Phúc trình thực tập nuôi cấy mô và tế bào thực vật Họ và Tên: Lưu Hoàng Đệ MSHV: M0514008 BÀI 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ 1. Mục đích Giúp học viên làm quen với các thao tác và thiết bị trong phòng nuôi cấy mô, đồng thời giúp biết cách pha chế môi trường nuôi cấy. 2. Dụng cụ và hóa chất a. Dụng cụ - Ca nhựa dung tích 1 lít. - Ống định mức dung tích một lít. - Ống đong dung tích 100 ml, 10 ml. - Micropipette. - Cân điện tử. - Đũa thủy tinh. - Bếp điện từ hoặc lò vi sóng. - Dụng cụ đo pH. - Cốc đong 100 ml. - Lọ cấy, dây thun, túi nilon trong. - Máy khử trùng nhiệt ướt. b. Hóa chất - Dung dịch stock Macro MS1, MS2, MS3. - Dung dịch stock Micro MS, FeEDTA. - Các Vitamin B3, B1, B6. - Chất điều hòa sinh trưởng NAA (1mg/ml), BA (0.5mg/ml). - Đường Sucrose, Agar. - Dung dịch chuẩn pH gồm NaOH và HCl. 3. Các bước tiến hành pha chế môi trường nuôi cấy Khi đã có dung dich gốc (stock solutions) ta tiến hành pha chế môi trường nuôi cấy MS. Đầu tiên ta dùng ca nhựa có dung tích 1 lít cho vào trước 500ml nước cất, cân đúng 30g đường sucrose cho vào ca nhựa và khoáy cho đường tan hết. Tiếp theo chúng ta sẽ cho vào lần lượt 100ml từng dung dịch khoáng đa lượng (Macro MS) MS1, MS2, MS3 từ dung dịch gốc (stock solutions). Cho vào tiếp lần lượt 10ml dung dịch khoáng vi lượng (Micro MS) và 10ml dung dịch FeEDTA, ngoài ra môi trường cần bổ sung một số Vitamin nên chúng ta cần cho thêm các Vitamin B3 (Nocotinic acid), Vitamin B1 (Thyamine) và Vitamin B6 (Pyridoxine) mỗi loại với lượng 1mg/l (dùng micropipette lấy 1ml trong dung dịch gốc có nồng độ 1mg/ml). Đối với môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thì ta thêm vào môi trường 1ml NAA (nồng độ 1mg/ml) và 2ml BA (nồng độ 0,5 mg/ml). Sau đó chuyển toàn bộ hỗn hợp sang ống định mức có dung tích là 1 lít, Phúc trình thực tập nuôi cấy mô và tế bào thực vật Họ và Tên: Lưu Hoàng Đệ MSHV: M0514008 cho thêm nước cất vào cho đủ 1lít môi trường. Sau đó cho môi trường trở về ca nhựa để tiện trong việc pha Agar và chuẩn pH. Cân đúng 8g Agar cho vào ca nhựa khoáy đều và tiến hành đo pH (sử dụng dung dịch NaOH và HCl để chuẩn pH) đưa pH của môi trường về 5.8. Sau khi đã chuẩn pH môi trường xong ta tiến hành nấu môi trường để hòa tan Agar, có thể nấu môi trường trên bếp điện hoặc dùng lò vi song trong vòng vài phút đến khi môi trường sôi và Agar đã hòa tan hoàn toàn, lưu ý thêm một ít nước cất vào môi trường trong lúc nấu để bù lại lượng nước bay hơi. Sau khi môi trường được nấu xong, ta tiến hành chia môi trường vào các lọ cấy, mỗi lọ ta cho vào khoảng 40 ml môi trường, dùng túi nilon trong đậy kín miệng lọ cấy và cố định túi nilon bằng 3 sợi dây thun. Cuối cùng ta cho các lọ cấy đã có môi trường vào máy khử trùng nhiệt ướt để khử trùng môi trường. 4. Kết luận Môi trường nuôi cấy rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy vì thế cần lưu ý pha chế môi trường nuôi cấy cẩn thận, đảm bảo đầy đủ về thành phần và chính xác về hàm lượng các chất dinh dưỡng (đa lượng, vi lượng, nguồn Carbon), chất điều hòa sinh trưởng (nếu có), Agar, Một yếu tố không kém phần quan trọng đó là pH của môi trường, chúng ta cần đưa pH về 5.8. pH không chỉ ảnh hưởng đến khả năng hòa tan các chất khoáng mà còn ảnh hưởng đến đặc tính của Agar nếu pH <5.5 thì Agar không đông tụ mà ở dạng gel, pH >6.0 thì Agar trở nên cứng. Ngoài ra, pH còn ảnh hưởng đến hoạt tính của các chất điều hòa sinh trưởng, các chất điều hòa sinh trưởng sẽ bị mất hoạt tính nếu pH quá acid hoặc quá kiềm. . tập nuôi cấy mô và tế bào thực vật Họ và Tên: Lưu Hoàng Đệ MSHV: M0 514 008 BÀI 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ 1. Mục đích Giúp học viên làm quen với các thao tác và thiết bị trong. tích 1 lít. - Ống định mức dung tích một lít. - Ống đong dung tích 10 0 ml, 10 ml. - Micropipette. - Cân điện tử. - Đũa thủy tinh. - Bếp điện từ hoặc lò vi sóng. - Dụng cụ đo pH. - Cốc đong 10 0. Vitamin B3 (Nocotinic acid), Vitamin B1 (Thyamine) và Vitamin B6 (Pyridoxine) mỗi loại với lượng 1mg/l (dùng micropipette lấy 1ml trong dung dịch gốc có nồng độ 1mg/ml). Đối với môi trường nuôi