Đề tài Sản xuất chế phẩm Enzym Amylase từ môi trường lỏng

Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 1 LỜI NÓI ĐẦU Enzyme giữ vai trò cực kì quan trọng trong ngành công nghệ sinh học hiện đại, hiện nay việc sản xuất và ứng dụng các chế phẩm enzym đang phát triển rất mạnh mẽ. Nước ta là một nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Vì thế ngành công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym và ứng dụng chúng ở nước ta hiện nay rất phát triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Với đề tài: “Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng”, thuộc môn Công nghệ Lên Men Thực Phẩm, đây là đề tài rất thú vị và phù hợp với xu thế phát triển hiện nay của ngành công nghiệp enzyme, nhờ sự chỉ dẫn tận tình của quý thầy cô thuộc Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, mà đặc biệt là thầy Lê Văn Việt Mẫn, chúng tôi đã hoàn thành đề tài này. Trong quá trình thực hiện đề tài, không tránh khỏi thiếu sót, kính mong sự góp ý của thầy và để chúng tôi có thêm kinh nghiệm cho các bài báo cáo tiếp theo, và luận văn sau này. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 2 MỤC LỤC 1. GIỚI THIỆU CHUNG 4 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 4 2.1 Định nghĩa 4 2.2 Phân loại 4 2.2.1 α – amylase 5 2.2.2 β – amylase 7 2.2.3 Glucoamylase 8 2.2.4 Một số amylase khác 10 3. NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE 12 3.1 Thu nhận enzyme từ nguồn thực vật 12 3.2 Thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật 13 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG 13 A. Sơ đồ quy trình công nghệ 14 B. Giải thích quy trình 15 4.1 Chọn giống vi sinh vật 15 4.2 Nhân giống vi sinh vật 16 4.2.1 Môi trường nhân giống 16 4.2.2 Phương pháp và điều kiện nhân giống 16 4.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống 17 4.2.4 Thiết bị nhân giống 17 4.3 Chuẩn bị môi trường lên men 18 4.4 Tiệt trùng môi trường 19 4.4.1 Mục đích 19 4.4.2 Những biến đổi trong quá trình tiệt trùng 19 4.4.3 Thiết bị 19 4.5 Lên men sinh tổng hợp enzyme 20 4.5.1 Mục đích 20 4.5.2 Các biến đổi xảy ra trong quá trình lên men 20 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 21 4.5.4 Thiết bị 22 4.6 Ly tâm thu nhận chế phẩm enzyme thô 24 4.7 Tách và tinh sạch enzyme 25 4.7.1 Siêu lọc 25 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel 27 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 3 4.8 Sấy 32 5. CHẾ PHẨM AMYLASE 34 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp 34 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme 35 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại 35 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 38 6 α – amylase Bacillus subtilis 38 6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương pháp nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm 43 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 4 1. GIỚI THIỆU CHUNG Hệ enzyme amylase là một trong những hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp thực phẩm, y học và nhiều lĩnh vực kinh tế quốc dân khác. Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về amylase nói riêng được bắt đầu từ những năm 1811 – 1814. Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi nhà bác học Nga – Viện sĩ K.S Kirhof. Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết malt nảy mầm và nhận thấy trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường. 19 năm sau, tức là vào năm 1833, hai nhà khoa học người Pháp Payen và Persoz đã tách được chất phân giải tinh bột thành đường từ dịch chiết malt, hai ông đã dùng rượu để kết tủa nó và thu được enzyme dưới dạng bột, đồng thời đặt tên nó là diastase. Sau này, theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột được gọi là amylase. Các enzyme amylase có trong nước bọt, dịch tiêu hóa của con người và động vật, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn. Hiện nay, người ta chủ yếu sản xuất amylase từ vi khuẩn và nấm mốc. Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm amylase và là cơ sở khoa học để áp dụng chúng trong sản xuất và đời sống, đồng thời cũng mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn đối với nền kinh tế quốc dân. 2. ĐỊNH NGHĨA – PHÂN LOẠI 2.1 Định nghĩa Amylase thuộc nhóm hydrolase, phân giải liên kết glycoside, enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử có chiều dài mạch ngắn hơn như dextrin, oligosaccharide, glucose, … 2.2 Phân loại Dựa theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, có thể chia amylase thành các loại sau: Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 5 2.2.1 α – amylase Hình 2.2.1.1: Cấu trúc không gian của α – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  α – amylase (α – 1,4 – glucan – 4glucanohydrolase) là một endo enzyme. Nó xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α – 1,4 – glycoside nằm bên trong phân tử của các cơ chất amylase, amylopectin và glycogen.  α – amylase được tìm thấy trong cơ thể của động vật, thực vật và tế bào vi sinh vật.  Tùy theo nguồn gốc mà phân tử lượng của enzyme sẽ thay đổi, thường dao động trong khoảng 45 – 60kDa. Có một số trường hợp đặc biệt như α – amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130kDa.  Tất cả các α – amylase đều là metalloenzyme. Người ta tìm thấy Ca 2+ trong phân tử enzyme với hàm lượng từ 1 – 30g.nguyên tử/1g.mol enzyme. Nếu chúng ta tách toàn bộ Ca 2+ ra khỏi α – amylase, enzyme sẽ bị vô hoạt.  Nhìn chung, tỷ lệ tryptophan và tyrosin trong phân tử của các amylase là khá cao. Riêng thành phần acid glutamic và acid aspartic có thể chiếm tới 25% trọng lượng phân tử. Ngoài thành phần protein, một số enzyme amylase từ nấm mốc còn có phân đoạn glucid có chứa mannose, xylose và hexosamine. Chức năng của thành phần glucid này hiện này còn chưa rõ.  Một đặc điểm cần lưu ý là hầu hết các α – amylase khá bền với các tác động của các protease như peppin, trypsin, papain, … Bảng bên dưới giới thiệu tính chất của 1 số chế phẩm α – amylase từ vi sinh vật. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 6 Bảng 2.2.1.1: Một số tính chất của α – amylase từ vi sinh vật (Fogarty, 1983) Tên vi sinh vật pH opt T opt Phân tử lượng (kDa) Bacillus acidocaldarius 3.5 75 68 Bacillus stearothermophilus 4.5 – 6.5 65 – 73 48 Bacillus subtilis 5.3 – 6.4 50 47 Acinetobacter sp.I 7.0 50 – 55 55 Acinetobacter sp.II 7.0 50 – 55 65 Bacteirodes amylophilus 6.3 43 92 Micrococcus halobius 6.0 – 7.0 50 – 55 89 Streptomyces hygroscopicus 5.0 – 6.0 50 – 55 48 Streptomyces aureofaciens 4.6 – 5.3 40 40 Thermonospora curvata 5.5 – 6.5 65 62 Aspergillus oryzae 5.5 – 5.9 40 52 Mucor pusillus 3.5 – 4.0 65 – 70 48 Lipomyces kononenkaae 5.5 40 38 Schwaniomyces castellii 6.0 60 40  Dựa trên quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose, người ta tạm thời chia α – amylase thành hai nhóm: enzyme dịch hóa và enzyme đường hóa. o α – amylase dịch hóa - Sản phẩm thủy phân tinh bột bởi các amylase dịch hóa chủ yếu là các dextrin. - Enzyme này thường được sử dụng trong giai đoạn đầu của quá trình thủy phân tinh bột, nhằm hỗ trợ cho quá trình hồ hóa và dịch hóa. o α – - α – oligosaccharide. - Tùy . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 7 ư α – Aspergillus oryzae ủy 2 (maltose 3 (maltotriose α – Bacillus subtilis thủy 6 (malitohexaose 9. α – amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae bền vững đối với acid hơn α – amylase của malt và vi khuẩn Bacillus subtilis. , tùy thủy α – thủy . 2.2.2 β – amylase Hình 2.2.1.2: Cấu trúc không gian của β – amylase  Đặc điểm và hoạt động:  β – amylase là một exo enzyme, thủy phân từ đầu không khử của mạch amylose, amylopectin và glycogen. Chúng phân cắt liên kết α – 1,4 – glycoside từ đầu không khử của mạch tinh bột tạo ra maltose (dạng β – anomeric).  Enzyme này không thủy phân được liên kết α – 1,6 – glycoside ở amylopectin nên sản phẩm cuối cùng thường gồm 50 – 60% maltose và β – dextrin.  β – amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể nhưng tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa, enzyme này vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca 2+ .  Điều kiện hoạt động:  β – amylase bền trong môi trường acid (kể cả pH 3 – 4), enzyme này hoạt động mạnh trong môi trường có pH 4.5 – 5.5.  β – amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, bị vô hoạt hoàn toàn dưới tác dụng của nhiệt độ 70 0 C, nhưng trong dịch nấu, t opt là 60 – 65 0 C. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 8 2.2.3 Glucoamylase Hình 2.2.1.3: Cấu trúc không gian của glucoamylase  Đặc điểm và hoạt động:  Glucoamylase ( – c ủy – – – amylase.  .  5 – 48 – bên dưới . Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 9 2.2.3.1: a glucoamylase t Gratreva, 1987) pH opt T opt ( o C) (kDa) pH Aspergillus awamori 4.5 60 83.7 – 88 3.7 Aspergillus niger 1 4.5 – 5.0 - 99 3.4 Aspergillus niger 2 4.5 – 5.0 - 112 4.0 Aspergillus oryzae 1 4.5 60 76 5.6 Aspergillus oryzae 2 4.5 50 38 5.6 Aspergillus oryzae 3 4.5 40 38 5.6 Aspergillus saitoi 4.5 - 90 3.9 Cephalosporium eichhorniae 4.2 45 – 62 26.85 - Lipomyces kononenkoae 4.5 50 81.5 6.1 Mucor rouxianus 1 4.6 55 59 8.4 Mucor rouxianus 2 5.0 55 49 8.4 Penicillium oxalicum 1 5.0 55 – 60 84 7.0 Penicillium oxalicum 2 4.5 60 86 7.45 Rhizopus delemar 4.5 40 100 - Rhizopus javanicis 5.0 – 5.2 - 48 7.5 – 8.0 Endomycopsis sp. 20-9 5.7 – 5.9 50 53 3.8 Endomyces JF 00111 4.8 – 5.0 - 55 4.8 – 5.5  Nhận xét: o Đa số các chế phẩm glucoamylase của vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc) và của mô động vật đều có pH tối ưu ở vùng acid: pH 3.5 – 5.5. Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 10 o T 0 opt của glucoamylase là 50 – 60 0 C, nhưng hầu hết các glucoamylase bị mất hoạt tính khi đun nóng trên 70 0 C. o So với α – amylase, glucoamylase bền acid hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu, acetone, không được bảo vệ bằng Ca 2+ . Bảng 2.2.3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến glucoamylase từ các nguồn vi sinh vật khác nhau Chỉ số Nguồn thu glucoamylase Rhizopus detemar Aspergillus niger pH opt 4.5 3.8 pH bảo đảm độ bền cho enzyme trong 1 ngày ở 30 0 C 3.5 – 8.0 2.2 – 7.5 Nhiệt độ cao nhất ( 0 C) mà enzyme có thể chịu được trong 15 phút ở pH 5.5 55 70 Điểm đẳng điện pI 7.4 6.5 2.2.4 Một số amylase khác Bên cạnh 3 loại amylase trên, các enzyme thủy phân liên kết nhánh cũng được sử dụng nhiều trong công nghiệpt thủy phân tinh bột. α – glucosidase thủy phân từ đầu không khử các liên kết α – 1,4 – glycoside và α – 1,6 – glycoside của các gốc glucopyranose để tạo ra α – D – glucose. Enzyme này thủy phân rất tốt đường đôi và các oligosaccharide, có tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong chuyển hóa syrup giàu maltose sang syrup giàu glucose. Enzyme thủy phân liên kết α – 1,6 – glycoside trong phân tử amylopectin, glycogen và một số polymer khác như pullulanase, exopullulanase, isomaltose. Enzyme này thường được sử dụng kết hợp với β – amylase, glucoamylase trong sản xuất một số sản phẩm syrup hay glucose với mục đích tăng hiệu suất thủy phân. Kể từ khi Robyt và Ackerman phát hiện amylase thủy phân tinh bột thành maltotetraose năm 1971, một số amylase của vi khuẩn đã được công bố có khả năng tạo ra các sản phẩm từ DP2 đến DP6. Hiện nay, các enzyme thủy phân tinh bột tạo các malto – oligosaccharide đang được quan tâm. Malto – oligosaccharide có tiềm năng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp hóa chất tinh khiết. Những sản phẩm từ DP2 đến DP6 đã được sử dụng trong việc chẩn đoán lâm sang để xác định sự có mặt của α – amylase. Những chất này đều tan rất tốt, tạo ra một dung dịch nhớt và là một thực phẩm tuyệt hảo cho trẻ sơ sinh cũng như người già. Tuy nhiên, giá thành của những sản phẩm này khá đắt do những khó khăn trong việc sản xuất chúng. [...]... macerans 4 SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG Trang 13 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng A Sơ đồ quy trình công nghệ Nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Giống VSV Tiệt trùng Nhân giống Cấy giống Lên men sinh tổng hợp enzyme Ly tâm Sinh khối Tách và tinh sạch enzyme Tạp chất Sấy Chế phẩm enzyme Trang 14 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng B... enzyme  Chế phẩm enzyme thô (dạng lỏng) : Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Chế phẩm enzyme thô  Chế phẩm enzyme kỹ thuật (dạng bột): - Là chế phẩm thô được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã được tách ra Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa một vài enzyme chủ yếu - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Sấy → Chế phẩm enzyme... thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 5 CHẾ PHẨM AMYLASE 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp  Trong sản xuất bánh mì:  Khả năng dextrin hóa: không được dưới 2000 hoạt độ/g đối với chế phẩm khô  Khả năng đường hóa: không được dưới 150 đơn vị hoạt độ/g đối với chế phẩm khô  Khả năng phân giải protein: không được dưới 7 đơn vị hoạt độ/g đối với chế phẩm khô  Độ nhiễm trong chế. .. cao) 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại  Chế phẩm α – amylase Hình 5.3.1: Chế phẩm α – amylase chịu nhiệt dạng lỏng Trang 35 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Nguồn gốc – Phạm vi ứng dụng của sản phẩm: o Được tạo thành từ loài Bacillus subtillis bằng phương pháp lên men chìm o Tùy theo mức độ chất lượng khác nhau mà nó có thể được ứng dụng trong thực phẩm hoặc trong... thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Trong công nghiệp thường dùng chế phẩm amylase dịch đặc có nồng độ chất khô lớn hơn 50%  Trong chăn nuôi: Trong chăn nuôi, các chế phẩm được dùng riêng rẽ hay phối hợp các enzyme khác với liều lượng nhỏ từ 0.01 – 0.3% lượng thức ăn  Trong y học: Các chế phẩm enzyme được dùng trong y học ở dạng bột màu trắng, tinh khiết, có hoạt độ cao 5.2 Các dạng chế phẩm. .. trong chế phẩm amiloirizin: không quá 150 bào tử  Trong sản xuất bia:  Chế phẩm enzyme không ảnh hưởng đến hương vị của bia, sự tạo bọt và độ ổn định của bọt  Chế phẩm chứa enzyme đều bền nhiệt trong quá trình nấu, nhiệt độ 45 – 700C  Trong chế phẩm, để tạo pH tối ưu thì phải có mặt của photphatase acid, pH tối ưu c ác enzyme trong chế phẩm trong khoảng 5.5 – 5.7  Trong sản xuất rượu:  Chế phẩm không... enzyme kỹ thuật  Chế phẩm enzyme tinh khiết: - Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Kết tủa → Sấy → Chế phẩm enzyme tinh khiết (mức độ tinh khiết không cao) - Canh trường lỏng → Ly tâm tách sinh khối → Cô đặc (chân không) → Tinh sạch bằng các phương pháp sắc ký (lọc gel/trao đổi ion/hấp phụ) → Sấy → Chế phẩm enzyme tinh khiết... thường thời gian nhân giống từ 30 – 36 giờ 4.2.4 Thiết bị nhân giống  Nhân giống giai đoạn phòng thí nghiệm: Sau khi chuẩn bị môi trường, tiến hành tiệt trùng môi trường ở 1210C trong 40 phút Môi trường sau khi tiệt trùng được lắc đều nhằm làm cho môi trường được tơi xốp và làm nguội đến nhiệt độ phòng Trang 17 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Hình 4.2.4.1: Máy lắc ổn... nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng  Amylase tạo maltotriose: Lần đầu tiên, Wako mô tả một exo – amylase từ Streptomyces griceus có khả năng thủy phân tinh bột từ đầu không khử, cho sản phẩm chủ yếu là maltotriose, không có glucose và maltose Gần đây, một số công bố về khả năng tạo maltosetriose của α – amylase từ chủng Bacillus subtilis với hàm lượng 56% Enzyme này không tác... mốc  Biến đổi hóa sinh: sự tổng hợp enzyme amylase  Biến đổi sinh học: sự gia tăng sinh khối Trang 20 Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men  Môi trường lên men:  Hàm lượng chất khô: Các chất hòa tan trong môi trường sẽ tạo nên một áp lực thẩm thấu Hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường càng lớn thì giá trị áp lực thẩm . Bacillus macerans. 4. SẢN XUẤT CHẾ PHẨM AMYLASE TỪ MÔI TRƯỜNG LỎNG Công nghệ lên men thực phẩm Chế phẩm amylase từ môi trường lỏng Trang 14 A. Sơ đồ. triển, trong đó hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Với đề tài: Sản xuất chế phẩm enzym amylase từ môi trường lỏng , thuộc môn Công. 5. CHẾ PHẨM AMYLASE 34 5.1 Yêu cầu chế phẩm enzyme amylase trong công nghiệp 34 5.2 Các dạng chế phẩm enzyme 35 5.3 Một số chế phẩm amylase thương mại 35 6. THÀNH TỰU CÔNG NGHỆ 38 6 α – amylase