ứng dụng của vacxin dna trong nuôi trồng thủy sản

ứng dụng của vacxin dna trong nuôi trồng thủy sản

ỨNG DỤNG CỦA VACXIN DNA TRONG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN GVHD

GVHD: Ths. Nguyễn Minh Nhựt Nguyễn Minh Nhựt

Nhóm

Nhóm: Bùi Thị Anh Thư

Lữ Minh Vũ Nguyễn Khánh Ngân Nguyễn Vi Thảo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐH KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.HCM KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC



1.Giới thiệu

 Vacxin có hiệu quả cao nhất trong việc

kiểm soát mầm bệnh lây nhiểm giúp ích

cho việc phòng ngừa 1 số bệnh ở cá tôm…

góp phần tăng năng suất đáp ứng nhu cầu

của người tiêu dùng

 Vacxin DNA được ví như những vacxin

kháng nguyên truyền thống đã thành công

trên nhiều vật nuôi khác

 Ngoài việc tối ưu hóa hiệu quả của vắc-xin

DNA, các vấn đề quan trọng khác, chẳng

hạn như an toàn và chi phí sản xuất sẽ là

yếu tố quyết định cho các ứng dụng tiềm

năng của công nghệ này trong các trang

1.1 Nhu cầu DNA vaccine cho

cá

 Ước tính có khoảng 10% các loài thủy hải sản bị chết do mắc bệnh truyền nhiễm Dịch bệnh có thể gây

ra thiệt hại nghiêm trọng cho nông dân vì trong nhiều trường hợp không có các biện pháp phòng và điều trị sẳn có

 Tác dụng phụ của các thuốc hóa chất làm ảnh hưởng không tốt đến thủy hải sản

 Vacxin đã chứng minh được khả năng phòng bệnh của nó trên hầu hết gia súc và vật nuôi, nhưng ở cá và thủy sản thì vẫn còn nhiều hạn chế

Hình 2 Cá hồi thương phẩm

1.2 Ưu điểm của Vaccine DNA

 Vắc-xin DNA mang lại một số lợi thế so với vắc-xin kháng nguyên cổ điển (tức là giảm độc lực, gây chết toàn bộ và vacxin tiểu đơn vị)

 Chi phí thấp, dễ dàng sản xuất trên quy mô công nghiệp, dễ dàng bảo quản lưu trữ cũng như vận chuyển

 Đáp ứng miễn dịch cơ thể lâu dài và mạnh mẻ, cũng giống như các vacxin truyền thống khác nhưng ở vacxin DNA thì không gây nguy cơ nhiễm trùng cơ hội

 Ở cá, các đáp ứng miễn dịch ít được biết đến sau khi tiêm plasmid, nhưng không

có biểu hiện nào cho thấy nó khác biệt với những ghi nhận ở động vật khác

có biểu hiện nào cho thấy nó khác biệt với những ghi nhận ở động vật khác

2 Cấu trúc Plasmid 2.1 Kiểm soát các yếu tố

 Trình tự để điều khiển phiên mã trong các vectơ tiêu chuẩn (promoter, enhancer, intron, tín hiệu bổ sung, vv) dường như làm việc hiệu quả ở động vật thủy sản

 Các promoter khác nhau quyết định khả năng điều khiển biểu hiện của gen lạ trong các mô cá (bảng 1)

Bảng 1 Các promoter thử nghiệm

trên mô cáBảng 1 Các promoter thử nghiệm

trên mô cá

 Hiệu quả của chúng khác nhau đáng kể, nhưng nói chung các cytomegalovirus (CMV) ngay lập tức cho kết quả tốt nhất

 Các yếu tố phiên mã khác trong vắc-xin DNA không có giá trị trong cá, nhưng có những dấu hiệu cho thấy trong nghiên cứu in vitro intron động vật có vú không phải lúc nào cũng có thế áp dụng cho tế bào cá

 Các tính năng tùy chọn của các khung vector như epitope Th không liên quan đến việc bổ sung T , quá trình miễn dịch CpG, hoặc cho những gen thể hiện tương đương như các cytokine hoặc các phân tử costimulatory, cuối cùng được bổ sung vào vắc-xin DNA

vào vắc-xin DNA

 Trình tự để kiểm soát phiên mã trong các vectơ tiêu chuẩn (promoter, enhancer, intron, tín hiệu bổ sung, vv) dường như có hiểu quả ở thủy sản./

2.2 Mã hóa gen kháng nguyên

 Bất kỳ gen mã hóa cho một loại protein của mầm bệnh gây ra một đáp ứng miễn dịch bảo vệ vật chủ có thể được sử dụng trong các vắc-xin DNA, miễn là việc sử dụng codon của gen cho phép thể hiện trong các tế bào cá

 Để tạo ra các phản ứng miễn dịch, đầu tiên kháng nguyên tế bào B phải được kích hoạt Vì vậy, các hoạt chất tiết ra của gen ngoại lai có thể ảnh hưởng đến việc sản xuất kháng thể Tuy nhiên, phản ứng miễn dịch là có thể ngay cả khi kháng nguyên không được tiết ra

 Trong trường hợp kháng nguyên không tiết ra, tế bào B-không được kích hoạt đầy

đủ, trừ khi kháng nguyên được giải phóng từ các tế bào

đủ, trừ khi kháng nguyên được giải phóng từ các tế bào đã được biến nạp Chẳng hạn như phân giải bởi kháng nguyên gây độc tế bào tế bào lympho T (CTL)

 Do đó vắc-xin DNA có thể bao gồm một peptide tín hiệu để tiết trực tiếp kháng nguyên đã được mã hóa, nhưng quá trình không xảy ra tuyệt đối

2.3 DNA là m ột phân tử gây kích

thíc h inte rleukin-2 đáp ứ ng m iễ n dịc h

m ạnh c ytokin c ho c á :

 Phản ứng miễn dịch mạnh gây ra bởi chủng ngừa DNA không phụ thuộc hoàn toàn vào biểu hiện của kháng nguyên

vào biểu hiện của kháng nguyên

 Trong thực tế, nó là các trình tự ADN ngắn có chứa dinucleotides CpG unmethylated trong điều kiện cụ thể có thể trực tiếp kích thích tế bào hệ miễn dịch như đơn bào, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai(dendritic te bao mien dich)

như đơn bào, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai(dendritic te bao mien dich)

Hình 3 Đáp ứng chế tiết cytokine của đại thực bào và chức năng

của các cytokine do đại thực bào chế tiết Hình 3 Đáp ứng chế tiết cytokine của đại thực bào và chức năng

của các cytokine do đại thực bào chế tiết

 Những hoạt chất tiết ra kích thích hệ miễn dịch được gọi là CpG-S trong điều kiện bất lợi, các họat CpG khác trung hòa hoặc chặn kích hoạt miễn dịch bởi các CpG-S motifs được gọi là các CpG-N motifs.

 Vectơ DNA plasmid được sử dụng để tiêm chủng cho cá chắc chắn chứa CpG-S

và các CpG-N trong chuỗi

 Nó có thể là một khung tối ưu hóa CpG , có chứa một số lượng tối ưu của các CpG-S đặc hiệu cho cá và sự giảm sút của các mô-típ-N CpG có thể cải thiện đáp ứng miễn dịch ở cá, và có thể cho phép quản lý với lượng nhỏ hơn của DNA

3 Phương pháp

3.1 Tiê m

3.1.1 Vị trí tiê m

 Plasmid DNA được tinh sạch trong một thể tích nhỏ của nước muối hoặc dung dịch

đệm

 Được sử dụng để tiêm cơ bên sườn, bên dưới hoặc gần vây lưng.

 Tiêm vào mang kết quả cho thấy không thấy hoạt động của gene chỉ thị , trong khi nó

tồn tại ở phúc mạc

Ví dụ :

 Ở chuột:

 Tiêm trực tiếp vào cơ bắp (IM) mũi tiêm sẽ gây ra đáp ứng chủ yếu loại Thl, với tỷ

lệ IgG2a : IgGl cao, interferon IFN-γ và mức độ thấp interleukin IL(-4).

 Tiêm vào gene biểu bì sẽ gây ra đáp ứng dạng Th2, biểu hiện ưu thế của IgG1 đối với IgG2a, kém hơn IFN-γ và cao hơn IL-4

 Tiêm DNA vào trong da (ID) có thể là biểu hiện loại Th1 hoặc là Th2.

 Ở cá, hầu hết không có thông tin tồn tại trên những tác động khác nhau của phản ứng miễn dịch,do nghiên cứu hạn chế và đặc tính tương đối kém của hệ miển dịch của cá.

3.1.2 Liề u lư ợ ng và thể tíc h:

 Liều lượng lớn thường làm sự giảm hoạt động của gene chỉ thị, nhưng ít có sự biến đổi giữa những cá thể cá

 Liều điển hình cho cá : 1-50 µg DNA

 Trong thể tích khoảng : 10-50 µl DNA

 Tuy nhiên, với liều lượng thấp hơn nhiều cũng có hiệu quả

 Liều lượng tối ưu của DNA có thể thay đổi tùy theo loài và kích thước của động vật, nhưng nó không tỷ lệ thuận đối với trọng lượng của cá

 Ngoài ra, tình trạng sinh lý của động vật có ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện

 VD: : Những con cá chép con ở giai đoạn phát triển nhanh thì mức độ biểu hiện hoạt

động của Chloramphenycol acetyl transferase (CAT) cao hơn rất nhiều so với cá đã trưởng thành.

 Điều thú vị là, biểu hiện của gene chỉ thị Luciferase (được điều khiển bởi promoter CMV ) hoạt động ở cá cao hơn trong cơ bắp chuột sử dụng với cùng 1 liều lượng

DNA Không biết điều này có phải do sự tăng lên ổn định của các protein

luciferase của cá so với tế bào động vật có vú, tới một mức độ biểu hiện cao hơn, hoặc một hiệu quả biến nạp tốt hơn

 Trong thực tế, liều lượng thấp như 0.1 µg DNA cho mỗi con cá có hiệu quả như 10

µg gây bảo vệ miễn dịch

 Điều đó báo trước tiềm năng của ứng dụng vaccine DNA trong trại cá

Bảng 3 PP tiêm và liều DNA thử

nghiệm trên mô cá

Bảng 3 PP tiêm và liều DNA thử

nghiệm trên mô cá

3.1.3 Vị trí biể u hiệ n c ủa ge ne lạ

 Có sự khác biệt rõ ràng trong các tài liệu liên quan tới vị trí biểu hiện của gene lạ sau

khi tiêm vào cơ thể vector plasmid

 Ở những loài cá lớn, biểu hiện của gene chỉ thị dường như chủ yếu giới hạn ở vị trí tiêm.

 Biến nạp vào tế bào không phải tế bào cơ, đặc biệt là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp có thể góp phần hoàn thiện đáp ứng miễn dịch

 Đối với cá nhỏ, biểu hiện của gene chỉ thị luciferase được tiêm vào cơ bắp đã được phát hiện trong các cơ quan khác nhau,có ở gan, lá lách và thận nhưng mức độ cao nhất là trong cơ

 Sự khác nhau hầu hết giữa cá nhỏ và cá lớn có khả năng là do sự phát tán nhanh chóng các DNA được tiêm vào cơ cá nhỏ, nhưng đó có thể có những biến thể trong Protocol ,độ nhạy của thử nghiệm và mẫu động vật sử dụng.

 Ngoài ra các promoter có thể ảnh hưởng tới vị trí biểu hiện gene lạ, như promoter CMV được sử dụng trong các nghiên cứu này.

3.1.4 Thờ i gian biể u hiệ n và hiệ u

quả trê n mô c á

 Tiêm vào cơ bắp IM có hiệu quả trong thời gian dài và mức độ biểu hiện gene tồn tại trong nhiều năm (bảng 3)

Bảng 3 thời gian và hiệu quả hoat động của gene chỉ thị trên mô cáBảng 3 thời gian và hiệu quả hoat động của gene chỉ thị trên mô cá

Nghiê n cứu biể u hiệ n của lucife ras e

 Với lucifer gene, Anderson và cộng

sự đã thấy có sự giảm bớt hoạt tính

của các emzyne sau 7 ngày, nhưng

điều này không đúng ở các enzyme

khác

 Ở chuột,những tế bào biến nạp

luciferase không bị phá hủy bởi CTL

bởi vì không có ( hoặc rất ít) đáp

ứng miễn dịch sinh ra chống lại

protein luciferase do sự kích thích

miễn dịch kém , biểu hiện đã được

nhận thấy trong 2 năm gần nhất.

Nghiê n cứu biể u hiệ n của ge n

lacZ

 Ở chuột, hầu hết các tế bào cơ có biểu hiện của protein miễn dịch đều phá hủy trong khoảng thời gian từ ngày 10 và 20.

 Ở cá,quá trình loại bỏ này cũng xảy

ra nhưng chậm hơn Số lượng galactosida biểu hiện trong tế bào

β-cơ cá giảm từ giữa ngày 21 và 70 sau khi tiêm gene lacZ, nhưng việc

sử dụng pp Đồng tiêm injection) với gene GM-CSF của chuột đã chứng minh có sự đánh dấu trên tỷ lệ biến mất của các sợi

(Co-cơ đã được biến nạp.

 Nghiên cứu mô học với gene chỉ thị lacZ cho thấy giải pháp tiêm DNA tinh khiết

vào cơ cá hồi vân không làm tổn thương mô vĩnh viễn

 Xuất hiện viêm ở chổ tiêm sau khi tiêm, nhưng không có dấu hiệu bị hoại tử, và các mô được tái sinh mà không để lại sẹo vào 28 ngày sau khi tiêm

3.1.5 Lự a c họn thay thế kim tiê m

 Việc thay thế kim tiêm, gene sẽ

được chuyển bằng cách sử dụng hạt

bắn phá, tuy nhiên, kết quả không

tốt như sử dụng kim tiêm ở cả hai

mức độ và tỷ lệ biểu hiện trên gene

chỉ thị ở động vật

 Ngay cả khi hiệu quả kỹ thuật được

cải thiện, cũng không chắc là công

nghệ này sẽ được sử dụng rộng rãi

trong những trại cá bởi vì nó có giá

thành cao và hạn chế về tính thiết

thực ( VD: DNA bị rơi ra khỏi các

hạt vàng nano trong MT ẩm).

3.2 Cho ăn v ac c ine v à ngâm v ac c ine

 Có lợi thế miễn dịch liên quan đến pp cho ăn vaccine , như biểu hiện miễn dịch của hệ niêm mạc

 Ưu điểm:

 Dễ làm và rẻ tiền

 Chúng không gây stress cho vật nuôi

 Khuyết điểm:

 Không thể xác định được lượng DNA

 Đem hiệu quả thấp hơn so với tiêm hoặc ngâm trong việc ngừa bệnh ở cá.

So sánh giữa pp cho ăn và ngâm

vaccine

 Hiệu quả lớn hơn của pp ngâm vaccine so với cho ăn là do kháng thể được hấp thu qua da hoặc qua mang tốt hơn so với ruột, cũng như là thất thoát lượng vaccine qua quá trình tiêu hóa

 Một số thí nghiệm gần đây đã chỉ ra rằng cả trên da và mang đều tham gia hấp thu trong pp ngâm, da( phạm vi hoạt động) có ưu thế hơn.

 Tại thời điểm bài báo cáo này được xem xét, không có ghi nhận vaccine DNA nào dùng cho cá qua pp cho ăn hoặc ngâm

 Bằng việc sử dụng các gene chỉ thị, chúng tôi đã không bao giờ quan sát thấy các mức độ biểu hiện của gene sau khi ngâm hay qua việc cho ăn các plasmid DNA tinh sạch ở cá nhỏ Mặc dù, sự kết hợp của DNA với tác nhân biến nạp như là liposomes hoặc microcarries có thể mang lại kết quả trong biến nạp của cá [Heppel et el.,kết quả chưa được công bố]

 Giả thuyết rằng hai pp ngâm hay cho ăn DNA vaccine có thể khả thi và có hiệu quả

4 Đáp ứ ng miễ n dịc h vớ i DNA

vac c ine s

Khả năng miễn dịch đặc hiệu hoặc mắc phải

 Phụ thuộc rất nhiều vào T và B-lymphocytes.

 Ở động vật có vú, khả năng miễn dịch dịch thể trong các loài vật nuôi đặc biệt liên quan đến việc nhận dạng và lưu thông bắt buộc của kháng nguyên hòa tan trong các tế bào B, sau đó đáp ứng bằng cách sản xuất và tiết ra kháng thể kháng nguyên đặc hiệu

 Mặt khác, khả năng miễn dịch của tế bào đặc hiệu gián tiếp liên quan tới việc nhận dạng : tế bào T nhận diện kháng nguyên hiện diện trên bề mặt tế bào (trong liên kết hóa học ) gắn với các phân tử histocompatibility phức tạp (MHC), khởi động quá trình cảm ứng của tế bào lympho T gây độc tb (CTL) và tế bào T tiết ra cytokines.

 Ở động vật có vú, CD4 và CD8 tế bào T nhận ra kháng nguyên hiện diện bởi các phân

tử MHC II và MHC I tương ứng.

dịch của tế bào và thể dịch Như vậy, chúng thể hiện như là một vaccine sống( live vaccine).

4.1.Đáp ứ ng kháng thể

 DNA vaccine cho phép biểu hiện kháng nguyên ngay tại chổ

 Các gene lạ, đặc biệt là những gene có nguồn gốc virus, sau khi được biến đổi (sau dịch mã và quá trình ghép và dung nạp với các kháng nguyên được sản xuất trong suốt quá trình truyền nhiễm tự nhiên) để có được cấu tạo thích hợp sau đó có thể được trình diện với hệ thống miễn dịch

 Sự hiện diện của các kháng nguyên có liên quan đến epitop ở hệ thống miễn dịch

có thể dễ dàng đạt được với DNA vaccines hơn là những loại vaccines khác, như là vaccines bất hoạt hay tiểu đơn vị, nơi mà các epitop đối xứng có thể bị mất

 Ở động vật có vú, hiệu quả của các đáp ứng kháng thể được gây ra bởi việc tiêm DNA vaccines phụ thuộc vào mẫu động vật và kháng nguyên Đáp ứng thể dịch thường tồn tại lâu dài ở chuột, nhưng xuất hiện là ngắn hơn ở động vật linh trưởng.

Biểu hiện trên cá

 Kháng thể kháng galactosidase đã được phát hiện trong cá vàng sớm nhất là 7 ngày sau khi tiêm DNA mã hóa lacZ

 Ở cá hồi vân, kháng thể với protein G của VHSV đã được tìm thấy 23 ngày sau khi tiêm vào một plasmid mã hóa gene G

 Nồng độ của kháng thể huyết thanh đạt mức cao nhất trong 3 đến 8 tuần và vẫn còn cao trong vài tuần sau, mặc dù số lượng các tế bào kháng thể hình thành suy giảm nhanh chóng

 Trong thực tế, Russel et al cho thấy sau khi tiêm IM một vetor DNA mã hóa galactosidase, chuyển đổi huyết thanh(seroconvert) ở cá vàng thậm chí còn dễ dàng hơn so với ở chuột

β- Đồng thời, Lorenzen và cộng sự đã chứng minh rằng cường độ hoạt động bị vô hiệu hóa ở huyết thanh được thu thập cá hồi vân đã được miễn dịch với DNA plasmid mã hóa gene G của VHSV là sự khác biệt không có ý nghĩa trước và sau khi thử với virus sống

 Những kết quả này cho thấy đáp ứng thể dịch tối đa gần nhất là gây ra một liều vaccine DNA duy nhất

4.2 Đáp ứ ng miễ n dịc h tế bào

 Trong tổng hợp in vivo kháng nguyên bằng việc tiêm vaccines dựa trên DNA là

một đặc tính mong muốn bởi vì nó bắt chước một khả năng lây nhiễm tự nhiên bằng các tác nhân gây bệnh nội bào bằng sự trình diện kháng nguyên đối với MHC lớp I

 Sự hình thành khả năng ghi nhớ đáp ứng của tb lympho T đã được chứng minh với tính đa dạng của cấu trúc plamid

 Có dấu hiệu gián tiếp cho sự hoạt hóa miễn dịch này là một phần của hệ thống miễn dịch ở cá

 Hơn nữa, sự điều chỉnh biển hiện của MHC lớp II bằng vaccines DNA đã được thể hiện ở cá, ngay tại chổ tiêm