B. Giải thích quy trình
4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc gel
Mục đích: tách các protein ra khỏi nhau để thu được enzyme tinh khiết.
Nguyên tắc
Phương pháp này được ứng dụng để tách hỗn hợp các chất dựa vào sự khác nhau về kích thước, hình dạng, cấu trúc không gian, phân tử lượng.
Quá trình triển khai sắc ký được thực hiện thông qua sự tương tác của 2 pha: - Pha tĩnh là các hạt gel có cấu trúc mở, chứa liên kết ngang tạo thành mạng lưới không gian ba chiều được nhồi cố định trong cột. Bên trong và bên ngoài hạt gel có các mao quản kích thước nhỏ. Cả cột gel được giữ cân bằng cách rửa qua dung dịch đệm.
- Pha động là hỗn hợp gồm dịch enzyme và các tạp chất hòa tan khác có kích thước phân tử khác nhau được pha trong dung dịch đệm.
Trang 28
Dung dịch mẫu chứa enzyme và các cấu tử hòa tan (pha động) có kích thước khác nhau được chạy qua cột. Những phân tử có kích thước lớn hơn kích thước lỗ mao quản của gel thì không thể đi vào bên trong hạt gel, vì thế chúng di chuyển trong khoảng không gian giữa các hạt. Những phân tử có kích thước nhỏ hơn thì có khả năng khuếch tán vào bên trong các hạt gel.
Một số điều kiện khi tiến hành lọc gel
Để tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel, ta cần phải loại được các protein tạp ra khỏi hỗn hợp.
Lựa chọn kích thước cột gel:
Để tinh sạch enzyme, người ta sử dụng những loại cột dài hơn 100 cm, tỷ lệ chiều dài và đường kính cột vào khoảng 2.5 – 10.0.
Lựa chọn loại gel:
Sephadex được sử dụng phổ biến nhất đối với quá trình chiết tách mà ở đó tốc độ chảy không phải là yếu tố quan trọng.
Lựa chọn kích thước hạt gel:
Thông thường, trong sắc ký lọc gel dùng để tinh sạch protein – enzyme, người ta thường chọn hạt gel có kích thước nhỏ. Kích thước nhỏ có thể khắc phục hiện tượng chảy tràn do trọng lực, chảy rối và tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha động và pha tĩnh.
Tuy nhiên, nếu gel có kích thước quá nhỏ, đặc biệt là các gel có cấu trúc mềm thì xuất hiện sự tăng áp suất trong quá trình sắc ký và dễ xảy ra hiện tượng đè nén cục bộ.
Lựa chọn dung dịch đệm chiết xuất:
Tùy theo độ ổn định của gel và các cấu tử cần chiết tách mà lựa chọn dung dịch đệm có pH thích hợp.
Thông thường, đối với gel dextran và polyacrylamide, pH ổn định trong khoảng 1 – 10. Gel agarose ổn định trong giới hạn pH 4 – 10.
Thể tích mẫu:
Thể tích mẫu chiếm khoảng 1 – 5% thể tích cột. Tốc độ dòng chảy qua gel:
Thông thường, đối với gel kích thước nhỏ, có thể điều chỉnh tốc độ chảy lên đến 15 – 25 ml/giờ.
Phương pháp thực hiện
Dùng cột sắc ký nhồi chất mang là sephadex tách các chất có phân tử lượng khác nhau.
Chất nào có phân tử lượng lớn không bị mắc kẹt trong các lỗ rây của cột nhồi sẽ chạy ra trước ta thu được nhưng phân đoạn đầu tiên và ngược lại những chất có phân tử lượng nhỏ nhất sẽ chạy ra sau cùng. Từ đây, ta thu được ta thu được các phân đoạn khác nhau.
Thiết bị
Hiện nay, người ta thường sử dụng gel sephadex làm vật liệu nhồi cột. Sephadex là tên thương mại của một loại polysaccharide có nguồn gốc từ vi sinh vật – có bản chất là dextran. Trong đó, các phân tử được liên kết với nhau thông qua các liên kết ngang nhờ tác dụng của epichlorohydrin tạo thành các "rây phân tử". Số liên kết ngang càng nhiều thì kích thước lỗ rây sẽ càng nhỏ.
Sephadex khi ngâm trong nước sẽ hình thành nên mạng lưới gel ba chiều. Các loại sephadex hiện nay chỉ trương nở trong nước và một vài dung môi phân cực nhưng không trương trong methanol, ethanol, acid acetic. Sephadex không tương tác với các ion do nó trung hòa về điện. Nếu bị oxy hóa mạnh trong các dung dịch thì cấu trúc gel sẽ bị phá vỡ, còn trong trong dung dịch acid mạnh thì các glucoside trong gel sẽ bị thủy phân.
Trang 30
Một số hiện tượng cần chú ý khi tiến hành lọc gel
Hiện tượng hấp phụ (adsorption effect):
Là hiện tượng có thể gặp trong quá trình lọc gel. Sự hấp phụ một phần có thể gây ra sự trễ (delay) trong quá trình phân tách một phân tử protein nào đó.
Sự hấp phụ có thể xem gần giống như tính chất trao đổi ion (ion exchange character) mà khi đó có thể tránh bằng cách sử dụng dung dịch đệm có lực ion lớn.
Hiện tượng chảy rối (turbulent flow):
Là hiện tượng xảy ra khi dòng dung dịch đệm – mẫu di chuyển từ một vùng không gian hẹp giữa các hạt gel đến vùng không gian lớn hơn. Hiện tượng này luôn xảy ra trong quá trình sắc ký.
Chỉ có thể giảm bớt hiện tượng chảy rối bằng cách giảm tốc độ chảy của dung dịch rửa giải hoặc sử dụng hạt gel có kích thước nhỏ hơn.
Hiện tượng không ổn định do trọng lực (gravitational instability):
Hiện tượng này xuất hiện khi mẫu được đưa vào ở vị trí phía trên cột. Hệ quả của nó làm giảm khả năng khuếch tán của protein vào hạt gel, từ đó, khả năng phân tách protein trong hỗn hợp cũng bị giảm.
Có thể khắc phục hiện tượng này bằng cách tiếp mẫu từ dưới lên và giảm kích thước hạt gel.
Đánh giá hiệu quả quá trình tinh sạch:
Đánh giá hoạt tính riêng của chế phẩm:
Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme chủ yếu dựa vào lượng tinh bột bị thủy phân hay lượng đường khử tạo thành, sau đây là một số phương pháp để xác định hoạt độ của enzyme amylase:
Phương pháp Wolhgemuth:
Nguyên tắc: xác định lượng enzyme ít nhất có thể thủy phân 1mg tinh bột đến các sản phẩm không màu với iod.
Phương pháp Heinkel:
Nguyên tắc: xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sơ xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp với dung dịch iod.
Đơn vị hoạt độ của enzyme là lượng enzyme có khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở 300
C.
Phương pháp Rukhliadeva Geriacheva:
Nguyên tắc: amylase có khả năng thủy phân tinh bột tạo thành các dextrin có khối lượng phân tử khác nhau, khi cho tác dụng với iod, chúng sẽ tạo màu, đo cường độ màu tạo thành ta tính được hoạt độ của amylase.
Đơn vị hoạt độ của amylase là lượng enzyme xúc tác thủy phân được 1g tinh bột tạo thành dextrin có phân tử lượng khác nhau ở nhiệt độ 300C trong 1 giờ.
Phương pháp Smith và Rose:
Nguyên tắc: hoạt tính α – amylase được xác định dựa trên sự thay đổi màu sắc của phức tinh bột – iod trước và sau thủy phân. Mật độ quang của phức tinh bột – iod được đo ở bước sóng 595nm trên máy quang phổ.
Một đơn vị hoạt tính α – amylase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 10mg tinh bột trong thời gian 1 phút ở 500
C và pH 5.6. Phương pháp Gratreva:
Nguyên tắc: đơn vị hoạt độ amylase là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa 1g tinh bột thành glucose sau 1 giờ. Hoạt độ amylase được tính bằng số đơn vị trên 1ml môi trường hoặc 1g chế phẩm.
Phương pháp Nelson:
Nguyên tắc: dưới tác dụng của amylase, tinh bột bị thủy phân tạo ra dextrin và đường khử. Vì vậy, sự tăng lượng đường khử trong hỗn hợp phản ứng sau khi enzyme tác dụng là thước đo hoạt lực enzyme. Để định lượng đường khử tạo thành có thể dung nhiều phương pháp khác nhau như phương pháp Nelson, Berrand, Luff – Schoorla cả tiến, Granxianof, …
Nguyên tắc chung: lợi dụng tính chất khử của nhóm – CHO trong phân tử đường khi tác dụng với các chất khác nhau hay phản ứng với dung dịch đồng hóa trị II tạo thành kết tủa Cu2O. Hòa tan kết tủa Cu2O bằng các chất khác nhau và định lượng Cu để suy ra lượng đường. Ở đây ta sử dụng phương pháp Nelson. Hòa tan kết tủa Cu2O trong thuốc thử arseno – molybden sẽ nhận được màu xanh da trời. So màu ở máy so màu thường bước sóng 660nm, đối chiếu đồ thị tiêu chuẩn để tính lượng đường.
Đơn vị hoạt động của enzyme là lượng enzyme mà trong 30 phút ở 300C có thể phân giải tinh bột tạo thành lượng đường khử tương đương 1 micromol glucose.
Phương pháp xác định hoạt tính glucoamylase:
Nguyên tắc: ta sẽ xác định hoạt tính của enzyme dựa vào cường độ màu với iod khi đo ở bước sóng 520nm.
Hoạt tính glucoamylase được biểu thị bằng lượng glucose giải phóng bởi enzyme trong 1 phút ở 400C từ 1g tinh bột.
Xác định độ tinh sạch của enzyme: bằng phương pháp điện di
Điện di trên gel Sodium dodecyl sulfate – polyacryamide 10% (SDS PAGE) được thực hiện theo phương pháp của Laemmli (Tipton 1992) trên thiết bị điện di APLELEX với nguồn Electronforesis power supply ST 1006T.
Mẫu chạy điện di phải giữ trong điều kiện -200 – 10
C. Các hóa chất điện di được cung cấp bởi hãng Bioad, Mỹ.
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm màu với Coomassie blue G250. Hoạt tính amylase của các vạch isoform được xác định sau khi làm hồi lại hoạt tính theo phương
Trang 32
pháp của Lark và Springhorn. Gel sau khi chạy điện di có thể được chụp ảnh hoặc được sấy bằng cách ngâm trong dung dịch sấy gel và giữ ở giữa hai lớp celophan.