ (cyclic AMP, adenosine 3’,5’-phosphate cã nguån gèc tõ ATP nhê enzyme adenylcyclase), bc vo CAP bọc đợc vào promoter có mặt cAMP, nồng độ cAMP phụ thuộc vào có mặt hay không đờng glucose, đờng glucose tăng cAMP giảm ngợc lại - Phức hợp CAP-cAMP bọc vào promoter làm tăng hiệu bọc RNA polymerase vào promoter - Khi protein điều hịa bọc lấy operator chiếm lấy khoảng khơng gian không cho phÐp RNA polymerase bọc lấy promoter kết q trình phiên mã khơng thực - Việc protein điều hịa có bọc hay khơng vào operator cßn phụ thuộc vào có mặt hay khơng cã mỈt phân tử hiƯu ứng (effector molecule) hay gọi chất cảm ứng (inducer) Trong trường hợp lac operon, chất cảm ứng đường lactose Khi có mặt đường lactose, chất kết hợp với protein điều hịa g©y biến hình protein điều hịa, làm cho khơng có khả bọc vào operator buộc nã phải rời ra, nhờ mà 106 RNA polymerase bọc vào promoter trình phiên mã gen cấu trúc bắt đầu Enzyme β-galactosidase sinh ra, gọi chế điều hịa âm tính - Hình 2.8c trình bầy mơ hình điều hồ operon cảm ứng ức chế (repressible operon) Cơ chế điều hoà kiểu sau: protein điều hồ bọc operator trường hợp có mặt kết hợp với phân tử hiÖu ứng, chất gọi chất đồng ức chế (co-repressor) Khi khơng có mặt phân tử hiƯu ứng kết hợp protein điều hồ khơng thể bọc vào operator làm cho operator tự do, cho phép RNA polymerase bọc lấy promoter, kết làm trình phiên mã tiến hành, tạo c¸c enzyme Khi có mặt phân tử hiÖu ứng thêm vào, phân tử phản ứng kết hợp với protein điều hoà, tạo thành phức hợp protein điều hồ-chất đồng ức chế (repressor-co-repressor) Phức hợp có khả bọc lấy operator, làm enzyme RNA polymerase bọc promoter, kết q trình phiên mã khơng xẩy ra, khơng sinh c¸c enzyme Q trình điều hoà gọi chế điều hoà dương tính Operon kìm hãm trp (Repressible operon) - Hệ thống điều hồ thường liên quan đến q trình ng hoỏ tng hp cht hữu Thớ d trình sinh tổng hợp tryptophan phức tạp từ thành phần đơn giản Tryptophan operon có cấu tạo gồm gen cấu trúc (tính từ đầu 5’ thứ tự trp E, D, C, B A) kèm theo trình tự điều hồ phụ cận (h×nh 4.8) Hình 4.8 Cấu tạo gen trp operon E.coli Operon trp dài ước khoảng 7000 bp, chứa gen cấu trúc, phiên mã tạo mRNA, tổng hợp nên enzyme xúc tác cho trình tổng hp tryptophan từ chất acid chorismic anthranitic acid → PRA → CDRP → 107 InGP → Tryptophan Gen trpR mã hố tạo protein ức chế q trình tổng hợp, không liên kết (nằm gần) với operon trp Vùng operator (O) nằm gọn vùng promoter (P1) Ngoài cịn có thêm promoter yếu khác (p2) nằm xa operator gần đầu cuối gen trpD Promoter phụ có tác dụng làm tăng lên mức độ tiếp tục phiên mã gen trpC, B A Có trình tự kết thúc phiên mã (t t’) nằm phần cuối gen trpA Vùng gen trpL phiên mã đặc thù tạo trình tự mRNA dài 162 nu, bên chứa vùng suy giảm (a), tạo mức độ thứ cấp, việc điều khiển trp operon Promoter P1 kéo dài khoảng 18 cặp nu nằm trước gen trpL Ký hiệu PRA: phosphoribosyl anthranilate, CDRP: carboxyphenylaminodeoxyribulose phosphate, InGP: indole glycerol phosphate - Vùng Operator promoter nằm đầu gen trp E, promoter operator tồn vùng nhỏ gọi vùng leader (trp L, leader region) Trong vùng trpL có chứa vị trí att (attenuation) Q trình điều hồ trp operon tương tự trình bầy hình 2.8c Protein điều hồ operon trp sản phẩm gen trp R, gen khơng liên kết gÇn với trp operon khơng thể gắn vào promoter Protein ®iỊu hßa trp operon đứng chất ức chế khơng hoạt động (aporepressor) - Khi khơng có mặt tryptophan (chất đóng vai trị chất đồng ức chế) enzyme RNA polymerase bọc lấy vùng promoter trình phiên mã gen cấu trúc xẩy Tốc độ phiên mã trp operon khơng có mặt tryptophan tăng lên 70 lần cao so với có mặt tryptophan(trạng thái ức chế) - Ở thể đột biến trpR khả tạo protein ức chế, thêm tryptophan vào môi trường nuôi cấy làm tốc độ tổng hợp enzyme tổng hợp tryptophan giảm từ đến 10 lần Điều khiển trp operon chế suy giảm - Ngêi ta ph¸t hiƯn thÊy thể đột biến mét phÇn ë vùng leader (trp L) lại làm tăng tốc độ biểu trp operon, có mặt tryptophan tryptophan - Điều khiển tợng có liên quan đến trình tự nằm vùng nội trpL, gi tr×nh tù suy giảm (att, attenuator) h×nh 5.8 Sự suy giảm xảy cách điều khiển làm kết thúc phiên mã vị trí gần với đoạn cuối trình tự mRNA leader Quá trình dừng sớm phiên mã xảy có mặt tRNATryp, kết thu sợi mRNA có trình tự đoạn leader dài 140 nu - Vùng suy giảm có trình tự cặp bazơ cần phải tương tự với vùng mang dấu hiệu kết thúc phiên mã Vùng kết thúc phiên mã phát nằm đầu tận hầu hết operon vi khuẩn (h×nh 6.8) Dấu hiệu kết thúc chứa đoạn đọc xuôi 108 ngược giống nhau, giàu GC tiếp sau cặp bazơ AT Khi phiên mã dấu hiệu kết thúc thu sợi RNA có khả hình thành nên cấu trúc hairpin sau hairpin trình tự số U (hình 6.8a) Hình 5.8 Trình bầy cấu tạo trình tự nu mRNA đoạn leader trp operon gồm: Codon khởi đầu dịch mã (AUG) trình tự peptide leader (có 14 a.amin) chứa codon a.amin Trp, codon kết thúc peptide leader UGA, trình tự attenuation chứa trình tự đoạn cặp đôi đối xứng (dyad symmetry), codon khởi đầu dịch mã tạo trp nằm gen trp E - Khi RNA thơng tin tổng hợp hình thành nên cu trỳc hairpin, cu trỳc ny tác động làm thay i hỡnh thự ca RNA polymerase kt hp phiên m·, dẫn đến lµm kết thúc phiên mã sau vùng DNA-RNA base pair (A : U)n có liên kết hydro yếu * Vậy trình điều khiển có vắng mặt tryptophan - Đầu tiên nhí lại sinh vật tiền nhân trình phiên mã dịch mã xảy đồng thời, vậy, kiện xảy dịch mã ảnh hưởng đến q trình phiên mã - Thứ hai trình tự leader dài 162 nucleotide n»m ph©n tư mRNA cđa trp operon (hình 6.8) có trình tự nu ghép cặp bổ sung để hình thành nên cấu trúc hairpin, mặt có mặt tryptophan - Vựng thứ (hình 6.8b), mặt tryptophan, ribosome dịch mà dọc theo phân tử mRNA tạo nên peptide leader, peptide làm ribosome dừng lại codon trp, hairpin không kết thúc phiên mà hình thành t nu 74 - 85 v t nu 108 - 119, trình phiên mà tiếp tục kÐo dµi 109 trí siêu mẫn cảm lại thường nằm cạnh gen phiên mã chưa rõ, trường hợp gen globulin vị trí siêu mẫn cảm thường hay bị cắt enzyme Nuclease S1, loại enzyme endonulease, đặc thù phân rã sợi DNA đơn Enzyme chiết xuất từ Aspergillus Điều chứng tỏ phân tử DNA không ghép cặp bazơ cách xác có số biến đổi cấu trúc khác để biến từ dạng B-DNA thành Z-DNA vị trí siêu mẫn cảm Rất bước chuẩn bị để enzyme RNA polymerase bọc lấy promoter Vai trò hocmon việc điều hòa hoạt động gen a Khái niệm - Hocmon hợp chất hữu đợc tạo từ phận thể sinh vật đợc vận chuyển đến nơi khác cần thiết tác dụng - Trao đổi thông tin liên lạc tế bào tượng quan trọng thể thực, động vật bậc cao Tín hiệu xuất phát từ tuyền tế bào tiết dịch khác nhau, cách kích thích tế bào mơ mục tiêu (đích) tiến hành thay đổi mạnh cách thức trao đổi chất Những thay đổi bao gồm hướng phân hóa, phụ thuộc vào q trình biểu gen Vấn đề loại phân tử mang tín hiệu chuyển từ tế bào sang tế bào khác Bằng cách kích thích trình khỏi động biểu số gen Các q trình ®Ịu hocmon đảm nhiệm, cã nhiỊu lo¹i hocmon tån t¹i - Peptide hocmon, thuộc nhóm insulin, cịn steroid hormon estrogen (hocmon giới tính cái) testosterone (đực) (h×nh 11.8) đại diện cho hệ thống hocmon tín hiệu dùng đề trao đổi thông tin tế bào Ở động vật bậc cao hocmon sinh tổng hợp tế bào tiết dịch chuyên hóa khác tiết máu Peptide hocmon bình thường khơng thấm vào tế bào kích thước q lớn Chức làm mơi trường hoạt động cho protein tiếp nhận nằm màng tế bào mục tiêu xúc tác trình trao đổi AMP tế bào Hocmon steroid hợp chất có cấu trúc phân tử nhỏ, nên xâm nhập vào tế bào qua màng nguyên sinh chất Khi vào bên tế bào đích thích hợp, steroid hocmon bọc chặt lấy protein tiếp nhận đặc thù, protein có mặt tế bào chất tế bào đích Hình 11.8 Cấu tạo hố học hocmon giới tính steroid estrogen cái, cịn testosterone đực Đây loại hocmon steroid có khối lượng phân tử nhỏ kho¶ng 300 có cấu trúc gồm vòng tổng hợp từ cholesterol Các hocmon steroid khác nhánh nhóm chức bên khác kiểu cầu nơi 119 vịng khác Sự khác giúp nhận biết thụ cảm thể khác màng tế bào đích b Hocmon steroid kích hoạt phiên mã - Nghiên cứu ảnh hưởng hormon steroid phương pháp chụp ảnh phóng xạ cho thấy: phức hợp protein tiếp nhận với hocmon tích luỹ nhanh chóng nhân tế bào đích Phát G.Tomkins cộng chuột B.W.O’Malley gà chøng tá vai trị hoạt hóa phiên mã phức hợp protein tiếp nhận với hocmon gen hoc b gen c thự (hình 12.8) Có chế tác động: + Phc hp gia protein tip nhn với hocmon bọc lấy trình tự DNA đặc thù nằm vùng điều khiển cis-acting gen g©y hoạt hóa phiên mã gen mục tiêu Hình 12.8 Mơ hình tác động hocmon steroid đến trình biểu gen 120 + Một giả thuyết khác cho phức hợp protein tiếp nhận với hocmon tương tác với protein khác không thuộc loại histon nhiễm sắc thể, protein có mặt nhiễm sắc thể tế bào mục tiêu, tác động trực tiếp vào phân tử DNA - Quá trình tương tác kích ho¹t phiên mã xác mét số gen định C c ch nêu trên, phức hợp có chức hoạt hóa phiên mã, giống với chế kích hoạt phiên mã phức hợp CAP-cAMP prokaryote - Hiện có nhiều nghiên cứu cho rằng: phức hợp hocmon-protein tiếp nhận kích hoạt hóa biểu gen, cách tương tác trực tiếp với đoạn DNA đặc thù tồn nội vi vùng enhancer promoter, để điều khiển trình phiên mã gen mục tiêu c Hormon glucocorticoid hoạt hóa gen thơng qua nhân tố enhancer - Nhiều nghiên cứu kết luận hormon glucocorticoid có tác dụng kích ho¹t, làm tăng hàm lượng đường máu, cịn hormon estrogen kích thích phát triển kiểu hình cđa giới tính Ở động vật có vú, có số lượng lớn hormon steroid khác sản sinh ra, chúng có tác dụng kích thích hàng loạt thay đổi trao đổi chất tế bào mô khác Thường steroid định, có hiệu khác lên kiểu tế bào khác Mặc dù chế tác động chúng chưa sáng tỏ, nhiên dạng hormon kiểu đại diện glucocorticoid (cortisol) estrogen (β-estradiol) thường có tác dụng làm hoạt hóa gen mục tiêu đặc thù, thông qua mối tương tác protein với trình tự điều hịa cis-acting Trình tự cis-acting thường gọi enhancer, dạng enhancer khác so với enhancer kinh điển chúng có ảnh hưởng đến trình phiên mã từ cạnh đoạn promoter, phức hợp protein tiếp nhận vơí hormon bọc vào chúng 121 - Cơ chế tác động hormon sau: Đầu tiên hormon bọc lấy protein tiếp nhận có mặt tế bào chất tế bào mục tiêu Phức hợp protein tiếp nhận - hormon sau tích lũy nhân tế bào bọc lấy trình tự DNA đặc thù gọi nhân tố phản ứng glucocorticoid (GREs, glucocorticoid response elements) Khi hormon protein tiếp nhận kết hợp với protein khác tế bào chất có lực bọc yếu với DNA Nhiều chứng cho thấy protein tế bào chất ngăn cản không cho protein tiếp nhận hình thành lên thể đối xứng (dimer), mà thể coi dạng bọc DNA hoạt hóa Q trình bọc hormon có tác dụng làm thay đổi hình thù protein tiếp nhận, ®ã khơng bọc lấy protein tế bào chất Kết làm cho protein tiếp nhận chuyển thành thể đối xứng, dạng hoạt hóa Hình 13.8 Điều hịa hoạt động gen hocmon Glucocorticoid - Phức hợp protein tiếp nhận với hormon glucocorticoid làm hoạt hóa q trình phiên mã gen mục tiêu, cách bọc lấy trình tự GRE enhancer, nằm gần gen (hình 13.8) Kết làm hoạt hóa promoter gen mục tiêu lân cận Việc bọc phức hợp protein tiếp nhận với hocmon vào enhancer tạo cho promoter trạng thái mở, giúp cho RNA polymerase gắn vào promoter trình phiên mã xẩy Cơ chế tương tự số chế làm tăng trình tháo xoắn sợi đơn DNA vùng promoter - Kiểu điều hịa cịn có liên quan đến nhân tố phản ứng với hormon Nhân tố bọc lấy phức hợp protein tiếp nhận với hocmon steroid, từ làm kích hoạt số gen tương ứng với hormon Các nhân tố phản ứng có chứa trình tự DNA 122 khác Thí dụ nhân tố phản ứng tương ứng với hormon glucocorticoid, estrogen thyroid đoạn DNA có trình tự sau: 5’-GGTACANNNTGTTGT3’; 5’-GGTCANNNTG(A/T)CC -3’ 5’-CAGGGACGTGACCGCA-3’ Thật thú vị so sánh trình tự amino axit protein tiếp nhận hormon steroid khác phát thấy chúng biểu có tổ chức giống Vùng đầu N protein chịu trách nhiệm hoạt hóa biểu gen, phức hợp protein nhn vi hormon bc đợc vo trỡnh t nhõn t phản ứng hocmon thích hợp vùng enhancer Vùng potein tiếp nhận thường biến động nhiều, để đảm bảo hormon khác hoạt hóa cho gen khác Vùng trung tâm protein tiếp nhận chứa tụ điểm bọc DNA, có mức độ ổn định cao, có 42 - 94% amino axit tương đồng cặp protein khác Vùng đầu C protein tiếp nhận chứa tụ điểm bọc lấy hormon có tính ổn định trung bình, với 15 - 57% axit amin tương đồng Vì tất hormon nhóm steroid chứa nhân cholesterol cịn nhóm bên cạnh khác - Như rõ hormon steroid định hoạt hóa biểu gen mục tiêu định, ®èi víi mét loại mơ c thự định Vy ti gen mc tiờu lại không hoạt động tất mơ, tế bào kh¸c có hormon Liệu có phải protein tiếp nhận tổng hợp tế bào mô mục tiêu hay không Nếu điều khiển trình biểu gen mã hoá protein tiếp nhận Nếu protein tiếp nhận có mặt tất tế bào lại hoạt động số tế bào định Nếu giả sử bị bất hoạt phối hợp với protein khác protein lại không tồn tế bào mục tiêu Nếu chúng có mặt lại bắt protein tiếp nhận trạng thái bất hoạt tế bào mục tiêu Tất vấn đề cần phải làm sáng tỏ d Hormon ecdysone băng phồng nhiễm sắc thể ruồi - Ecdysone hocmon thuộc nhóm steroid Ở nhiễm sắc thể tuyến nước bọt khổng lồ số loài ruồi thuộc họ diptera ruồi dấm Chironomus tentans, người ta phát thấy số băng nhiễm sắc thể có trải qua q trình thay đổi hình thái đáng ý thời điểm đặc biệt trình phát triển Những băng từ lan rộng nơi thành cấu trúc nhuộm màu gọi puff (cấu trúc phồng lên) Hiện tượng gọi tượng làm phồng nhiễm sắc thể (puffing) Mỗi băng phồng đại diện cho đoạn nhiễm sắc thể, trạng thái giãn rộng nhất, làm tăng trình phiên mã gen chứa Bằng phương pháp lai insitu người ta thấy băng phồng chứa trình tự DNA bổ sung với trình tự RNA mRNA tổng hợp tế bào (h×nh 14.8) 123 Hình 14.8 Sơ đồ mô tả tác động ecdysone làm phồng nhiễm sắc thể gây hoạt hoá gen ấu trùng ruồi dấm - Trong trình phát triển ruồi hormon ecdysone tiết kích thích rụng lơng ruồi, người ta thấy nhiễm sắc thể nước bọt có chỗ phồng lên Nếu ấu trùng ruồi xử lý ecdysone giai đoạn phát triển trước thời kỳ rụng lơng Thì tượng phồng nhiễm sắc thể xảy giống hệt với trình rụng lơng tự nhiên Mơ hình kích ho¹t hocmon ecdysone làm phồng thành chuỗi chứng tỏ hiệu hocmon steroid lên biểu gen Một thí nghiệm khác tiến hành D.melanogaster cho thấy: trước xử lý có số băng phồng bị thối hóa, sau xử lý vịng phút số băng phồng hình thành Những băng phồng ban đầu bị thối hóa vịng vài sau khoảng 100-125 băng phồng lại xuất Bằng việc sử dụng chất ức chế tổng hợp protein cycloheximide cho thấy: trình hình thành băng phồng muộn có liên quan dến trình tổng hợp số protein sau xử lý ecdysone Tuy nhiên, băng phồng hình thành sớm lại khơng cần đến việc tổng hợp protein Điều chứng 124 tỏ việc tạo thành băng phồng xử lý ecdysone, xúc tiến protein mã hóa gen hoạt hố nằm băng phồng hình thành sớm (hình 14.8) Đây chứng giải thích định trước chương trình hoạt hóa gen cđa sinh vËt Điều hòa cách cắt ghép xen kẽ giai ®o¹n tiền phiên mã - Hình thức cắt nối exon để tạo tiền mRNA gen có ảnh hưởng đến q trình điều hịa hoạt động gen, (hình 15.8 16.8) kt qu ct ghộp khỏc tạo mRNA chín dài ngắn khác gõy nờn điều hòa gen Hỡnh 15.8 S cỏc kiểu cắt ghép tiền mRNA tao mRNA khác phôi nhộng ruồi dấm gây nên điều hồ biểu gen - Thí dụ tiền phiên mã gen Antennapedia ruồi giấm (Antp) trải qua trình cắt ghép xẩy phơi nhộng (pupae) có khác Hiện tượng cịn phát thấy trường hợp gen Tropomyosin ruồi giấm động vật có xương sống 125 Hình 16.8 Sơ đồ intron-exon gen tropomyosine (tmII tmI) ruồi dấm Các số thứ thự exon, tmII có 17, tmI có Các số như: 1-38, 81-125 số thứ tự axit amin mà exon dịch mã có Ở mơ khác phiên mã thành mRNA tropomyosin khác Chữ viết tắt mtm mRNA cơ; ctm tế bào khung xương (cytoskeletal); Scm supercỏntactile muscle Tropomyosin gia đình gồm nhiều protein tương đồng, có tác dụng làm trung gian cho phản ứng actin tropomiosine, giúp nối kết điều hịa Những mơ khác nhau, kể mơ khơng phải mơ có đặc tính tồn nhiều dạng tropomyosin đồng đẳng khác Vì gen tạo nhiều dạng tropomyosine khác nhau, hình thức cắt ghép tiền mRNA khác sinh 10 Điều hòa chu kỳ phức biểu gen sinh vật nhân thật - Kiểu điều hòa R.J.Britten, E H Davidson đề xuất dạng mơ hình (h×nh 17.8) - Dạng mơ hình (a) cho chế điều hòa gen cấu trúc tiến hành cách tổng hợp, gen điều hịa có độ lặp lại với tần số vừa Theo mơ hình gen cảm nhận đặc thù đại diện cho vị trí bọc trình tự đặc thù (giống với vị trí bọc CAPcAMP E.coli Lac promoter), phản ứng với dấu đặc thù (thí dụ phức hợp hocmon với protein tiếp nhận) Khi gen cảm nhận (sensor gene) nhận đựợc tín hiệu thích hợp chúng sÏ hoạt hố q trình phiên mã gen tổng hợp lân cận Sản phẩm gen tổng hợp sau tương tác với gen tiếp nhận phương thức đặc thù trình tự Britten Davidson cho sản phẩm gen tổng hợp RNA hoạt hóa, chúng tương tác trực tiếp với gen tiếp nhận để kích hoạt phiên mã gen sản xuất kề (tương tự gen cấu trúc operon sinh vật tiền nhân) Tuy vậy, hai ông chưa rõ sản phẩm gen tổng hợp hoạt động RNA hay protein Những nghiên cứu khác, so sánh mức độ phức tạp quần thể RNA, nhân không (hnRNA, heterogeneous nuclear RNA) với quần thể mRNA chín, nhiều kiểu tế bào mơ khác thấy quần thể hnRNA hầu hết trường hợp thường có độ phức tạp (tức chứa nhiều đoạn xác định quần thể mRNA) 126 Hình 17.8 Mơ hình điều hồ biểu gen sinh vật nhân thật a) Hệ thống điều hoà dựa dư thừa gen thụ cảm b) hệ thống dựa dư thừa gen kết hợp S1,2,3 gen cảm ứng (sensor) đáp ứng lại loại tín hiệu khác nhau, phức hợp thụ cảm thể với hocmon Mơ hình sơ đồ hố kiện xẩy sau gen cảm ứng kích cò phiên mã gen kết hợp tương ứng I1, I2, I3 IA, IB, Ic Sản phẩm gen kết hợp RNAs họat hố từ vị trí tổng hợp truyền lan xung quanh đến bọc vào vị trí tác động gen thụ cảm Việc bọc RNA kích cị làm phiên mã gen tạo sản phẩm PA, PB, PC Tuỳ thuộc vào gen kết hợp gen cảm ứng hoạt hố, mà lµm một, 2, gen cấu trúc hoạt động 127 Hình 18.8 Điều hoà biểu gen mức phiên mã RNA sinh vật nhân thật a) phân lớn gen cấu trúc cho định vị đơn vị phiên mã hoạt động, chúng phiên mã liên tục tất tế bào I ký hiệu điểm bắt đầu phiên mã, trình tự đánh dấu a, a’, b trình tự lặp lại trung bình coi có liên quan đến điều hồ hoạt động gen Trình tự a’b’c’và d’là trình tự bổ xung với a, b, c, d tương ứng b) Biểu gen cấu trúc điều khiển vởi trình RNA lặp lại phiên mã đặc thù theo mơ có thành phần giống đơn vị phiên mã điều hồ tổng hợp(IRTUs) Q trình phiên mã IRTUs điều khiển nucleoprotein cảm thụ (SS) có khả phản ứng lại tín hiệu đặc thù bên IRTU khác phiên mã mô tế bào khác c) gen cấu trúc (CT) phiên mã thành mRNA biểu hình thành phức hợp thích hợp với phiên mã điều hoà tổng hợp (IRT) Bởi vậy, biểu gen cấu trúc tế bào địi hỏi có mặt IRT nhân Các loại tế bào khác có IRT chứa lượng lớn trình tự lặp lại chồng chéo, chúngcó thể phiên mã gen cấu trúc giống khác Tuy nhiên chưa có nghiên cứu bẻn chất phức tạp IRT - Kết chứng rỏ có trình điều hịa xảy sau phiên mã tạo RNA chín, giai đoạn từ hnRNA thành mRNA Từ ơng đề xuất mơ hình thứ gọi mơ hình “Davison-Britten” theo mơ hình trình biểu 128 gen điều khiển giai đoạn thành thục RNA (h×nh 18.8) Hầu hết gen cấu trúc nằm vùng đơn vị phiên mã cấu thành Chúng phiên mã mét mức độ tất tế bào Tuy nhiên, phiên mã thành thục tế bào có chứa điều hịa tổng hợp thích hợp Sau phiên mã tế bào đặc thù, điều hịa tổng hợp phải có mặt trước gen cấu trúc thành thục thành mRNA - Những điều hịa tổng hợp chứa trình tự lặp lại, trình tự tương tác với gen cấu trúc, giống chế tương tác gen tổng hợp lặp lại với gen tiếp nhận mơ hình Briten Davidson Sự khác mơ hình q trình điều hịa xảy sau phiên mã đến thnh thc RNA IV Bất hoạt gen công nghệ RNAi Hiện tượng bất hoạt gen RNA - Từ năm 1990 cơng nghệ chuyển gen ®· phát triển, người ta thấy có tượng sinh vật có nhiều copy chuyển nạp lại có tượng khơng tìm thấy sản phẩm protein copy gen phiên mã tạo số lượng lớn mRNA Không phải số lượng copy gen nhiều cho nhiều sản phẩm protein, có q trình làm ức chế q trình dịch mã Một gen biến nạp vào genome bị kìm hãm biểu gen nội tương đồng có cấu trúc chức Van der Krol et al 1990 Napoli et al 1990 gọi tượng đồng ức chế bất hoạt gen sau phiên mã (posttranscriptional gene silencing = PTGS) Hiện tượng phát nhiều loài sinh vật nhân thật, thực vật nấm men - Một quan sát khác chuyển gen mã hãa protein vỏ virus vào bình thường có mặt protein tạo cho tăng tính kháng virus Tuy nhiên, số trường hợp người ta thấy protein lạ virus không tổng hợp chuyển gen có khả kháng virus Thí dụ Lindo et al 1992 tiến hành chuyển gen mã hoá protein vỏ virus TEV gây bệnh thuốc vào thuốc Họ nhận thấy khơng tìm thấy protein vỏ tổng hợp biến nạp kháng với virus TEV Như người ta cho trường hợp mRNA đóng vai trò quan trọng việc gây bất hoạt virus khơng phải protein vỏ virus Tuy nhiên vai trị RNA chế gây bất hoạt gen sáng tỏ sau cơng trình cơng bố tạp chí Nature Fire Mello (1998) Theo họ chế gây bất hoạt gen có liên quan đến số RNA kép ngắn (dsRNAi), sợi sense antisense làm bất hoạt đoạn DNA gen tương đồng với 129 - Nội dung cơng trình dùng RNAi (RNA interference) bất hoạt gen tóm tắt sau: + Chỉ có RNA sợi kép (dsRNA) có khả gây bất hoạt gen tương đồng cách có hiệu quả, cịn RNA sợi đơn sense antisense có khả gây bất hoạt yếu khơng có khả gây bất hoạt + DsRNA gây bất hoạt cách đặc thù, phân huỷ mRNA có trình tự tương đồng với nó, cịn mRNA khác khơng tương đồng bình thường khơng bị ảnh hưởng + DsRNA gây bất hoạt cho mRNA tương đồng, thành thục (mature RNA) tế bào chất Những mRNA chứa intron đoạn promoter khơng bị bất hoạt q trình gây bất hoạt xẩy sau phiên mã tế bào chất + DsRNAi gây bất hoạt mRNA cách phân huỷ chúng + Khả phân huỷ mRNA dsRNAi cao, cần tế bào có vài phân tử dsRNA đủ khả phân huỷ hầu hết mRNA tương đồng Điêù chứng tỏ dsRNA nhân tác dụng chất xúc tác + Tác động dsRNA lan truyền từ mô sang mô khác trí cho sang hệ sau - Cơ chế hoạt động RNAi gây bất hoạt giảm hoạt hoá gen theo Hutvagner Zamore (2002) trình bầy đây: DsRNAi có chiều dài khoảng vài trăm bp cắt enzyme Dicer + ATP ↓ Tạo siRNA (small interfering RNA) có từ 21 – 23 bp ↓ Phức hợp RISC (RNA induced silencing complex) + ATP mở soắn siRNA kép ↓ Tạo siRNA sợi đơn bám vào mRNA đích, tương đồng với mRNA bị phân huỷ ↓ RNA dependent RNA polymerase (RdRP) ↓ Nhân siRNA Quá trình hoạt động RNAi gồm bước: dsRNA bị cát thành nhiều đoạn ngắn (siRNA) endonuclease gọi Dicer Sau sợi kép ngắn mở xoắn để tạo thành sợi đơn ngắn chúng sợi antisense Sợi antisense siRNA nạp vào phức hợp RISC antisense RNA phức hợp RISC tìm bắt cặp với với mRNA tương đồng liên kết hydro cặp bazơ RISC phân huỷ mRNA 130 Hiện người ta đề khả gây bất hoạt gen RNAi, xẩy nhân giai đoạn phiên mã (TGS) ngăn cản khởi động gen, điều chỉnh số lượng phân tử mRNA sau phiên mã (PTGS) tế bào chất giai đoạn sau phiên mã phân huỷ mRNA, ngăn cản khả tổng hợp protein Enzyme tổ chức tham gia vào trình gây bất hoạt gen RNAi - Enzyme Dicer thuộc nhóm ribonuclease III, có chức cắt dsRNAi thành đoạn dsRNA ngắn Theo Bernstein et al 2001 enzyme khơng có sinh vật tiền nhân - RISC tổ chức phức chứa protein thuộc họ argonaut, hoạt động enzyme endonuclease có vai trị cắt mRNA tương đồng sau RNAi ngắn(thường từ 21 – 23 bp) bắt cặp với mRNA Khả tương tác phức RISC với DNA (gen) với mRNA phụ thuộc vào mức độ tương đồng RNAi ngắn có RISC với DNA (gen) mRNA Khi tương tác với DNA, RISC tiến hành methyl hoá biến đổi mối tương tác DNA với protein Histone, dẫn đến làm tăng xoắn nhiễm sắc thể ngăn cản trình khởi ®éng phiên mã gen vùng Khi tương tác với mRNA, RISC tạo tín hiệu để Rnase phân huỷ mRNA - Enzyme methyl hố DNA (DNA methyltransferase) gắn nhóm methyl vào cytosine (C) ngăn cản trình phiên mã - Enzyme biến đổi nhóm chức protein histone nằm lõi nucleosome Ví dụ gắn thêm nhóm methyl khử nhóm acetyl số acid amine đặc hiệu protein histone làm thay đổi cấu trúc không gian sợi nhiễm sắc, ngăn cản trình phiên mã - RNA dependent RNA polymerase (RdRp) enzyme tổng hợp RNA khuôn RNA Ở số sinh vật, đặc biệt trồng, giun tròn nấm, enzyme đóng vai trị quan trọng việc tạo nên sợi dsRNA, trình tái tạo sợi RNA ngắn Hiện người ta khẳng định tế bào sinh vật nhân chuẩn, hệ thống RNAi máy sinh hố đóng vai trị quan trọng việc điều hồ hoạt hố gen bảo vệ thể RNAi làm câm gen giai đoạn phát triển khác cá thể, bước khác trình chuyển hố, phân hóa tế bào mơ, chí theo Hannon 2002, Mello Conte 2004, gây bất hoạt cho nhóm gen Các phương hướng sử dụng RNAi gây bất hoạt gen Hiện RNAi sử dụng phương pháp trị liệu gen có hiệu thơng qua số cách sau: 131 - Tiêm dsRNAi đặc thù vào mơ tế bào động vật nơi có chứa gen ung thư virus - Truyền dsRNAi qua đường ruột cách cho tuyến trùng ăn vi khuẩn E.Coli chuyển nạp gen RNAi có khả tạo dsRNAi - Bằng chuyển trực tiếp gen t¹o RNAi có khả sản sinh dsRNAi vào tế bào để bất hoạt gen đích - Bằng sốc giun trịn dung dịch có chứa dsRNAi Ngồi dsRNAi ngoại người ta phát thấy nội tế bào số tuyến trùng, ruồi dấm, chuột, nguời thực vật có tồn số RNA nội sinh nhỏ gọi microRNA (miRNA) Như có tên gọi RNAi khác tuỳ theo nguồn gốc xuất sứ chất gây bất hoạt gen chúng khơng khác Ứng dụng cơng nghệ RNAi - Dùng RNAi để kìm hãm tổng hợp số protein nhằm điều hoà phát triển thể theo ý muốn - Dùng công nghệ RNAi để bảo tồn ổn định cho genome cách làm bất hoạt gen nhẩy - Dùng RNAi làm tăng độ xoắn nhiễm sắc thể, ngăn chặn trình phiên mã - Dùng RNAi chống lại xâm nhập virus gồm thiết kế gen tạo dsRNAi tương đồng với RNA virus làm bất hoạt virus xâm nhập vào - Dùng RNAi nghiên cứu chức gen, dựa sở khả gây bất hoạt đặc thù - Hiện người có bán số kit dùng để trị liệu gen cho số bệnh di truyên sinh vật người V Tãm t¾t Việc kiểm tra di truyền trình phát sinh hình thái mổ xẻ bước chi tiết ruồi dấm caenorbabditis elegans Quá trình phát triển kiểm tra hàng loạt chuỗi gen điều hòa, gen hoạt động thời điểm xác định làm kích cị biểu gen chuỗi Sự điều hoà biểu gen thực chất điều hồ q trình phiên mã dịch mã, đảm bảo hoạt động sống tế bào xảy cách hài hòa Do cấu trúc tế bào gen sinh vật tiền nhân nhân thật khác nhau, nên chế điều hòa khác Ở sinh vật tiền nhân, mục tiêu điều hòa biểu gen giúp cho tế bào thích ứng trực tiếp với tác nhân lý hóa biến động mơi trường Cơ chế điều hịa thực thơng qua operon Có 132 loại operon operon cảm ứng kìm hãm phiên mã, operon bao gồm nhóm trình tự: 1/ Trình tự huy điều hoà phiên mã, 2/ Hàng loạt trình tự mã hố tạo protein tham gia vào q trình chuyển hố Các trình tự chịu huy điều hồ nhóm trình tự thứ Ở sinh vật tiền nhân điều hoà chủ yếu xẩy giai đoạn phiên mã Đối với sinh vật nhân thật mục tiêu điều hoà nhằm hướng cho tế bào mô vào chương trình phát triển chung tồn thể Cơ chế điều hoà đa dạng thể nhiều mức độ khác như: 1/ Điều biến phiên mã thông qua enhancer silencer, 2/ Methyl hoá DNA, 3/ Biến đổi cấu trúc DNA từ dạng B-DNA thành dạng Z-DNA, 4/ Biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể, 5/ Thông qua hocmon, 6/ Điều hồ thơng qua cắt ghép tiền mRNA 7/ Điều hoà chu kỳ phức 8/ Mới việc phát vai trò RNAi gây bất hoạt gen đích Tất chế nhằm: • Tạo thuận lợi cho trình phiên mã số trình tự huy cấu trúc • Điều hồ giai đoạn phiên mã thơng qua tương tác DNA-protein protein với protein, • Ở giai đoạn phiên mã thông qua tượng ghép nối khác biệt v cui cựng là: ã Trong giai on dch mó sau dịch mã, liên quan đến chế biến đổi cấu trúc protein enzyme 133 ... hịa sinh vật nhân thật 111 - Khác so với prokaryote tín hiệu chế điều hịa - Tín hiệu điều hoà thể đa bào phân tử tế bào chuyên biệt sản sinh theo thể dịch lưu chuyển khắp thể - Các phân tử tác... tạo c¸c enzyme Khi có mặt phân tử hiÖu ứng thêm vào, phân tử phản ứng kết hợp với protein điều hoà, tạo thành phức hợp protein điều hoà-chất đồng ức chế (repressor-co-repressor) Phức hợp có khả... thích ứng cách sản sinh loại enzyme β-galactosidase (gen Z) β-galactoside permease (gen Y) β-galactoside transacetylase (gen A) - Enzyme β-galactosidase enzyme xúc tác cho phản ứng phân giải đường