kỹ thuật pcr và ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật

kỹ thuật pcr và ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật

Kỹ thuật PCR và ứng dụng Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong chọn tạo giống thực vậttrong chọn tạo giống thực vật Đ ĐĐ ĐĐ ĐĐ Đại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên ại học khoa học tự nhiên - - Đ ĐĐ ĐĐ ĐĐ Đại học quốc gia hà nội ại học quốc gia hà nộiại học quốc gia hà nội ại học quốc gia hà nộiại học quốc gia hà nội ại học quốc gia hà nộiại học quốc gia hà nội ại học quốc gia hà nội Khoa sinh học Khoa sinh học Khoa sinh học Khoa sinh học Khoa sinh học Khoa sinh học Khoa sinh học Khoa sinh học - - bộ môn di truyền học bộ môn di truyền họcbộ môn di truyền học bộ môn di truyền họcbộ môn di truyền học bộ môn di truyền họcbộ môn di truyền học bộ môn di truyền học trong chọn tạo giống thực vậttrong chọn tạo giống thực vật Hà nội, tháng 12 / 2003 Hà nội, tháng 12 / 2003Hà nội, tháng 12 / 2003 Hà nội, tháng 12 / 2003Hà nội, tháng 12 / 2003 Hà nội, tháng 12 / 2003Hà nội, tháng 12 / 2003 Hà nội, tháng 12 / 2003 Khó có thể diễn tả hết ý nghĩa và vai trò của Khó có thể diễn tả hết ý nghĩa và vai trò của Khó có thể diễn tả hết ý nghĩa và vai trò của Khó có thể diễn tả hết ý nghĩa và vai trò của kỹ thuật PCR trong lĩnh vực công nghệ sinh kỹ thuật PCR trong lĩnh vực công nghệ sinh kỹ thuật PCR trong lĩnh vực công nghệ sinh kỹ thuật PCR trong lĩnh vực công nghệ sinh học ngày nay. học ngày nay. học ngày nay. học ngày nay. Đ ĐĐ Đây là một phơng pháp dễ ây là một phơng pháp dễ ây là một phơng pháp dễ ây là một phơng pháp dễ dàng và nhanh chóng để có thể tách dòng dàng và nhanh chóng để có thể tách dòng dàng và nhanh chóng để có thể tách dòng dàng và nhanh chóng để có thể tách dòng và nhân lên một số lợng vô hạn mọi đoạn và nhân lên một số lợng vô hạn mọi đoạn và nhân lên một số lợng vô hạn mọi đoạn và nhân lên một số lợng vô hạn mọi đoạn tr trtr tr ì ìì ì nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật tr trtr tr ì ìì ì nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN. Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng đợc coi là một này xứng đáng đợc coi là một này xứng đáng đợc coi là một này xứng đáng đợc coi là một bớc ngoặt bớc ngoặtbớc ngoặt bớc ngoặt hay hay hay hay một kỹ thuật mang tính cách một kỹ thuật mang tính cách một kỹ thuật mang tính cách một kỹ thuật mang tính cách mạng mạngmạng mạng thúc đẩy sự phát triển của Công thúc đẩy sự phát triển của Công thúc đẩy sự phát triển của Công thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ Sinh học hiện đại. nghệ Sinh học hiện đại.nghệ Sinh học hiện đại. nghệ Sinh học hiện đại. J. Watson J. WatsonJ. Watson J. Watson Sự phát minh ra kỹ thuật PCRSự phát minh ra kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR hay còn đợc gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymeraza đợc Kary Mullis phát minh vào năm 1983. Hai n ă m sau (1985), phát Hai n ă m sau (1985), phát minh này đợc chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế. Bằng công trình này, Kary Mullis đợc tặng giải thởng Nobel Hoá học năm 1993. Tổng quan về kỹ thuật PCRTổng quan về kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR là một phơng pháp in vitro cho phép nhân nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một số lợng mẫu ban đầu rất nhỏ. Một đoạn ADN bất kỳ (thờng 10 kb) có thể đợc nhân lên thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ. Phơng pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và ADN thuộc các lĩnh vực khoa nghiệm có liên quan đến gen và ADN thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trờng, y tế, dợc phẩm, pháp y Nhờ phơng pháp này, ngày nay chúng ta có thể tiến hành phân lập, xác định, giải mã trình tự các gen; và đi sâu nghiên cứu chức năng, cũng nh biểu hiện của gen trong quá trình phát triển và trong việc phản ứng với các điều kiện môi trờng. Một chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn chính 1. Giãn xoắn (denaturation) : Hai sợi của chuỗi xoắn kép Nguyên tắc của kỹ thuật PCRNguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ KỹKỹ Kỹ thuật thuậtthuật thuật PCR PCRPCR PCR dựa dựadựa dựa trên trêntrên trên sự sựsự sự xúc xúcxúc xúc tác táctác tác của củacủa của enzym enzymenzym enzym ADN ADNADN ADN polymeraza polymerazapolymeraza polymeraza để đểđể để nhân nhânnhân nhân bản bảnbản bản một mộtmột một đoạn đoạnđoạn đoạn ADN ADNADN ADN nhờ nhờnhờ nhờ hai haihai hai đoạn đoạnđoạn đoạn mồi mồimồi mồi oligonucleotít oligonucleotítoligonucleotít oligonucleotít (primer) (primer)(primer) (primer) tơng tơngtơng tơng hợp hợphợp hợp với vớivới với hai haihai hai đầu đầuđầu đầu 3 33 3 ở ởở ở hai haihai hai mạch mạchmạch mạch đơn đơnđơn đơn của củacủa của đoạn đoạnđoạn đoạn ADN ADNADN ADN 1. Giãn xoắn (denaturation) : Hai sợi của chuỗi xoắn kép đợc tách ra nhờ nhiệt độ cao (94-95 o C). 2. Gắn primer (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng đợc giảm xuống (55-60 o C) để các primer gắn vào các sợi ADN tơng ứng theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ. 3. Kéo dài mạch bổ sung ADN (DNA extension): Phản ứng trùng hợp phân tử ADN đợc thực hiện nhờ enzym ADN polymeraza để kéo dài mạch bổ sung theo nguyên tắc bổ trợ với sợi khuôn. Nguyên tắc của kỹ thuật PCRNguyên tắc của kỹ thuật PCR Hỗn hợp phản ứng PCR GĐ1 G Đ 3 Bắt đầu chu kỳ mới (2) Nhắc đi nhắc lại n chu kỳ Nhiệt độ (oC) Chu ChuChu Chu kỳ kỳkỳ kỳ phản phảnphản phản ứng ứngứng ứng PCR PCRPCR PCR gồm gồmgồm gồm 3 33 3 bớc bớcbớc bớc đợc đợcđợc đợc lập lậplập lập đi điđi đi lập lậplập lập lại lạilại lại nhiều nhiềunhiều nhiều lần lầnlần lần. . Nhờ NhờNhờ Nhờ vậy, vậy,vậy, vậy, trong trongtrong trong vài vàivài vài giờ giờgiờ giờ ta tata ta có cócó có thể thểthể thể thu thuthu thu đợc đợcđợc đợc hàng hànghàng hàng triệu triệutriệu triệu bản bảnbản bản copy copycopy copy của củacủa của một mộtmột một đoạn đoạnđoạn đoạn ADN ADNADN ADN nào nàonào nào đó, đó,đó, đó, đủ đủđủ đủ cho chocho cho các cáccác các mục mụcmục mục đích đíchđích đích thí thíthí thí nghiệm nghiệmnghiệm nghiệm khác kháckhác khác nhau nhaunhau nhau. . GĐ2 G Đ 3 Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC) GiaiGiai đoạn 1: đoạn 1: GiãnGiãn xoắn ADN xoắn ADN (DNA (DNA denaturationdenaturation)) Các thành phần phản ứng gồm có Trình tự ADN đích, các đoạn mồi ADN, dNTP, Taq ADN Polymeraza Trình tự đích: thông thờng 3000 bp (max. 10kb) Tr ì nh tự đợc xác định bởi một cặp mồi đặc hiệu, thờng là Tr ì nh tự đợc xác định bởi một cặp mồi đặc hiệu, thờng là một chuỗi oligonucleotít có khoảng 20 nucleotít (trình tự càng dài, tính đặc hiệu càng cao, thờng 16 nucleotít) Nhiệt độ phản ứng đợc tăng lên 95 o C để làm giãn xoắn sợi ADN đích mạch kép (kéo dài khoảng 0,5 đến 2 phút) Thời gian giai đoạn này càng dài, hiệu quả giãn xoắn càng cao nhng làm giảm hoạt tính của enzym và có thể gây biến tính sợi khuôn. MgMg 2+ 2+ là nhân tố cần bổ sung là nhân tố cần bổ sung vào phản ứng PCRvào phản ứng PCR Việc bổ sung Mg 2+ vào phản ứng PCR giúp làm ổn định các mối tơng tác giữa: oligonucleotít và sợi ADN khuôn oligonucleotít và sợi ADN khuôn ADN Polymeraza và sợi khuôn  NhiÖt ®é cao g©y biÕn tÝnh ph©n tö ADN vµ gi·n xo¾n hai sîi ®¬n Sîi ADN ban ®Çu Sîi ADN ban ®ÇuSîi ADN ban ®Çu Sîi ADN ban ®Çu 2 Sîi ADN sau khi gi·n xo¾n 2 Sîi ADN sau khi gi·n xo¾n2 Sîi ADN sau khi gi·n xo¾n 2 Sîi ADN sau khi gi·n xo¾n 95 o C Giai đoạn 2: Gắn Primer (priming)Giai đoạn 2: Gắn Primer (priming) Nhiệt độ giảm đi 15 25 o C Các đoạn mồi (primer) gắn vào đầu 5 của 2 sợi đơn ADN Quá tr ì nh kéo dài khoảng 0,5 - 2 phút Quá tr ì nh kéo dài khoảng 0,5 - 2 phút Thời gian càng ngắn, tính gắn đặc hiệu càng cao nhng làm giảm hiệu suất của quá trình tổng hợp ADN Cần phải biết trình tự ở đầu 5 của primer (tơng ứng với đầu 3 của sợi ADN khuôn [...]... trong PCR Tuy nhiên, kỹ thuật PCR cũng có thể đợc áp dụng để nhân bản và phân tích các đoạn ADN có trật tự nucleotít cha biết Trong phần này, cải tiến cho phép cha biết rõ, đó (anchored PCR) , PCR = IPCR) chúng ta làm quen với hai kỹ thuật PCR tách đợc dòng các đoạn ADN có trình tự là: 1) Kỹ thuật PCR dạng mỏ neo và 2) Kỹ thuật PCR ngợc (Inverse Kỹ thuật PCR dạng mỏ neo (Anchored PCR) Trong trờng hợp thông... 16 bản sao Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR 30 40 chu kỳ của 3 bớc Bớc 1: biến tính 1 phút 94oC Bớc 2: gắn primer 45 giây 54oC Primer Bớc 3: polymer hoá 2 phút 72oC dNTP ứng dụng của kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống thực vật Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn ADN * cha biết trật tự nucleotít * Sử dụng PCR để lập bản đồ di truyền * Cung cấp các chỉ thị phân tử cho các chơng trình chọn tạo giống cây trồng... PolyG CCCCCC GGGG CCCC N2 Phản ứng PCR diễn ra với đoạn mồi đặc hiệu tơng ứng với trình tự X (Px) đã biết và đoạn mồi PolyG N1 X N2 Px Kỹ thuật PCR ngợc (Inverse PCR= IPCR) Bằng kỹ thuật PCR ngợc ngời ta còn có thể nhân bản đợc các đoạn ADN nằm ngoài primer ở đây phân tử ADN đợc cắt ra và nối lại thành dạng vòng nhờ enzym cắt giới hạn và enzym nối Trong trờng hợp này, ta sử dụng các primer mà sự kéo dài... trình tự đã biết Chu kỳ PCR thứ nhất Chu kỳ PCR thứ n 2n phân tử Sử dụng pcr để lập bản đồ di truyền Bản đồ di truyền là một sơ đồ gồm những chỉ thị phân tử hoặc chỉ thị kiểu hình sắp xếp gần nhau, cần cho sự phân tích hệ gen, ngày càng đợc sử dụng rộng rãi trong các chơng trình chọn giống thực vật, đặc biệt trong các nghiên cứu chuyển gen hoặc tách dòng gen Trớc đây, khi các kỹ thuật sinh học phân tử... oligonucleotít chọn lọc (2-4 nucleotít) ở đầu 3 vào vị trí vừa cắt của các enzym giới hạn để định hớng cho việc gắn primer của phản ứng PCR 3) Gắn mồi vào vị trí adaptor và thực hiện phản ứng PCR Bằng sự thay đổi số lợng và trật tự các oligonucleotít chọn lọc ở đầu nối ta nhận đợc các đoạn ADN đợc nhân bản khác nhau Sản phẩm PCR (các đoạn ADN ngắn) sau đó đợc phân tách bằng phơng pháp chạy trên gel và phân... thị dựa trên lai ADN (Southern blotting) RFLP 2 Chỉ thị dựa trên PCR: STS, AFLP, SSR, RAPD, Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr trong chọn giống thực vật 2 Chỉ thị ADN dựa trên PCR Nguyên tắc chung: Tính biến dị di truyền giữa các cá thể có thể đợc phát hiện nhờ sự sai khác về chiều dài đoạn ADN đợc nhân bản nhờ PCR khi sử dụng cùng một cặp Primer Sự đa dạng về chiều dài đoạn đợc nhân bản... Hơn nữa, nhiều tính trạng nông học ở cây trồng do nhiều gen phối hợp kiểm soát và sự biểu hiện của chúng khác nhau ở các giai đoạn phát triển Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr trong chọn giống thực vật Chỉ thị phân tử 1 Chỉ thị ISOZYM Isozym là những dạng enzym có hoạt tính xúc tác tơng tự hoặc giống nhau (cùng phản ứng hoá học) nhng có các đặc tính hoá học (độ pH tối u, điểm đẳng điện, chất... Trớc đây, khi các kỹ thuật sinh học phân tử cha phát triển, việc chọn giống thực vật đợc thực hiện trên cơ sở các chỉ thị kiểu hình Tuy vậy, các chỉ thị kiểu hình thờng phức tạp và không đủ phong phú để lập bản đồ di truyền chính xác Ngày nay với sự phát triển của các kỹ thuật ADN, các chỉ thị phân tử ngày càng đợc sử dụng phổ biến Sử dụng pcr để lập bản đồ di truyền Các chỉ thị ADN thờng đợc dùng trớc... đồ 2 Xác định tần số tái tổ hợp xảy ra trong quần thể đó 3 Xác định nhóm liên kết 4 Xác định vị trí tơng đối của gen/chỉ thị phân tử trên nhiễm sắc thể Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr trong chọn giống thực vật Một chỉ thị phải có 2 yêu cầu cơ bản: 1 Có sự khác biệt giữa có thể bố và cơ thể mẹ 2 Đợc di truyền ổn định cho hậu thế Chỉ thị hình thái - áp dụng cho các tính trạng do 1 locut kiểm... thành phần và trật tự các axít amin); vì vậy, có thể phân tách đợc bằng điện di - Isozym đa gen: là các isozym đợc mã hoá bởi 2 hay nhiều gen, có thể phân biệt đợc bằng hoá miễn dịch hoặc dựa trên đặc tính enzym Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr trong chọn giống thực vật Chỉ thị phân tử 2 Chỉ thị ADN Do sự đa dạng của ADN, các chỉ thị này đa dạng hơn rất nhiều so với chỉ thị hình thái và isozym; . Kỹ thuật PCR và ứng dụng Kỹ thuật PCR và ứng dụng trong chọn tạo giống thực vậttrong chọn tạo giống thực vật Đ ĐĐ ĐĐ ĐĐ Đại học khoa học tự nhiên ại. dụng của kỹ thuật PCR ng dụng của kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống thực vậttrong chọn tạo giống thực vật Sử dụng PCR để tách dòng các đoạn ADN * cha biết trật tự nucleotít * Sử dụng PCR để lập. chính 1. Giãn xoắn (denaturation) : Hai sợi của chuỗi xoắn kép Nguyên tắc của kỹ thuật PCRNguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ K Kỹ Kỹ thuật thuậtthuật thuật PCR PCRPCR PCR dựa dựadựa dựa trên trêntrên trên sự sựsự sự xúc xúcxúc xúc