6 α– amylase Bacillus subtilis
6.2 Sản xuất enzyme amylase từ nấm mốc Aspergillus niger theo phương
nuôi cấy bề sâu từ hai nguồn nước thải trong công nghiệp thực phẩm
Công nghiệp chế biến thức ăn và bia thải ra một lượng lớn nước thải có chỉ số COD (biểu thị nhu cầu oxy hóa học: số mg oxy cần dùng để oxy hóa toàn bộ lượng chất ô nhiễm có trong 1 lít nước thải bằng phản ứng hóa học) và BOD (biểu thị nhu cầu oxy sinh học: số mg oxy mà vi sinh vật cần dùng để oxy hóa toàn bộ lượng chất ô nhiễm dễ bi phân hủy sinh học có trong 1 lít nước thải) khá cao. Nguồn nước thải chưa qua xử lý từ nhà máy bia có chỉ số BOD vào khoảng 500 – 2600mg/L, COD 780 – 3500mg/L, và nguồn nước thải chưa qua xử lý từ nhà máy chế biến thịt có chỉ số BOD 600 – 3000mg/L, COD 800 –400mg/L thề hiện một vấn đề môi trường nghiêm trọng ở Santiago de Cuba. Do đó, cần thiết phải có những kỹ thuật công nghệ xử lý những nguồn nước thải này.
Khả năng lọc sạch chất thải từ công nghiệp thực phẩm, bằng việc sử dụng chúng như là cơ chất cho những công nghệ hóa sinh có tiềm năng lợi ích kinh tế, đã từng được biết đến trước đây. Chất thải qua quy trình xử lý Mussel có thể sử dụng để sản xuất protein đơn bào (single cell protein) và quá trình phân giải với sự ổn định cao từ các giống Aspergillus. Xử lý vi sinh những nguồn thải này là một phương pháp hiệu quả để làm hạ chỉ số COD khoảng hơn 90%.
Giống Aspergillus sản xuất rất nhiều lọai enzyme ngoại bào, trong đó amylase là enzyme rất quan trọng trong công nghiệp. Amylase không chỉ được sử dụng trong quá trình lên men, mà còn được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm, cũng như công nghiệp giấy và vải sợi. Dựa vào sự có sẵn của những nguồn nước thải rất lớn với giá thấp từ các nhà mày bia và chế biến thịt của Santiago de Cuba, việc sử dụng những nguồn này như là môi trường gieo trồng cho các quá trình sản xuất vi sinh, có thể cung cấp một nguyên liệu đầu vào rẻ tiền cho một quy trình sản xuất chi phí thấp, với thuận lợi là khả năng làm giảm chỉ số COD hiệu quả. Tuy nhiên, chưa có một thông tin nào về việc sử dụng những nguồn thải từ các nhà máy bia và chế biến thịt cho sản xuất các lọai enzyme công nghiệp bằng nấm mốc Aspergillus niger.
C.F. Gonzalez xác định khả năng ứng dụng cả
hai nguồn nước thải từ nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt ở Santiago de Cuba cho sản xuất amylase từ chủng Aspergillus niger UO – 1 trong điều kiện môi trường nuôi cấy bề sâu. Những ảnh hưởng của mức tinh bột ban đầu và nguồn nitơ trong quá trình sản xuất enzyme amylase được nghiên cứu. Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và ion kim lọai lên tính ổn định của enzyme amylase cũng được tìm hiểu. Thêm vào đó, xác định mức độ giảm chỉ số COD trong cả hai nguồn nước thải sau quá trình xử lý vi sinh.
Trang 44
Nguyên liệu và phương pháp
Hệ vi sinh vật:
Chủng Aspergillus niger UO – 1 được nuôi trong các ống thạch nghiêng chứa
dextrose khoai tây ở 40C.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy và điều kiện lên men : o Glucose: 20g/L o (NH4)2SO4: 6.6g/L o KH2PO4 : 3.5g/L o FeSO4.7H2O: 0.15g/L o MgSO4.7H2O: 0.1g/L o MnCl2.2H2O: 0.45g/L o Mycological peptone: 3.0g/L : pH 6.8. ở 300 C. : 48 giờ. : 220vòng/phút.
Nước thải từ nhà máy bia và từ nhà máy chế biến thịt, được sử dụng như là cơ chất của môi trường nuôi cấy. Cả hai nguồn nước thải được ly tâm ở 12,000g/15 phút để loại bỏ tạp chất. 6.2.1: COD 3.4g/L Đường 1.98g/L Nitơ 0.095g/L Phospho 0.034 g/L COD 3.0g/L Đường 1.82 g/L Nitơ 0.172 g/L Phospho 0.028 g/L
Môi trường sản xuất được lấy từ những chất bề mặt với hàm lượng dinh dưỡng: NaCl 5g/L KH2PO4 3.5g/L FeSO4.7H2O 0.15g/L MgSO4.7H2O 0.12g/L Giống cấy 3.0g/L (NH4)2SO4 6.6 g/L CaCO3 8.0g/L.
Để nghiên cứu những ảnh hưởng ban đầu của tinh bột trong việc sản xuất amylase, môi trường được bổ sung tinh bột khoai tây hòa tan để thu được môi trường với hàm lượng tinh bột ban đầu 10, 20, 30 và 40 g/L. Môi trường không có tinh bột được dùng để điều khiển, môi trường được điều chỉnh pH 6.0 và tiệt trùng ở 1210
C trong 15phút, tiêm giống với 2% giống cấy và ủ ở 300C trong 88 giờ. Tất cả giống được nuôi cấy chìm trong erlen 250ml với 50ml môi trường sản xuất được lắc 200 vòng/phút, dùng 8 lọ trong mỗi loạt lên men .
Mẫu cấy mỗi ống thí nghiệm được thu nhận sau 12 giờ. Khối Mycelial thu được bằng giấy lọc, rửa dưới vòi nước nhỏ và sấy ở 1050C. Giấy lọc được dùng để thực hiện phân tích (độ pH, mức độ sinh tổng hợp enzyme, hàm lượng đường tổng, nitơ tổng, phospho tổng và chỉ số COD). Sự phân tích chỉ số COD được thực hiện trên giấy lọc ở mỗi quá trình lên men, sử dụng phương pháp so màu reflux.
Phân tích hoạt tính của amylase
Hoạt tính amylase tổng (TAA) được xác định theo Murado (1993): trộn lẫn 80µl môi trường giấy – lọc với 400µl citrate – phosphate 0.15M, điều kiện pH 5.0 và 4% bột hoà tan trước khi bảo quản ở 400
C trong 15 phút, sau đó ủ ở 40o C trong 10 phút để các phản ứng xảy ra. Phản ứng được dừng lại khi thêm 480µl acid dinitrosalicylic, lượng glucose giải phóng được xác định bởi phản ứng với 3, 5 – dinitrosalicylic (Bernfeld, 1951). Một đơn vị hoạt động amylase được xác định bởi số lượng enzyme chuyển hóa 1mg/mL đường khử (xem như glucose) trong điều kiện phân tích.
Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt động của amylase
Mẫu được ủ với mỗi hỗn hợp ở 30 phút trong những điều kiện nhiệt độ và độ pH tối ưu được xác định trong phân tích trước đây. Sau khi ủ, hoạt tính còn lại được xác định bởi sự phân tích enzyme tương ứng. Hoạt tính enzyme dư được biểu thị như một phần trăm của hoạt động trong những mẫu kiểm tra không có chất phản ứng (Aquino, Jorge, Terenzi & Polizeli, 2003). Mỗi thí nghiệm được thực hiện 3 lần. Những dữ liệu được phân tích bởi sự phân tích độ biến thiên (ANOVA) trên SPSS 8.0 Windows.
Kết quả
Sản xuất amylase trong môi trường nước thải từ nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt bổ sung tinh bột.
Thời gian sinh trưởng, độ pH, đường tổng và enzyme của quá trình được 24.
Mức độ sinh tổng hợp enzyme amylase tùy thuộc vào nồng độ tinh bột ban đầu trong môi trường nuôi cấy (hình 24 ). Với nồng độ tinh bột ban đầu cao (40g tinh bột/l) trong môi trường tối ưu cho sự phát triển của tế bào, hàm lượng amylase đạt cực đại trong môi trường nước thải từ nhà máy bia (70.29 EU/ml) cao hơn so với trong môi trường nước thải từ nhà máy chế biến thịt (60.12 EU/ml).
Trang 46
Trong thời gian lên men, pH ban đầu giảm từ 6.0 xuống còn 4.0 sau 24 giờ, sau đó tăng đến xấp xỉ 7.4 (48 giờ ). Nồng độ đường tổng, nitơ tổng và phospho tổng giảm trong thời gian lên men, trong khi đó sinh khối và mức độ sinh tổng hợp enzyme tăng. Môi trường nuôi cấy bổ sung 40g tinh bột/l có chỉ số COD là 0.24g/L, thấp hơn so với môi trường nuôi cấy có nồng độ tinh bột ban đầu ít hơn. Điều này cho thấy rằng ít nhất 92 – 93% COD ban đầu được loại từ nước thải nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt.
Hình 6.2.1: Thời gian sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của chủng Aspergillus niger UO – 1 với cơ chất từ nước thải của nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt cùng đường tổng ở các nồng độ khác nhau ((d)0,(s) 10, (h) 20; (n) 30; (�) 40g/L). TS: đường tổng; TAA: hoạt tính phân giải tổng; PA: hoạt tính protease; Nt: nitơ tổng; P: phosphor tổng. Canh trường được giữ ở 300C trong 88 giờ với vận tốc lắc đảo là 200 vòng/phút
Kết luận
, việc sử dụng nước thải từ nhà máy bia và nhà máy chế biến thịt làm môi trường nuôi cấy cho sản xuất quy mô lớn amylase từ chủng Aspergillus niger UO – 1, góp phần bảo vệ môi trường thông qua việc xử lý nguồn nước thải của các nhà máy
. Tuy nhiên, những nghiên cứu dựa vào việc sử dụng các nguồn carbon từ cám lúa mì, cám gạo, vỏ hạt gạo, cám ngô, …cho sự sản xuất amylase là thiết yếu.