kỹ thuật pcr và ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật

kỹ thuật pcr và ứng dụng trong chọn tạo giống thực vật

Kü thuËt PCR vµ øng dông

trong chän t¹o gièng thùc vËt

§§§§§§§§¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn ¹i häc khoa häc tù nhiªn - §§§§§§§§¹i häc quèc gia hµ néi ¹i häc quèc gia hµ néi

Khoa sinh häc

Khoa sinh häc - bé m«n di truyÒn häc

trong chän t¹o gièng thùc vËt

Hµ néi, th¸ng 12 / 2003

Khó có thể diễn tả hết ý nghĩa và vai trò của

kỹ thuật PCR trong lĩnh vực công nghệ sinh học ngày nay

học ngày nay ĐĐĐĐây là một phương pháp dễ ây là một phương pháp dễ

dàng và nhanh chóng để có thể tách dòng

và nhân lên một số lượng vô hạn mọi đoạn tr

trìììình tự ADN Sự phát minh của kỹ thuật tr nh tự ADN Sự phát minh của kỹ thuật

trìììình tự ADN Sự phát minh của kỹ thuật nh tự ADN Sự phát minh của kỹ thuật

mạng” thúc đẩy sự phát triển của Công thúc đẩy sự phát triển của Công

nghệ Sinh học hiện đại.

J Watson

Tổng quan về kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR là một phương pháp in vitro cho phép nhân

nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một số lượng mẫu

ban đầu rất nhỏ Một đoạn ADN bất kỳ (thường ≤10 kb) có thể

được nhân lên thành hàng triệu bản sao chỉ trong vòng vài giờ.

Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đã trở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phần lớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và ADN thuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môi trường, y tế, dược phẩm, pháp y…

Nhờ phương pháp này, ngày nay chúng ta có thể tiến hành

phân lập, xác định, giải mã trình tự các gen; và đi sâu nghiên cứu chức năng, cũng như biểu hiện của gen trong quá trình

phát triển và trong việc phản ứng với các điều kiện môi trường.

Một chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn chính

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR Kỹ

Kỹ thuật thuật thuật PCR PCR PCR dựa dựa dựa trên trên trên sự sự sự xúc xúc xúc tác tác tác của của của enzym enzym enzym ADN ADN polymeraza

polymeraza để để để nhân nhân nhân bản bản bản một một một đoạn đoạn đoạn ADN ADN ADN nhờ nhờ nhờ hai hai hai đoạn đoạn đoạn mồi mồi oligonucleotít

oligonucleotít (primer) (primer) (primer) tương tương tương hợp hợp hợp với với với hai hai hai đầu đầu đầu 3333’ ởởởở hai hai hai mạch mạch

đơn

đơn của của của đoạn đoạn đoạn ADN ADN

tương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các bazơ nitơ.

trùng hợp phân tử ADN được thực hiện nhờ enzym ADN polymeraza để kéo dài mạch bổ sung theo nguyên tắc bổ trợ với sợi khuôn.

Nguyªn t¾c cña kü thuËt PCR

Hçn hîp ph¶n øng PCR

G§1

G§3

B¾t ®Çu chu kú míi (2)

Nh¾c ®i nh¾c l¹i n chu kú

–Trình tự được xác định bởi một cặp mồi đặc hiệu, thường là

–Trình tự được xác định bởi một cặp mồi đặc hiệu, thường là một chuỗi oligonucleotít có khoảng 20 nucleotít (trình tự càng dài, tính đặc hiệu càng cao, thường ≥ 16 nucleotít)

sợi ADN đích mạch kép (kéo dài khoảng 0,5 đến 2 phút)

–Thời gian giai đoạn này càng dài, hiệu quả giãn xoắn càng cao nhưng làm giảm hoạt tính của enzym và có thể gây biến tính sợi khuôn

Mg 2+ là nhân tố cần bổ sung

vào phản ứng PCR

làm ổn định các mối tương tác giữa:

 Nhiệt độ cao gây biến tính phân tử ADN

và giãn xoắn hai sợi đơn

95 o C

Giai ®o¹n 2: G¾n Primer (priming)

ADN

Qu¸ tr×nh kÐo dµi kho¶ng 0,5 - 2 phót

nh−ng lµm gi¶m hiÖu suÊt cña qu¸ tr×nh tæng hîp

ADN

CÇn ph¶i biÕt tr×nh tù ë ®Çu 5’ cña primer (t−¬ng øng víi ®Çu 3’ cña sîi ADN khu«n

primer Sợi ADN mới

ADN đích

Sợi ADN mới

C¸c tiªu tiªu chÝ chÝ chän chän läc läc ®o¹n ®o¹n måi måi

c¸c baz¬ nit¬ bæ sung)

Giai đoạn 3: polymer hoá phân tử ADN (DNA Polymerization)

Do Taq polymeraza hoạt động tối ưu ở nhiệt

độ 75oC (nhiệt độ ở suối nước nóng của Vi

khuẩn Thermus aquaticus là loài vi khuẩn

phát hiện ra Taq polymeraza), nhiệt độ của

phản ứng ở giai đoạn này thường được nâng

lên 72-75oC

lên 72-75 C

mồi đã được gắn vào sợi khuôn và xúc tác

cho phản ứng trùng hợp (polymer hoá) phân

tử ADN mới theo nguyên tắc bổ sung các

các bazơ nitơ, với ngnồn bazơ nitơ tự do là

dNTP Với sợi khuôn là sợi đơn đã được

giãn xoắn ở giai đoạn 1

Tốc độ trùng hợp đạt khoảng 150 nucleotít /

giây

Chiều tổng hợp ADN

Một số nhược điểm của

Một số nhược điểm của Taq Taq polymeraza

hợp phân tử ADN mới

theo nguyên tắc bổ trợ (xác suất thấp), dẫn đến có lỗi về trình tự trong một số trường hợp.

nhưng tốc độ tổng hợp ADN và hiệu suất phản ứng PCR không cao bằng Taq-polymeraza

Sîi ADN ban ®Çu

Ph¶n øng chuçi trïng hîp PCR

30 – 40 chu kú cña 3

b−íc B−íc 1: biÕn tÝnh

ứng dụng của kỹ thuật PCR ng dụng của kỹ thuật PCR trong chọn tạo giống thực vật

Sử dụng PCR để lập bản đồ di truyền Sử dụng PCR để lập bản đồ di truyền * *

Sử dụng pcr để tách dòng các

đoạn ADN có tr

đoạn ADN có trìình tự chưa biết nh tự chưa biết

việc thiết kế các primer cần phải biết các trình tự nucleotít ởvùng biên của đoạn ADN đó Ví dụ, để phân lập các gen ởthực vật mã hoá cho enzym kinaza, người ta sử dụng cácthông tin hiện có về trật tự của prôtêin kinaza từ các cơ thểkhác để thiết kế cho primer dùng trong PCR Tuy nhiên, kỹthuật PCR cũng có thể được áp dụng để nhân bản và phântích các đoạn ADN có trật tự nucleotít chưa biết

cải tiến cho phép tách được dòng các đoạn ADN có trình tự

PCR = IPCR)

Trong tr−êng hîp th«ng tin vÒ

tr×nh tù nucleotÝt cña ®o¹n

L¾p ®o¹n má neo PolyC

n»m ë ®Çu cã trËt tù ch−a biÕt

cña ®o¹n ADN hay cADN sÏ

thay thÕ cho nh÷ng th«ng tin vÒ

trËt tù ch−a biÕt nµy Mét trËt

t− nucleotÝt t−¬ng hîp (theo

nguyªn t¾c bæ trî) víi ®u«i

homopolyme nµy hay cßn gäi lµ

®o¹n kiÓu má neo ®−îc dïng

nh− mét trËt tù måi cho viÖc

Px PolyG

Kỹ thuật PCR ngược

(Inverse PCR=IPCR)

Bằng kỹ thuật PCR ngược

người ta còn có thể nhân bản

được các đoạn ADN nằm ngoài

primer ở đây phân tử ADN

được cắt ra và nối lại thành

dạng vòng nhờ enzym cắt giới

hạn và enzym nối Trong

Điểm cắt của enzym giới hạn

Phân cắt bởi enzym giới hạn Gắn lại

trình tự đã biết

Gắn primer tại trình tự đã biết

hạn và enzym nối Trong

trường hợp này, ta sử dụng các

primer mà sự kéo dài của

chúng xảy ra theo hướng ngược

nhau ở hai sợi ADN; sự kéo dài

ấy sẽ vượt qua ranh giới điểm

Sử dụng pcr để lập bản đồ di truyền

Bản đồ di truyền là một sơ đồ gồm những chỉ thị phân tử hoặc

chỉ thị kiểu hình sắp xếp gần nhau, cần cho sự phân tích hệgen, ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các chương trìnhchọn giống thực vật, đặc biệt trong các nghiên cứu chuyển genhoặc tách dòng gen Trước đây, khi các kỹ thuật sinh học phân

tử chưa phát triển, việc chọn giống thực vật được thực hiệntrên cơ sở các chỉ thị kiểu hình Tuy vậy, các chỉ thị kiểu hìnhthường phức tạp và không đủ phong phú để lập bản đồ ditruyền chính xác Ngày nay với sự phát triển của các kỹ thuậtADN, các chỉ thị phân tử ngày càng được sử dụng phổ biến

Sử dụng pcr để lập bản đồ di truyền

Các chỉ thị ADN thường được dùng trước đây là chỉ thị vềchiều dại đoạn phân cắt bằng enzym giới hạn (RFLP) Tuynhiên để thực hiện phép phân tích RFLP, người ta thường phảikết hợp với kỹ thuật thẩm tách Southern (Southern blotting),rất tốn công và phức tạp Với sự ra đời của kỹ thuật PCR,người ta đã phát triển nên nhiều dạng dấu chuẩn di truyền với

nhiều ưu điểm hơn như AFLP, SSR, STS, RAPD, …

Quy trình xây dựng một bản đồ di truyền phải trải qua cácbước sau:

Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr

- áp dụng cho các tính trạng do 1 locut kiểm soát sự biểu hiện

mà không ảnh hưởng do tác động của môi trường

Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị (marker-assisted selection)

- Phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị (marker-assisted selection)

được sử dụng khi tính trạng cần nghiên cứu liên kết với mộttính trạng khác dễ dàng phát hiện bằng hình thái Ví dụ: ở lúa,tính trạng kháng bệnh rầy nâu liên kết chặt chẽ với gen quy

định màu tím của bao lá mầm

- Tuy nhiên, những chỉ thị hình thái có thể sử dụng trong thựctiễn chọn giống ở thực vật không nhiều Hơn nữa, nhiều tínhtrạng nông học ở cây trồng do nhiều gen phối hợp kiểm soát và

sự biểu hiện của chúng khác nhau ở các giai đoạn phát triển

Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr

tính hoá học (độ pH tối −u, điểm đẳng điện, chất ức chế, …)

khác nhau Trên cơ sở đặc điểm di truyền, có thể chia làm 2loại:

- Isozym đơn gen: là các isozym chịu sự kiểm soát của một gen,

đ−ợc hình thành từ các chuỗi polypeptít đơn, nh−ng có cáckiểu phân tử khác nhau (v.d: về thành phần và trật tự các axítamin); vì vậy, có thể phân tách đ−ợc bằng điện di

- Isozym đa gen: là các isozym đ−ợc mã hoá bởi 2 hay nhiềugen, có thể phân biệt đ−ợc bằng hoá miễn dịch hoặc dựa trên

đặc tính enzym

Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr

trong chọn giống thực vật

Chỉ thị phân tử

2 Chỉ thị ADN

Do sự đa dạng của ADN, các chỉ thị này đa dạng hơn rất nhiều

so với chỉ thị hình thái và isozym; ổn định, và không phụthuộc vào các yếu tố môi trường Các chỉ thị ADN ngàycàng được sử dụng cho nhiều mục đích nghiên cứu khácnhau:

cùng một loài, hoặc giữa các loài), phát hiện loài mới vàmối quan hệ di truyền

Các chỉ thị ADN được chia làm 2 nhóm lớn:

1 Chỉ thị dựa trên lai ADN (Southern blotting) – RFLP

2 Chỉ thị dựa trên PCR: STS, AFLP, SSR, RAPD, …

Nguyên tắc sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr

trong chọn giống thực vật

2 Chỉ thị ADN dựa trên PCR

Nguyên tắc chung: Tính biến dị di truyền giữa các cá thể có

thể được phát hiện nhờ sự sai khác về chiều dài đoạn ADN

được nhân bản nhờ PCR khi sử dụng cùng một cặpPrimer Sự đa dạng về chiều dài đoạn được nhân bản

về bazơ nitơ trong điểm liên kết primer, hoặc do sự sắp xếplại trình tự của các nucleotít trong đoạn ADN

thể dùng enzym giới hạn để cắt các sản phẩm PCR, theonguyên tắc của RFLP Phương pháp tìm dấu chuẩn này gọi

RFLP dựa trên PCR

Chỉ thị phân tử STS sEQUENCE TAGGED SITES

Nguyên tắc

ngắn (60 – 1000 bp) Trên cơ sở trình tự ADN đã được biếttrước, người ta thiết kế 2 cặp mồi có trình tự đặc thù

- Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotít, có

Dấu chuẩn STS = PCR + cặp mồi đặc hiệu (tr

Dấu chuẩn STS = PCR + cặp mồi đặc hiệu (trìììình tự đoạn ADN đã biết) nh tự đoạn ADN đã biết)

- Các đoạn mồi STS thường chứa khoảng 20 nucleotít, có

tính đặc hiệu cao

dụng nguyên tắc RFLP với các mẫu dò là các dòng cADN

Ví dụ sử dụng:

• Dùng cho việc lập bản đồ di truyền của từng locút

như các sản phẩm chuyển gen, kiểm tra sự phân ly của các

gen biến nạp, …

ChØ thÞ ph©n tö STS sEQUENCE TAGGED SITES

Chỉ thị AFLP amplified fragment length polymorphism

Nguyên tắc

- Dấu chuẩn AFLP thường được xây dựng qua 3 bước:

1) Dùng các enzym giới hạn cắt các trình tự ADN sợi kép thành

các đoạn nhỏ có kích thước khác nhau.

2) Gắn các đoạn nối (adaptor) như nhau, gồm khoảng 20

nucleotít mang một trình tự oligonucleotít chọn lọc (2-4

Dấu chuẩn AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu

nucleotít mang một trình tự oligonucleotít chọn lọc (2-4 nucleotít) ở đầu 3– vào vị trí vừa cắt của các enzym giới hạn

để định hướng cho việc gắn primer của phản ứng PCR.

3) Gắn mồi vào vị trí adaptor và thực hiện phản ứng PCR.

Bằng sự thay đổi số lượng và trật tự các oligonucleotít chọn lọc ở đầu nối ta nhận được các đoạn ADN được nhân bản khác nhau

Sản phẩm PCR (các đoạn ADN ngắn) sau đó được phân tách

bằng phương pháp chạy trên gel và phân tích tính đa hình của các băng điện di.

ChØ thÞ AFLP amplified fragment length polymorphism

B−íc 1

ADN hÖ gen tæng sè C¾t b»ng enzym giíi h¹n

G¾n ®o¹n nèi (adaptor)

G¾n ®o¹n måi

Thùc hiÖn ph¶n øng PCR

DÊu chuÈn ADN

ChØ thÞ AFLP amplified fragment length polymorphism

B−íc 2

§o¹n chän läc

TGGT AATTCCCA

CGGTCAGGACTCAT CAGTCCTGAGTAGCAG

Chỉ thị AFLP amplified fragment length polymorphism

Chỉ gắn huỳnh quang trên đoạn mồi EcoR1.

Tính đặc hiệu của trình tự nucleotít 3+3 = (1/4)6=1/4096

Số mảnh PCR phát hiện đ−ợc = 475,000/4096 ~ 115

ChØ thÞ AFLP amplified fragment length polymorphism

C¸c kiÓu gen bè, mÑ C¸c kiÓu gen con l¹i F1 SHxRH

Chỉ thị SSR Simple sequence repeates

Nguyên tắc

- Dấu chuẩn SSR thường được chuẩn bị qua các bước sau:

1) Tách các đoạn ADN mang các trình tự lập lại đơn giản , như

[GATA], [CGA], [GC].

2) Xác định trình tự tại các vùng biên của các trình tự lặp lại.

Dấu chuẩn SSR = PCR + cặp mồi tại vùng biên của các tr

Dấu chuẩn SSR = PCR + cặp mồi tại vùng biên của các trìììình tự lặp lại nh tự lặp lại

2) Xác định trình tự tại các vùng biên của các trình tự lặp lại 3) Thiết kế mồi tương ứng cho các trình tự tại vùng biên.

4) Thực hiện phản ứng PCR với các nucleotít được đánh dấu

phóng xạ.

5) Đánh giá tính đa dạng về các trình tự lặp lại (SSR

polymorphism) trên cơ sở các sản phẩm thu được từ phản ứng PCR (dùng phương pháp phóng xạ tự chụp).

Chỉ thị SSR Simple sequence repeats/microsatelittes

Kiểu gen A

Thực hiện phản ứng PCR với các nucleotít đ−ợc

đánh dấu phóng xạ / không đánh dấu phóng xạ

Kiểu gen A Kiểu gen B

ChØ thÞ SSR Simple sequence repeats/microsatelittes

ChØ thÞ SSR cho thÊy sù tån t¹i nhiÒu alen trªn mét locót trong quÇn thÓ thÝ nghiÖm

Chỉ thị RAPD random amplified polymorphic DNA

Nguyên tắc

Dấu chuẩn RAPD có một số đặc tính sau:

1) Dấu chuẩn ngẫu nhiên không cần biết trước trình tự ADN.

2) Số lượng mồi không hạn chế.

3) Các đoạn mồi thường chứa 9 - 12 nucleotít (tối thiểu là 4) có

Dấu chuẩn RAPD = PCR + các cặp mồi ngẫu nhiên

3) Các đoạn mồi thường chứa 9 - 12 nucleotít (tối thiểu là 4) có

trình tự ngẫu nhiên (hiện nay, được sử dụng phổ biến là các

đoạn mồi có 10 nucleotít).

4) Các đoạn mồi sẽ gắn vào các trình tự ngẫu nhiên trong hệ gen

và khi khoảng cách giữa 2 đoạn mồi đủ lớn (200 – 2000 nucleotít), thì phản ứng PCR sẽ diễn ra giữa 2 đoạn mồi đó.

ChØ thÞ Rapd random amplified polymorphic dna

B¨ng 3: B¨ng RAPD #2

ChØ thÞ Rapd random amplified polymorphic dna

B¨ng ®iÖn di RAPD 2 dßng ng« A&B; c¸c primer 2, 4 vµ 5 cho thÊy sù kh¸c biÖt vÒ dÊu chuÈn RAPD cña chóng

Sử dụng Các chỉ thị dựa vào pcr trong chọn

giống thực vật

Ngoài các chỉ thị phân tử dựa trên PCR đã được minh hoạ ở trên Trên

cơ sở kỹ thuật PCR, người ta đã phát triển lên nhiều loại chỉ thịkhác, như EST (expressed sequence tag); VNTR (variablenumber tandem repeats), …

Hiện nay, các tồn tại liên quan đến sử dụng các chỉ thị phân tử

trong chọn tạo giống thực vật, bao gồm: