Báo cáo thư viện gen và thư viện CDNA

TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNALấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độ thấp).Phá vỡ màng tế bào và màng nhân.Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng phenol).Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay isopropanol lạnh.Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp).

THƯ VIỆN BỘ GEN VÀ THƯ VIỆN cDNA TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MH. KỸ THUẬT DI TRUYỀN GVHD: TS. Trần Thị Dung NỘI DUNG CHÍNH THƯ VIỆN cDNA THƯ VIỆN BỘ GEN THƯ VIỆN BỘ GEN KHÁI NIỆM QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP KHÁI NIỆM • Chia nhỏ DNA bộ gen và chèn chúng vào tế bào chủ. • Chứa tất cả DNA bộ gen của sinh vật . Thư viện gen (Ngân hàng gen) [...]... PHÁP ĐÁNH GIÁ ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU KHÁI NIỆM cDNA DNA bổ trợ (complementary DNA) DNA tổng hợp từ mRNA với xúc tác của enzyme RT (reverse transcriptase) KHÁI NIỆM Thư viện cDNA (Ngân hàng cDNA) • • • Tập hợp các cADN tổng hợp từ các mARN Thiết lập trên vector (plasmid hoặc phage lambda) Đối tượng áp dụng: eukaryote KHÁI NIỆM THƯ VIỆN GEN 1 2 3 4 5 Tập hợp các phân đoạn của DNA bộ gen Chứa toàn bộ DNA... sinh vật Tạo DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào vật chủ Vật chủ: E.coli, Eukaryote Vector: plasmid THƯ VIỆN cDNA 1 2 3 4 tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN thiết lập từ một tế bào xác định gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN Vector: phage lambda; plasmid PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP RNA TẠO DÒNG cDNA TÁCH CHIẾT mRNA XÁC ĐỊNH DÒNG TỔNG HỢP cDNA THÀNH LẬP DỮ LIỆU cDNA PHÂN LẬP RNA TÁCH mRNA • •... Bacteriophage lambda: – Dung nạp đoạn gen có kích thư c lớn – Vector lambda mang vùng đệm (suffer) nếu cắt bỏ sẽ không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage lambda – Loại bỏ vùng này và thay bằng đoạn cDNA – Trong tạo dòng cDNA, thư ng dùng bacteriophage lambda gt10, gt11, và lambda ZAP I, II là thế hệ bacteriophage lambda mới CÁC VECTOR • Plasmid: – Dung nạp đoạn gen có kích thư c dưới 3kb • XÁC ĐỊNH DÒNG... chưa xác định) SÀNG LỌC THƯ VIỆN ĐỂ NHẬN TRÌNH TỰ ĐÍCH • Sau khi thư viện gen được tạo ra Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng: – Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ – Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng THƯ VIỆN cDNA KHÁI NIỆM PHƯƠNG... SINH TỔNG HỢP cDNA Nguyên liệu: 1 2 3 4 Khuôn mRNA Mồi oligo(dT) Enzyme RT dNTPs 1 2 3 4 Nguyên tắc Gắn mồi Tổng hợp ss cDNA Tổng hợp ds cDNA Hoàn chỉnh HOẠT ĐỘNG CỦA RT Rnase H CẤU TRÚC “KẸP TÓC” GẮN BẰNG TERMINAL TRANSFERASE TẠO DÒNG cDNA Hai phương pháp liên kết ds cDNA với vector – Bổ sung đuôi đồng trùng hợp – Bổ sung linker, có sự tham gia của enzyme giời hạn cDNA linker DNA ligase cDNA adapter... sử dụng để nhận dạng: - Lai cDNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ - Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng Phương pháp tương tự như với lập thư viện bộ gen ĐÁNH GIÁ • ƯU ĐIỂM – Các dòng cDNA chứa trình tự liên tục mã hóa của một gen – Những tế bào chuyên hóa... hay RNA Không bị nối vòng khi cắt bằng RT T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase thư ng được sử dụng đồng thời trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kỉ thuật tạo dòng    TẠO DNA TÁI TỔ HỢP • Sử dụng enzyme nối Ligase E.Coli DNA ligase ENZYME LIGASE T4 DNA ligase T4 RNA ligase T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE • ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ Mục đích: – Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao... ĐIỂM – Các dòng cDNA chứa trình tự liên tục mã hóa của một gen – Những tế bào chuyên hóa tạo ra một số lớn các protein một loại và mRNA tương ứng của protein giàu đó sẽ dễ tách ra để tạo ngân hàng cDNA Biến nạp cDNA khắc phục được hiện tượng tế bào vi khuẩn không dung nạp gen có cấu trúc mang phần không mã hóa ... nghiệm tạo dòng • ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ Loại tế bào chủ 1 E coli 2 Eukaryote ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ • Phương pháp thực hiện: – Hóa biến nạp: CaCl2 + sốc nhiệt – Điện biến nạp: dòng điện cao thế cục bộ TẠO DÒNG • • Tế bào được nuôi cấy tạo thành những dòng mới chứa DNA tái tổ hợp • Chuẩn bị cho giai đoạn sàng lọc Môi trường nuôi cấy tạo dòng thư ng là: – M9 (Thành phần dinh dưỡng . BỘ GEN VÀ THƯ VIỆN cDNA TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MH. KỸ THU T DI TRUYỀN GVHD: TS. Trần Thị Dung NỘI DUNG CHÍNH THƯ VIỆN cDNA THƯ VIỆN BỘ GEN THƯ. GEN THƯ VIỆN BỘ GEN KHÁI NIỆM QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP KHÁI NIỆM • Chia nhỏ DNA bộ gen và chèn chúng vào tế bào chủ. • Chứa tất cả DNA bộ gen của sinh vật . Thư viện gen (Ngân hàng gen)