nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase, phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi aspergillus sp. fbh11

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ~~~~~~*~~~~~~ CHÂU NGỌC ĐIỆP Đề tài: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase (MnP), phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi Aspergillus sp. FBH11 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ~~~~~~*~~~~~~ CHÂU NGỌC ĐIỆP Đề tài: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase (MnP), phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi Aspergillus sp. FBH11 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội – 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà - Nguyên Trưởng phòng Công nghệ sinh học môi trường - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa hoc và Công nghệ Việt Nam. Người đã hướng dẫn luận văn cho tôi, cô đã tận tình chỉ bảo, quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành công trình này, cung cấp nhiều kiến thức và kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học. Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, tận tình chỉ bảo, ủng hộ của các cán bộ, anh, chị, em tại Phòng Công nghệ Sinh học môi trường như: HVCH. Nguyễn Nguyên Quang, TS. Nguyễn Bá Hữu, , HVCH. Đàm Thúy Hằng, KS Nguyễn Quang Huy, ThS. Đào Ngọc Ánh. Tôi cũng nhận được làm việc và thực hiện một phần của luận văn tại Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia về công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy, cô giáo giảng dạy thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình và bạn bè đã ủng hộ, động viên giúp đỡ tôi cả về tinh thần và vật chất để tôi có thể hoàn thành luân văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn.! Hà Nội, tháng 11 năm 2010 Châu Ngọc Điệp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác; Các kết quả và số liệu trình bày trong luận văn là trung thực, chưa được công bố bởi bất kì tác giả nào. Hà Nội, ngày 20 tháng 11 năm 2010 Học viên Châu Ngọc Điệp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT 1,2,3,4,6,7,8,9-OCDD 1,2,3,4,6,7,8,9-octachlorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 2,7-DCDD 2,7-dichlorodibenzo-p-dioxin ABTS axít 2,2’-azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic BTEX Nhóm chất vòng thơm gồm benzene, toluene, ethylbenzene và xylen BOD Nhu cầu oxy hóa sinh học (Biochemical Oxygen Demand) CB Biphenyl chứa clo CDD Dibenzo-p-dioxin chứa clo CDF Dibenzofuran chứa clo CFU Đơn vị tạo thành khuẩn lạc (Colony-Forming Unit) COD Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand) DDT 1,1,1-trichloro-2,2-bis (p-chlorophenyl) ethane PAHs Hydrocacbon thơm đa nhân PCBs Polychlorobiphenyls PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxin PCDFs Polychlorinated dibenzofuran POPs Hợp chất hữu cơ khó phân hủy (Persistent Organic Pollutants) TS Tổng các chất rắn (Total Solid) TEF Hệ số độc tương đương (Toxic Equivalency Factor) TEQ Lượng độc tố đương lượng (Toxic Equivalent) TCP Trichlorophenol DCP Dichlorophenol LiP Lignin peroxidase MnP Manganese peroxidase Lac Laccase HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (Hight-Performance Liquid Chromatography) RBBR Remazol brilliant blue R NY1 Acid Red 299 NY3 Acid Blue 62 NY5 Acid Blue 281 NY7 Acid Red 266 NY8 Acid Orange 116 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.2 Phân hủy các chất ô nhiễm bởi nấm và các enzyme của chúng 25 Bảng 2.1 Các loại màu được sử dụng trong nghiên cứu 30 Bảng 2.2 Môi trường phân lập các chủng nấm sợi 31 Bảng 2.3 Môi trường sàng lọc chủng nấm sợi có khả năng sinh enzyme ngoại bào MnP 32 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm đã được phân lập 44 Bảng 3.2 Hoạt tính MnP, LiP và laccase của 4 chủng nấm được tuyển chọn 47 Bảng 3.3 Hoạt tính MnP của chủng FBH11 trong lên men rắn 68 Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme MnP thô còn lại trong quá trình loại màu sau 4 ngày 76 Bảng 3.5 Độ bền pH của MnP từ chủng FBH11 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1 Công thức cấu tạo 2,4,5-T 4 Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của PCDDs 5 Hình 1.3 Công thức cấu tạo 2,3,7,8-TCDD 6 Hình 1.4 Đặc điểm và cấu trúc hoá học một số thuốc nhuộm 11 Hình 1.5 Con đường phân hủy 2,7-DCDD nhờ nấm mục trắng P. chrysosporium 16 Hình 1.6 Cấu trúc không gian của enzyme MnP từ chủng nấm P. chrysosporium 23 Hình 3.1 Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 4 chủng chọn lọc 46 Hình 3.2 Ảnh hưởng của các môi trường nuôi cấy khác nhau lên khả năng sinh enzyme MnP của chủng FBH11 49 Hình 3.3 Mối quan hệ giữa sự phát triển và sinh MnP của chủng FBH11 trên môi trường cao malt sau 8 ngày 50 Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sinh trưởng và phát triển của chủng FBH11 52 Hình 3.5 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy lên sự phát triển và sinh enzyme MnP của chủng FBH11 53 Hình 3.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển của chủng nấm FBH1 54 Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh enzyme MnP của chủng FBH11 54 Hình 3.8 Ảnh hưởng của các chất ô nhiễm khác nhau lên sinh trưởng của chủng FBH11 55 Hình 3.9 Ảnh hưởng của các chất ô nhiễm khác đến khả năng sinh MnP của chủng FBH11 56 Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết malt lên sự phát triển của chủng nấm FBH11 chủng FBH11 57 Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết malt lên khả năng sinh enzyme MnP của chủng FBH11 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.12 Ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau lên sự phát triển của chủng nấm FBH11 59 Hình 3.13 Ảnh hưởng của một số nguồn nitơ lên khả năng sinh MnP của chủng FBH11 59 Hình 3.14 Ảnh hưởng của nồng độ NH 4 Cl lên khả năng sinh enzyme MnP của chủng FBH11 60 Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D lên phát triển của chủng FBH11 62 Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4-D đến khả năng sinh enzyme MnP của chủng FBH11 63 Hình 3.17 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh MnP của chủng FBH11 64 Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ các chất cảm ứng được chọn lọc lên khả năng sinh MnP của chủng FBH11 65 Hình 3.19 Sự phát triển của chủng FBH11 trên các nguồn chất độn 67 Hình 3.20 Sơ đồ thiết bị lên men bioreactor dung tích 15 lít 69 Hình 3.21 Hoạt tính enzyme MnP của chủng FBH11 trong quá trình lên men lỏng trong bioreactor 70 Hình 3.22 Khả năng loại màu các loại thuốc nhuộm của chủng FBH11 sau 6 ngày 71 Hình 3.23 Khả năng loại màu màu thuốc nhuộm của chủng FBH11 sau 6 ngày nuôi 73 Hình 3.24 Hoạt tính MnP của chủng FBH11 trên môi trường nuôi cấy chứa các màu khác nhau theo thời gian 74 Hình 3.25 Khả năng phân hủy màu thuốc nhuộm của MnP thô từ chủng FBH11 75 Hình 3.26 pH tối ưu của MnP từ chủng FBH11 77 Hình 3.27 Ảnh hưởng của pH đệm lên hoạt tính của MnP từ chủng FBH11 77 Hình 3.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên hoạt tính của enzyme MnP 79 Hình 3.30 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ lên độ bền của MnP 80 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Danh mục các chữ cái viết tắt iii Danh mục các bảng biểu iv Danh mục các hình vẽ, đồ thị v Lời mở đầu 1 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 I Đặc điểm cấu trúc và tính chất hoá học của chất diệt cỏ/dioxin và thuốc nhuộm 4 I.1 Chất diệt cỏ/dioxin và thuốc nhuộm 4 I.1.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 4 I.1.2 Chất diệt cỏ 2,4-D 4 I.1.3 Các hợp chất dioxin chứa clo (PCDDs) 5 I.1.4 Thuốc nhuộm và vi sinh vật phân hủy thuốc nhuộm 6 I.1.5 Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm đang được áp dụng tại Việt Nam 12 I.2 Tình trạng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam 14 I.3 Tác hại của chất diệt cỏ/ dioxin đối với môi trường và con người 14 I.4 Sự phân hủy chất diệt cỏ/dioxin 15 I.4.1 Sự phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong môi trường 15 I.4.2 Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin và quá trình đồng trao đổi chất ở nấm 15 I.5 Các phương pháp tẩy độc 18 I.5.1 Phương pháp tẩy độc bằng nhiệt 18 I.5.2 Phương pháp quang hóa, hóa học 18 I.5.3 Phương pháp khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học 19 II Manganes Peroxidase 21 1. Khái niệm 21 2. Cấu trúc của MnP 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3. Tính chất hóa sinh của MnP 23 4. Cơ chế hoạt động của MnP 24 5. Ứng dụng của MnP trong phân hủy sinh học 24 6. Phân bố của MnP và một số vi sinh vật sinh MnP 26 6.1 MnP sinh ra từ nấm đảm 26 6.2 MnP sinh ra từ nấm sợi 27 6.3 MnP sinh ra từ xạ khuẩn 28 6.4 MnP sinh ra từ vi khuẩn 28 PHẦN II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 I Vật liệu 30 I.1 Nguyên liệu 30 I.2 Hoá chất 30 I.3 Thiết bị và máy móc thí nghiệm 31 II Phương pháp nghiên cứu 31 II.1 Môi trường nuôi cấy và nồng độ các chất ô nhiễm được sử dụng 31 II.1.1 Các môi trường nuôi cấy 31 II.1.2 Nồng độ các chất ô nhiễm sử dụng trong nghiên cứu 33 II.2 Các phương pháp nghiên cứu 33 II.2.1 Phân lập nấm sợi trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hoà 33 II.2.1.1 Phân lập bằng phương pháp pha loãng 33 II.2.1.2 Phân lập bằng phương pháp làm giàu 34 II.2.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm 34 II.2.3 Sàng lọc và khảo sát nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào LiP, MnP và Lac 35 II.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính MnP, LiP và laccase của vi sinh vật 35 II.2.4.1 Xác định hoạt tính manganese peroxidase 35 II.2.4.2 Xác định hoạt tính enzyme lignin peroxidase 36 II.2.4.3 Xác định hoạt tính laccase 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... số chủng nấm sợi đã được phân lập tuyển chọn Với mục đích có cơ sở khoa học để ứng dụng một trong ba enzyme ngoại bào trong xử lý ô nhiễm các chất đa vòng thơm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase, phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi Aspergillus sp FBH11 Các nội dung nghiên cứu bao gồm: 1, Phân lập, tuyển chọn. .. CuSO4 65 III.4 Khả năng sinh enzyme ngoại bào MnP của chủng FBH11 trên môi 66 trường rắn III.5 Lên men lỏng bằng bioreactor 69 III.6 Khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng nấm sợi FBH11 và từ dịch 70 enzyme MnP thô III.6.1 Khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng FBH11 70 III.6.2 Khả năng loại màu thuốc nhuộm bằng dịch enzyme MnP thô 74 76 III.7 Một số tính chất của enzyme MnP từ chủng FBH11 III.7.1... sàng lọc các chủng nấm sợi có khả năng sinh enzyme ngoại bào MnP, LiP và laccase cao từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2, Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm được lựa chọn sinh MnP cao 3, Đánh giá khả năng phân hủy thuốc nhuộm của chủng nấm và từ dịch enzyme thô trong điều kiện phòng...II.2.5 Chọn lọc môi trường thích hợp 38 II.2.6 Khảo sát các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng phát 38 triển và sinh MnP của chủng FBH11 II.2.7 Phương pháp lên men rắn 40 II.2.8 Lên men bằng bioreactor 41 II.2.9 Phương pháp đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng 41 nấm sợi FBH11 và dịch enzyme MnP thô II.2.9.1 Đánh giá khả năng loại màu thuốc nhuộm của chủng nấm 41 sợi FBH11 II.2.9.2... có tiềm năng lớn cho áp dụng quy mô công nghiệp Vi khuẩn phân hủy những màu này cần có sự tham gia của enzyme nội bào trong khi nấm phân hủy chúng bằng các enzyme ngoại bào [77] Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu dựa trên một vài chủng nấm bao gồm cả nấm phân hủy lignin và không phân hủy lignin có khả năng phân hủy và hấp thụ màu tốt trong nước thải Hầu hết nghiên cứu liên quan đến phân hủy đều... chiết enzyme MnP thô sinh tổng hợp từ 42 chủng FBH11 và khả năng loại màu II.2.10 Xác định một số tính chất hóa sinh của MnP thô từ chủng FBH11 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III.1 Một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 4 chủng nấm sợi FBH11, 43 44 44 FBH14, FBH33, FBH34 III.2 Khảo sát, sàng lọc khả năng sinh tổng hợp 3 loại enzyme ngoại bào 45 MnP, LiP và laccase III.3 Lựa chọn và tạo điều kiện môi... nhiễm thuốc nhuộm Hiện nay việc tập trung vào nghiên cứu các chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học thuốc nhuộm được xem là một phương thức thay thế tốt hơn Một số vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm sợi, xạ khuẩn có thể làm giảm hoặc hấp thụ nhiều loại thuốc nhuộm, ngoại trừ một số nấm đảm có khả năng loại màu rất tốt [44] Nhiều nghiên cứu đáng chú ý đã thông báo về khả năng sử dụng vi sinh. .. và tạo điều kiện môi trường thích hợp cho khả năng sinh 47 trưởng và sinh tổng hợp MnP của chủng FBH11 III.3.1 Lựa chọn môi trường thích hợp cho sự sinh tổng hợp enzyme 47 MnP của chủng FBH11 III.3.2 Mối quan hệ giữa sự phát triển và khả năng sinh MnP của chủng 50 FBH11 theo thời gian III.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH môi trường nuôi cấy đến sự phát 51 triển và khả năng sinh MnP III.3.3.1 Ảnh hưởng... đã được nghiên cứu Nấm này có khả năng phân hủy DD, 2,3,7-TriCDD và OCDD Loài nấm được nghiên cứu phân hủy DD tạo thành catechol, chất này sau đó được trao đổi chất tiếp đến cis-cis-muconate; trong khi đó phân hủy 2,3,7-TriCDD và OCDD dẫn đến catechol chứa 1-3 clo và catechol không chứa clo Tuy nhiên, các cơ chế phân hủy PCDD/F của chủng nấm kể trên vẫn chưa rõ ràng [63] Ở Việt Nam, các nghiên cứu khử... sản phẩm phân hủy của nó, cũng như giám sát việc sinh tổng hợp enzyme ngoại bào Lac, tyrosinase và LiP trong dịch nuôi cấy trong quá trình loại màu đã được nghiên cứu [55] Chủng Pinicillium ochorochloron MTCC 517 trong quá trình phân hủy màu sinh học màu xanh triphenylmethan ngoài sinh LiP loài nấm này còn sinh laccase, mà không thấy sự xuất hiện của enzyme ngoại bào MnP [65] Rất ít nghiên cứu thực . tài: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase, phân hủy thuốc nhuộm từ chủng nấm sợi Aspergillus sp. FBH11 Các nội dung nghiên cứu bao. http://www.lrc-tnu.edu.vn 2, Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng nấm được lựa chọn sinh MnP cao. 3, Đánh giá khả năng phân hủy thuốc nhuộm của chủng nấm và từ dịch enzyme thô trong điều kiện phòng. NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ~~~~~~*~~~~~~ CHÂU NGỌC ĐIỆP Đề tài: Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp đến khả năng sinh enzyme ngoại bào manganese peroxidase