Nuôi cấy In Vitro cây sầu riêng (Durio Zibethinus Murray)

 LI CM N u tiên, em xin chân thành cm n ban Giám Hiu, ban ch nhim khoa Công ngh sinh hc trng i hc M Tp.HCM đã to điu kin cho em đc hc tp và rèn luyn trong môi trng tt nht. Em xin chân thành gi cm n tt c các quý thy cô khoa Công ngh sinh hc đã tn tình ging dy và trang b cho em nhng kin thc cn thit trong sut thi gian hc đi hc. Em xin g i li cm n sâu sc đn cô Nguyn Trn ông Phng đã trc tip hng dn và truyn đt cho em nhng kin thc và kinh nghim quý báu trên sut quá trình thc hin đ tài. Chân thành cm n các thành viên trong phòng thí nghim Công ngh t bào thc vt đã nhit tình giúp đ mình trong sut thi gian thc hin đ tài. Cui cùng, con xin t lòng bit n sâu sc đn gia đình. Cm  n nhng tình cm mà ba m và anh ch dành cho con, s ng h và đng viên ca gia đình giúp con vng bc hn trên con đng hc tp và đng đi.  CÁC CH VIT TT MS : Murashige & Skoog BA : N 6 – benzyladenin NAA : 1-Naphthaleneacetic acid  DANH MC CÁC BNG Bng 1: Thành phn ca Su riêng (tính cho 100 gram tht qu ti) [10] 6 Bng 2: Nng đ HgCl 2 và thi gian kh mu  các nghim thc. 17 Bng 3: nh hng ca BA trong quá trình to cm chi t đt thân 18 Bng 4: nh hng ca BA trong quá trình to cm chi t phôi hu tính ht Su riêng 1 tháng tui. 19 Bng 5: nh hng ca BA trong quá trình to cm chi t phôi hu tính ht Su riêng 2 tháng tui 20 Bng 6: nh hng ca BA trong quá trình to cm chi t phôi hu tính ht Su riêng trng thành 21 Bng 7: nh hng ca NAA trong quá trình to r t chi 22 Bng 8: Kt qu kh mu sau 7 ngày theo dõi 24 Bng 9: Kt qu to cm chi t phôi ht hu tính trng thành in vitro trong môi trng MS b sung BA (4 tun tui) 29 Bng 10: Kt qu to r t chi Su riêng in vitro trong môi trng MS b sung BA (4 tun tui) 33  DANH MC CÁC HÌNH Hình 1: Cây su riêng 4 Hình 2: Công thc cu to ca auxin 9 Hình 3: Công thc cu to ca cytokinin 10 Hình 4: t thân sau kh mu đc cy trên môi trng MS. 24 Hình.5: t thân sau khi cy 4 tun trên môi trng MS có b sung BA 26 Hình 6: Phôi ht hu tính 1 tháng tui trên môi trng MS có b sung BA. 27 Hình 7: Phôi ht hu tính 2 tháng tui trên môi trng MS có b sung BA. 27 Hình 8: Phôi ht hu tính trng thành 28 Hình 9: Ch i trên môi trng MS sau 4 tun nuôi cy 30 Hình 11: Chi trên môi trng MS + BA 2 mg/l sau 4 tun nuôi cy 30 Hình 10: Chi trên môi trng MS + BA 1 mg/l sau 4 tun nuôi cy 30 Hình 12: Chi trên môi trng MS + BA 3 mg/l sau 4 tun nuôi cy 30 Hình 13: Chi trên môi trng MS + BA 4 mg/l sau 4 tun nuôi cy 31 Hình 15: Chi trên môi trng MS + BA 6 mg/l sau 4 tun nuôi cy 31 Hình 14: Chi trên môi trng MS + BA 5 mg/l sau 4 tun nuôi cy 31 Hình 16: Chi trên môi trng MS + BA 7 mg/l sau 4 tun nuôi cy 31 Hình 17: Chi trên môi trng MS + BA 8 mg/l sau 4 tun nuôi cy 32  Hình 18: Chi trên môi trng MS + BA 9 mg/l sau 4 tun nuôi cy 32 Hình 19: Chi trên môi trng MS + BA 10 mg/l sau 4 tun nuôi cy 32 Hình 20: Chi trên môi trng MS 34 Hình 21: Chi trên môi trng MS + NAA 1 mg/l sau 4 tun nuôi cy. 34 Hình 22: Chi trên môi trng MS + NAA 2 mg/l sau 4 tun nuôi cy 35 Hình 23: Chi trên môi trng MS + NAA 3 mg/l sau 4 tun nuôi cy 35 Hình 24: Chi trên môi trng MS + NAA 4 mg/l sau 4 tun nuôi cy 35 Hình 25: Chi trên môi trng MS + NAA 5 mg/l sau 4 tun nuôi cy 35 Hình 26: nh sinh trng cây Su riêng ngoài t nhiên 3 tháng tui ct dc. 36 Hình 27: nh sinh trng cây Su riêng in vitro ct dc. 36 Hình 28: Thân cây su riêng ngoài t nhiên 3 tháng tui ct ngang 36 Hình 29: Thân cây su riêng in vitro ct ngang 36 Hình 30: Lá cây Su riêng ngoài t nhiên 3 tháng tui ct ngang 37 Hình 31: Lá cây Su riêng in vitro ct ngang 37 Hình 32: R cây Su riêng ngoài t nhiên 3 tháng tui ct ngang. 37 Hình 33: R cây Su riêng in vitro ct ngang. 37  MC LC I. TNG QUAN TÀI LIU 3 I.1. Gii thiu cây Su riêng 3 I.1.1. H Malvaceae[9] 3 I.1.2. V trí phân loi [16] 3 I.1.3. Phân b, sinh thái, sinh trng và phát trin [7] 5 I.1.4. Thành phn hóa hc 6 I.2. Nghiên cu trong và ngoài nc 7 I.2.1. Trong nc 7 I.2.2. Ngoài nc. 7 I.3. Nuôi cy mô thc vt 7 I.3.1. Gii thiu v nuôi cy mô thc vt[1] 7 I.3.2. Vai trò ca nuôi cy mô [3] 8 I.4. Vai trò ca cht điu hòa sinh trng thc vt [12] 8 I.4.1. Auxin 9 I.4.2. Cytokinin 9 I.5. Các yu t nh hng đn quá trình nuôi cy mô[12] 10 I.5.1. Ánh sáng 10 I.5.2. Nhit đ 11 I.5.3. pH 11 I.5.4. Mui khoáng 11 I.5.5. Ngun Carbon 11 I.5.6. Vitamin 12 I.5.7. Agar 12 I.6. Phát sinh hình thái chi bt đnh 12 I.6.1. Phát sinh hình thái chi bt đnh: 12 I.6.2. Phát sinh hình thái r bt đnh [4] 13 II. VT LIU VÀ PH NG PHÁP NUÔI CY 15 II.1. Vt liu 15 II.1.1. a đim và thi gian thc hin 15  II.1.2. i tng nghiên cu 15 II.1.3. iu kin nuôi cy in vitro cây Su riêng: 15 II.1.4. iu kin nuôi cy 16 II.1.5. Hoá cht dùng trong nuôi cy mô 16 II.2. Phng pháp nghiên cu 17 II.2.1. Thí nghim 1: Kho sát nng đ HgCl 2 và thi gian kh mu 17 II.2.2. Thí nghim 2: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t đt thân 18 II.2.3. Thí nghim 3: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t phôi ht hu tính 1 tháng tui 18 II.2.4. Thí nghim 4: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t phôi ht hu tính 2 tháng tui 20 II.2.5. Thí nghim 5: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t phôi ht hu trng thành 21 II.2.6. Thí nghim 6: Kho sát s nh hng ca NAA đn kh nng phát sinh r ca chi cây Su riêng 21 II.2.7. Gii phu r, thân, lá, đnh sinh trng cây Su riêng 3 tháng tui ngoài t nhiên và cây Su riêng in vitro 10 tun tui 22 Quy trình gii phu: 22 II.3. X lý s liu 23 III. KT QU VÀ THO LUN 24 III.1. Thí nghim 1: Kho sát nng đ HgCl 2 và thi gian kh mu 24 III.2. Thí nghim 2: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t đt thân 26 III.3. Thí nghim 3: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t phôi ht hu tính 1 tháng tui 26 III.4. Thí nghim 4: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t phôi ht h u tính 2 tháng tui 27 III.5. Thí nghim 5: Kho sát s nh hng ca BA đn kh nng phát sinh cm chi t phôi ht hu trng thành 27  III.6. Thí nghim 6: Kho sát s nh hng ca NAA đn kh nng phát sinh r ca chi cây Su riêng 33 III.7. Gii phu r, thân, lá, đnh sinh trng cây Su riêng 3 tháng tui ngoài t nhiên và cây Su riêng in vitro 10 tun tui. 36 IV. KT LUN VÀ  NGH 38 IV.1. Kt lun 38 IV.2.  ngh 38 1  T VN   Trái cây là mt loi thc phm thit yu trong cuc sng con ngi. Do hiu qu kinh t cao, nhng nm gn đây nhiu nhà vn đã ci to vn tp, chuyn đi c cu cây trng c hiu qu thp sang trng chuyên canh cây n trái. Su riêng (Durio zibethinus Murray) là mt loi trái cây rt đc a chung và có giá tr kinh t cao.  nc ta, Su riêng là lo i trái cây d tiêu th, giá bán cao hn hn nhiu loi trái cây khác nên din tích trng ngày mt gia tng.  Cây Su riêng thuc h Malvaceae, có ngun gc t Malaysia. Sau đó đc phát trin sang mt s nc trong vùng nhit đi nh: Indonesia, Thái Lan, Philippines, Hawaii, Brunei, Mianma, Vit Nam, Lào, Campuchia… Ngoài ra, còn đc trng  mt s nc nhit đi khác  Trung Nam M, mt s nc châu Phi và châu Úc. Su riêng du nhp vào nc ta t Thái Lan và trng đu tiên  Tân Quy (Biên Hòa). Hin nay, Su riêng đc trng ph bin  các tnh phía Nam nh Bn Tre, Tin Giang, Bình Dng, ng Nai. Mt s ni ca các tnh min Trung, Tây Nguyên nh klk, Lâm ng, Qung Nam, Tha Thiên – Hu … cng trng đc Su riêng nhng trái ít mùi thm[10].  Su riêng có mùi v rt hp dn, hàm lng các cht dinh dng cao nh: lipid, protein, acid amin, calcium và các cht thm nh: thiols esters, hydrogen sufide, diethyl sunfide nên đc nhi u ngi tiêu dùng a chung. Không nhng th các b phn ca cây nh: v, ht, qu cng làm nguyên liu cho ngành dc liu, thân cây dùng làm vt liu g[10].  Su riêng có th nhân ging bng c hai phng pháp là hu tính (bng ht) và nhân vô tính (chit, ghép). Mi phng pháp đu có u nhc đim riêng. Nhân ging hu tính (bng ht) đn gin, ít tn kém, h s nhân ging th p. Cây có b r khe nhng cây rt lâu cho trái, cây con khó gi đc đc tính ca cây m, các cây trong vn không đng đu. Nhân ging vô tính (chit, ghép) có u đim gi đc 2  nhng đc tính tt ca cây m, cho trái nhanh nhng đòi hi nông dân phi có kinh nghim nhân ging, tim n nguy c nhim bnh qua mt ghép, chit. H s nhân ging ca hai phng pháp th công trên không cao, cây con không đng đu nên cn phi có gii pháp to ra ngun cây ging ln và đng đu đ cung cp cho sn xut, phng pháp nuôi cy mô có th gii quyt đc vn đ này. Phng pháp nuôi cy mô cng là công c hu hiu cho công ngh chuyn gen, to đt bin  thc vt nhm to bin d phc v quá trình chn to ging. Do đó, chúng tôi tin hành nghiên cu đ tài “Nuôi cy in vitro cây Su riêng (Durio zibethinus Murray)” nhm phc v cho quá trình chn lc to ging mi. [...]... auxin c n ph i ong h p v i các v vitamin (nh thiamin mà r kh h n hông t ng h p g c), acid am (nh c min argin nin), nh t l các h p ch t ortholà -diphenolic (nh acid cafeic, ac chlorog c d cid genic) I.4.2 I Cytokinin C C Cytokinin, d n xu t c a adenin, là ch t i u hòa sinh tr h ng th c v t có th kích h ó thích ho c c ch các qu trình sin lý, hóa sinh, trao h uá nh i ch t, phát tri n c a th c v t Cytokinin... h uá nh i ch t, phát tri n c a th c v t Cytokinin n i sinh ó vai trò quan tr n trong s óng ò ng i u bi n các ch c n ng ho t ng s ng tron cây g ng 9 Hình 3: Công th c c u t o c a cytokinin Mô phân sinh ng n r là n i t ng h p ch y u các cytokinin t do cho c c th th c v t tr r , cytokinin c n s kéo dài nh ng kích thích t ng r ng t bào (s t ng ng c ) Cytokinin ng n c n s lão hóa, thúc y s tr ng thành c... quang h p gi i h n, vì v y ng c a mô vào môi tr ng Mô t bào nuôi c y có s i ta c n thêm glucid c n thi t cho s t ng tr ng ng nuôi c y 11 I.5.6 Vitamin Th c v t c n vitamin th ng xúc tác các quá trình bi n d ng khác nhau, các vitamin c s d ng nhi u nh t trong nuôi c y mô là: thiamin HCl (vitamin B1), pyridoxine HCl (vitamin B6), acid nicotinic, myo-inositol I.5.7 Agar Agar là m t polyosid có tr ng l ng phân... gian: 11/2013 II.1.2 it ng nghiên c u H t S u riêng tháng tu i l y n 5/2014 c mua huy n các i m bán c m S u riêng Thân; qu S u riêng 1, 2 c Tr ng, t nh Lâm ng: dùng làm v t li u kh i u nuôi c y in vitro II.1.3 i u ki n nuôi c y in vitro cây S u riêng: II.1.3.1 Thi t b và d ng c D ng c : - D ng c pha môi tr ng: becher, ng ong, ca nh a, micropipette, a th y tinh - D ng c c y: dao m , a petri, èn c n, bông... 6: Kh o sát s nh h ng c a NAA n kh n ng phát sinh r c a ch i cây S u riêng Kh o sát n ng ch t i u hòa t ng tr ng th c v t nh m tìm ra môi tr ng t t nh t t o r cho cây S u riêng in vitro V t li u thí nghi m: phôi h t tr ng thành 21 Môi tr ng nuôi c y: Môi tr B ng 7: nh h ng MS b sung NAA theo các n ng ng c a NAA trong quá trình t o r t ch i cây S u riêng in vitro Nghi m th c N ng NAA (mg/l) C 0 N1 1 N2... y ch i in vitro 2.5-3.5 cm vào môi tr i u hoà t ng tr khác nhau ng th c v t v i n ng ng MS b sung ch t khác nhau Th i gian theo dõi: 4 tu n Ch tiêu ánh giá: S r và chi u dài r II.2.7 Gi i ph u r , thân, lá, nh sinh tr ng cây S u riêng 3 tháng tu i ngoài t nhiên và cây S u riêng in vitro 10 tu n tu i M c ích thí nghi m: so sánh s khác bi t gi a c u trúc r , thân, lá nh sinh tr ng c a cây S u riêng 3... A 20-30 IU Vitamin B1 0,2-0,28 mg Vitamin B2 0,1-0,28 mg Vitamin B6 0,68-1,1 mg Vitamin C 23-62 mg 6 I.2 Nghiên c u trong và ngoài n I.2.1 Trong n c c N m 1996, Tr n Vinh nghiên c u tuy n ch n m t s cây kl k và ph ng pháp m i u dòng S u riêng nhân gi ng[11] N m 2000, Hu nh V n Thành nghiên c u phòng tr b nh Phytophthora gây h i trên cây S u riêng[ 5] N m 2003, Hu nh V n T n, Nguy n Minh Châu nghiên... u riêng[ 5] N m 2003, Hu nh V n T n, Nguy n Minh Châu nghiên c u hi n t ng s ng c m trái cây S u riêng Monthong tr ng t i B n Tre[6] Trong n c ch a có các nghiên c u v nuôi c y mô cây S u riêng I.2.2 Ngoài n c N m 2008, Hameed B cùng các ng s (Durio zibethinus Murray) chi phí th p d ch n ã nghiên c u s d ng v S u riêng h p th lo i b thu c nhu m acid t dung c[13] N m 2010, Komsil Pholdaeng cùng các ng... xích tri n bình th ng cây S u riêng c n nhi t S u riêng là cây a m, không khí th o t i v tuy n 17-18 sinh tr ng và phát t 24-300C ng xuyên m ( m không khí kho ng 75- 85%) S u riêng là cây ch u h n r t kém Thích h p v i nh ng vùng có l ng m a t ng s hàng n m kho ng 1600-4000 mm (t t nh t là vào kho ng 2000 mm), nh ng phân b ph i t u trong n m, vì th vào mùa khô và nh ng in c cho cây, nh t là nh ng vùng... các ch t ti t (tanin, tinh d u…) c t ng h p Sau ó, các t bào này có th tr l i giai o n phân chia t bào m i hay tr c ti p phân hóa mà không qua s phân chia t bào [12] I.6.2 Phát sinh hình thái r b t R b t nh có th có r H uh tr b t nh [4] tr h di p c a m t cây con, các m u và lóng c a thân và nh phát sinh ki u n i sinh, m c dù v n có nh ng tr ng h p phát sinh ngo i sinh Các r b t nh sinh trên thân t o . 29: Thân cây su riêng in vitro ct ngang 36 Hình 30: Lá cây Su riêng ngoài t nhiên 3 tháng tui ct ngang 37 Hình 31: Lá cây Su riêng in vitro ct ngang 37 Hình 32: R cây Su riêng ngoài. 4 tun nuôi cy 35 Hình 26: nh sinh trng cây Su riêng ngoài t nhiên 3 tháng tui ct dc. 36 Hình 27: nh sinh trng cây Su riêng in vitro ct dc. 36 Hình 28: Thân cây su riêng. cu đ tài Nuôi cy in vitro cây Su riêng (Durio zibethinus Murray) nhm phc v cho quá trình chn lc to ging mi. 3  I. TNG QUAN TÀI LIU I.1. Gii thiu cây Su riêng I.1.1.