hiện tượng nếu trong sinh vật cú nhiều bản copy được chuyển nạp thỡ lại cú hiện tượng khụng tỡm thấy sản phẩm protein mặc dự cỏc bản copy của gen đú vẫn phiờn mó tạo ra số lượng lớn mRNA. Khụng phải số lượng copy của một gen càng nhiều thỡ càng cho nhiều sản phẩm protein, như vậy đó cú một quỏ trỡnh nào đú làm ức chế quỏ trỡnh dịch mó. Một gen được biến nạp vào genome cú thể bị kỡm hóm biểu hiện bởi một gen nội tại tương đồng cú cựng cấu trỳc và chức năng. Van der Krol et al 1990 và Napoli et al
1990 gọi đõy là hiện tượng đồng ức chế hay là sự bất hoạt gen sau phiờn mó (post- transcriptional gene silencing = PTGS). Hiện tượng này được phỏt hiện ở nhiều loài sinh vật nhõn thật, thực vật và nấm men.
- Một quan sỏt khỏc khi chuyển gen mó hóa protein vỏ virus vào cõy bỡnh thường sự cú mặt của protein này sẽ tạo cho cõy tăng được tớnh khỏng virus. Tuy nhiờn, trong một số trường hợp người ta thấy protein lạ của virus khụng được tổng hợp nhưng cõy được chuyển gen vẫn cú khả năng khỏng được virus đú. Thớ dụ Lindo et al 1992 đó tiến hành chuyển gen mó hoỏ protein vỏ của virus TEV gõy bệnh trờn cõy thuốc lỏ vào cõy thuốc lỏ. Họ nhận thấy mặc dự khụng tỡm thấy protein vỏ được tổng hợp trong cõy nhưng cõy biến nạp vẫn khỏng được với virus TEV. Như vậy người ta cho rằng trong những trường hợp này mRNA đúng vai trũ quan trọng trong việc gõy bất hoạt virus chứ khụng phải là protein vỏ virus. Tuy nhiờn vai trũ của RNA và cơ chế gõy bất hoạt gen chỉ được sỏng tỏ sau cụng trỡnh cụng bố trờn tạp chớ Nature của Fire và Mello (1998). Theo họ cơ chế gõy bất hoạt gen này cú liờn quan đến một số RNA kộp ngắn (dsRNAi), cả 2 sợi sense và antisense đều cú thể làm bất hoạt được đoạn DNA gen tương đồng với nú.
- Nội dung của cụng trỡnh dựng RNAi (RNA interference) bất hoạt gen cú thể túm tắt như sau:
+ Chỉ cú RNA sợi kộp (dsRNA) mới cú khả năng gõy bất hoạt gen tương đồng một cỏch cú hiệu quả, cũn RNA sợi đơn cả sense và antisense chỉ cú khả năng gõy bất hoạt yếu hoặc khụng cú khả năng gõy bất hoạt.
+ DsRNA gõy bất hoạt một cỏch rất đặc thự, nú chỉ phõn huỷ một mRNA cú trỡnh tự tương đồng với nú, cũn cỏc mRNA khỏc khụng tương đồng thỡ vẫn bỡnh thường khụng bị ảnh hưởng.
+ DsRNA chỉ gõy bất hoạt cho những mRNA tương đồng, thành thục (mature RNA) và đó ra ngoài tế bào chất. Những mRNA nào cũn chứa intron hoặc đoạn promoter thỡ khụng bị bất hoạt và quỏ trỡnh gõy bất hoạt này xẩy ra sau phiờn mó trong tế bào chất. + DsRNAi gõy bất hoạt mRNA bằng cỏch phõn huỷ chỳng.
+ Khả năng phõn huỷ mRNA của dsRNAi rất cao, chỉ cần trong tế bào cú vài phõn tử dsRNA sẽ đủ khả năng phõn huỷ được hầu hết cỏc mRNA tương đồng. Điờự này chứng tỏ dsRNA cú thể được nhõn bản hoặc tỏc dụng như một chất xỳc tỏc.
+ Tỏc động của dsRNA cú thể được lan truyền từ mụ này sang mụ khỏc hoặc thậm trớ cú thể được cho sang thế hệ sau
- Cơ chế hoạt động của RNAi gõy bất hoạt hoặc giảm hoạt hoỏ gen theo Hutvagner và Zamore (2002) cú thể trỡnh bầy dưới đõy:
DsRNAi cú chiều dài khoảng vài trăm bp được cắt bởi enzyme Dicer + ATP ↓
Tạo ra cỏc siRNA (small interfering RNA) cú từ 21 – 23 bp ↓
Phức hợp RISC (RNA induced silencing complex) + ATP sẽ mở soắn siRNA kộp ↓
Tạo ra cỏc siRNA sợi đơn sẽ bỏm vào mRNA đớch, tương đồng với nú và mRNA bị phõn huỷ
↓
RNA dependent RNA polymerase (RdRP) ↓
Nhõn siRNA mới
Quỏ trỡnh hoạt động RNAi gồm cỏc bước: dsRNA bị cỏt thành nhiều đoạn ngắn (siRNA) bởi một endonuclease gọi là Dicer. Sau đú sợi kộp ngắn này được mở xoắn để tạo thành 2 sợi đơn ngắn và một trong chỳng là sợi antisense. Sợi antisense của siRNA được nạp vào phức hợp RISC và antisense RNA trong phức hợp RISC tỡm và bắt cặp với với những mRNA tương đồng bằng liờn kết hydro giữa cỏc cặp bazơ rồi RISC sẽ phõn huỷ mRNA.
Hiện nay người ta đề ra 2 khả năng gõy bất hoạt gen của RNAi, xẩy ra trong nhõn giai đoạn phiờn mó (TGS) ngăn cản khởi động gen, điều chỉnh số lượng phõn tử mRNA và sau phiờn mó (PTGS) trong tế bào chất giai đoạn sau phiờn mó phõn huỷ mRNA, ngăn cản mất khả năng tổng hợp protein
2. Enzyme và tổ chức tham gia vào quỏ trỡnh gõy bất hoạt gen bằng RNAi
- Enzyme Dicer thuộc nhúm ribonuclease III, cú chức năng cắt dsRNAi thành cỏc đoạn dsRNA ngắn. Theo Bernstein et al. 2001 thỡ enzyme này khụng cú ở sinh vật tiền nhõn. - RISC là một tổ chức phức chứa ớt nhất một protein thuộc họ argonaut, hoạt động như một enzyme endonuclease và cú vai trũ cắt mRNA tương đồng sau khi RNAi ngắn(thường từ 21 – 23 bp) bắt cặp được với mRNA đú. Khả năng tương tỏc của phức RISC với DNA (gen) hoặc với mRNA phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa RNAi ngắn cú trong RISC với DNA (gen) và mRNA. Khi tương tỏc với DNA, RISC tiến hành methyl hoỏ và biến đổi mối tương tỏc giữa DNA với protein Histone, dẫn đến làm tăng sự xoắn của nhiễm sắc thể và ngăn cản quỏ trỡnh khởi động phiờn mó gen ở vựng đú. Khi tương tỏc với mRNA, RISC tạo tớn hiệu để Rnase phõn huỷ mRNA.
- Enzyme methyl hoỏ DNA (DNA methyltransferase) gắn nhúm methyl vào cytosine (C) ngăn cản quỏ trỡnh phiờn mó.
- Enzyme biến đổi nhúm chức của protein histone nằm trong lừi nucleosome. Vớ dụ như gắn thờm nhúm methyl hoặc khử nhúm acetyl của một số acid amine đặc hiệu trờn protein histone làm thay đổi cấu trỳc khụng gian của sợi nhiễm sắc, ngăn cản quỏ trỡnh phiờn mó.
- RNA dependent RNA polymerase (RdRp) là enzyme tổng hợp RNA trờn khuụn RNA. Ở một số sinh vật, đặc biệt là cõy trồng, giun trũn và nấm, enzyme này đúng vai trũ quan trọng trong việc tạo nờn cỏc sợi dsRNA, cũng như quỏ trỡnh tỏi bản tạo ra cỏc sợi RNA ngắn. Hiện nay người ta đó khẳng định rằng ở tế bào sinh vật nhõn chuẩn, hệ thống RNAi là một bộ mỏy sinh hoỏ đúng vai trũ quan trọng trong việc điều hoà hoạt hoỏ gen và bảo vệ cơ thể. RNAi cú thể làm cõm gen ở cỏc giai đoạn phỏt triển khỏc nhau của cỏ thể, hoặc cỏc bước khỏc nhau trong quỏ trỡnh chuyển hoỏ, phõn húa tế bào và mụ, thậm chớ theo Hannon 2002, Mello và Conte 2004, nú cú thể gõy bất hoạt cho cả một nhúm gen.
3. Cỏc phương hướng sử dụng RNAi gõy bất hoạt gen
Hiện nay RNAi được sử dụng như là một phương phỏp trị liệu gen rất cú hiệu quả thụng qua một số cỏch sau: