1) Dùng các enzym giới hạn cắt các trình tự ADN sợi kép thànhcác đoạn nhỏ có kích th−ớc khác nhau. các đoạn nhỏ có kích th−ớc khác nhau.
2) Gắn các đoạn nối (adaptor) nh− nhau, gồm khoảng 20nucleotít mang một trình tự oligonucleotít chọn lọc (2-4 nucleotít mang một trình tự oligonucleotít chọn lọc (2-4 Dấu chuẩn AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu
Dấu chuẩn AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệuDấu chuẩn AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu Dấu chuẩn AFLP = Enzym giới hạn + PCR + cặp mồi đặc hiệu
nucleotít mang một trình tự oligonucleotít chọn lọc (2-4 nucleotít) ở đầu 3– vào vị trí vừa cắt của các enzym giới hạn để định h−ớng cho việc gắn primer của phản ứng PCR.
3) Gắn mồi vào vị trí adaptor và thực hiện phản ứng PCR.
Bằng sự thay đổi số l−ợng và trật tự các oligonucleotít chọn lọc ở đầu nối ta nhận đ−ợc các đoạn ADN đ−ợc nhân bản khác nhau.
Sản phẩm PCR (các đoạn ADN ngắn) sau đó đ−ợc phân tách bằng ph−ơng pháp chạy trên gel và phân tích tính đa hình của các băng điện di.
Chỉ thị AFLP
Chỉ thị AFLP amplified fragment length polymorphismamplified fragment length polymorphism
B−ớc 1B−ớc 1 B−ớc 1
ADN hệ gen tổng số
Cắt bằng enzym giới hạn
Gắn đoạn nối (adaptor)
Gắn đoạn mồi
Thực hiện phản ứng PCR
Chỉ thị AFLP
Chỉ thị AFLP amplified fragment length polymorphismamplified fragment length polymorphism
B−ớc 2B−ớc 2 B−ớc 2 Đoạn chọn lọc TGGT AATTCCCA GGGT
Các đoạn ADN đ−ợc cắt giới hạn
ACCAGC
Gắn các đoạn nối
AATTCCCA
CTCGTAGACTGCGTACC
CTGACGCATGGTTAAGGGT
Đoạn nối EcoR1
TGGTACCAGC ACCAGC
CGGTCAGGACTCATCAGTCCTGAGTAGCAG CAGTCCTGAGTAGCAG
Mồi AFLP
Đoạn nối Taq1
CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCCAGAGCATCTGACGCATGGTTAAGGGT GAGCATCTGACGCATGGTTAAGGGT TGGTCGGTCAGGACTCATCGTC ACCAGCCAGTCCTGAGTAGCAG CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCCA Mồi AFLP ACCAGCCAGTCCTGAGTAGCAG GAGCATCTGACGCATGGTTAAGGGT GAGCATCTGACGCATGGTTAAGGGT GAGCATCTGACGCATGGTTAAGGTA CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCC A CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCC A CTCGTAGACTGCGTACCAATTCCC A Khuyếch đại bằng phản ứng PCR
Trình tự không đ−ợc khuyếch đại Đoạn chọn lọc
Chỉ thị AFLP
Chỉ thị AFLP amplified fragment length polymorphismamplified fragment length polymorphism Số dấu chuẩn chọn lọc Số dấu chuẩn chọn lọc Kích cỡ hệ gen cà chua: 950 Mbp Tần số cắt của EcoR1 (6 bp): 1/2000-2500 bp Tần số cắt của Mse1 (4 bp): 1/300-400 bp Tổng số các mảnh cắt: Tổng số các mảnh cắt: EcoR1-Mse1 = 950 Mbp/2000 = 475,000
Chỉ gắn huỳnh quang trên đoạn mồi EcoR1.
Tính đặc hiệu của trình tự nucleotít 3+3 = (1/4)6=1/4096
Chỉ thị AFLP
Chỉ thị AFLP amplified fragment length polymorphismamplified fragment length polymorphism
Các kiểu
Chỉ thị SSR
Chỉ thị SSR Simple sequence repeatesSimple sequence repeates
Nguyên tắc