Nghiên cứu tạo phức hệ nano tích hợp Curcumin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ooo0ooo ĐẶNG THỊ MINH LỤA NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỆ NANO TÍCH HỢP CURCUMIN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 1Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ooo0ooo ĐẶNG THỊ MINH LỤA NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỆ NANO TÍCH HỢP CURCUMIN Ngành: Sinh học Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN Hà Nội - 2012 2Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn, Trưởng phòng Phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và dành phần kinh phí thích hợp từ đề tài khoa học cơ bản định hướng ứng dụng để thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Lã Thị Huyền, ThS. Lê Thị Minh Phúc và nhóm nanomedicine phòng Công nghệ tế bào động vật đã trực tiếp giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh, chị, các bạn đồng nghiệp tại phòng Công nghệ tế bào động vật đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong quá trình làm khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy giáo, cô giáo dạy khoa Sinh học, Trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã dạy bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2012 Học viên Đặng Thị Minh Lụa 3Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG TỪ VIẾT TẮT Chi Chitosan CMC Critical Micelle Concentration Cs Cộng sự DMSO Dimethyl Sulfoxide MN Magnetic Nanoparticles NC Nanocapsules NE Nanoemulsion NLC Nanostructured Lipid Carriers NPs Nanoparticles NS Nanospheres NSAISs Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs PEG Polyethylenglycol PF Pluronic® F-127 PLGA Poly-D,L-lactide-co-glycolide QD Quantum Dots RES Reticuloendothelial System SEM Scanning Electron Microscopy SLN Solid Lipid Nanoparticles TEM Transmission Electron Microscopy TPP Tripolyphosphate 4Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Các hệ vận chuyển thuốc kích thước nano 3 1.1.1. Khái niệm 3 1.1.2. Phân loại 3 1.2. Tổng quan về chitosan và nano chitosan 6 1.2.1. Cấu trúc của chitosan 6 1.2.2. Tính chất chitosan 7 1.2.3. Ứng dụng của chitosan 8 1.2.4. Nano chitosan 8 1.3. Curcumin 10 1.3.1.Cấu trúc hóa học của curcumin 10 1.3.2. Dược động học của curcumin 12 1.3.3. Tác dụng dược lý của curcumin 13 1.3.4. Hệ vận chuyển curcumin 15 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Hóa chất và thiết bị 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1. Phương pháp tạo chitosan phân tử lượng thấp 21 2.2.2. Phương pháp tạo hạt nano chitosan 21 2.2.3. Phương pháp tạo phức hệ nano tích hợp curcumin 22 2.2.4. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron Microscope - TEM) 23 2.2.5. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron Microscope - SEM) 24 2.2.6. Phương pháp soi kính hiển vi huỳnh quang 25 2.2.7. Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta 26 5Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.8. Phương pháp xác định hiệu xuất đóng gói 29 2.2.9. Khảo sát tính thấm của hạt nano vào tế bào động vật 29 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Kết quả tạo nano chitosan 31 3.2. Hình thể học của hạt nano tích hợp cucurmin 33 3.3. Kết quả đo size, phân bố size và thế zeta của hạt nano tích hợp curcumin 34 3.4. Hiệu suất đóng gói curcumin 36 3.5. Tính thấm của hạt nano vào tế bào HEK293 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 6Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Công nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất kích thước từ vài nm tới hàng trăm nm để vận chuyển dược chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể. Các hệ vận chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polymer-micelles, dendrimers, các hạt nano có nguồn gốc kim loại polymer, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome. Các dược chất hoặc các tác nhân chẩn đoán được tích hợp vào bên trong liên kết hóa học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt nano này. Curcumin là hoạt chất được chiết xuất từ củ nghệ vàng. Curcumin có nhiều hoạt tính sinh học và dược học quan trọng như tính kháng viêm, chống ung thư và kháng virus, cũng như các ứng dụng y học tiềm năng do tính độc thấp của chúng. Trong những năm gần đây, curcumin đã được chứng minh là có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào trên nhiều dòng tế bào ung thư in vitro và đã được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị nhiều bệnh ung thư in vivo. Tuy nhiên, do độ hòa tan kém, sinh khả dụng thấp và bị chuyển hóa nhanh chóng tại ruột và gan đã làm hạn chế các ứng dụng của curcumin. Curcumin có thể được phát triển như một loại thuốc điều trị thông qua thay đổi công thức hoặc gắn lên hệ vận chuyển, cho phép nâng cao khả năng hấp thụ của tế bào. Để vận chuyển curcumin đến các cơ quan đích, cần phải cải thiện độ hòa tan và sinh khả dụng của nó [1]. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã tập trung tạo ra các hạt nano polyme dựa trên copolymer Pluronic® F-127 (PF). Pluronic® F-127 (PF) là một copolymer không độc hại ưa nước, được sử dụng rộng rãi như một tá dược để làm tăng tính ổn định và độ hòa tan của thuốc. PF là một ABA copolymer bao gồm tiểu phần A polyoxyethylene (PEO), tiểu phần B polyoxypropylene (PPO) [2]. Khi gia tăng nhiệt độ của dung dịch PF tiểu phần A, PPO có xu hướng mất nước tạo thành lõi với vỏ bên ngoài là chuỗi PEO ngậm nước hợp thành hình cầu micelle [3]. Cấu trúc 7Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 micelle tạo bởi copolymer có thể tích hợp được các thuốc ưa nước, kỵ nước và kéo dài thời gian giải phóng thuốc [4,5]. Tuy nhiên, việc sử dụng các micelle PF làm hệ vận chuyển thuốc đường dài là không thực tế, vì các hạt micelle có thể bị kết tụ và thay đổi cấu trúc khi tiếp xúc nồng độ và nhiệt độ khác nhau. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự ổn định của các hạt micelle có thể được cải thiện sau khi được phủ một lớp polymer với các vật liệu như PLGA, polyvinychloride hoặc chitosan [6]. Chitosan là một loại polymer carbohydrate tự nhiên, được tạo ra bằng cách deacetyl hóa đầu N- của chitin. Chitosan có nhiều ưu điểm để làm vật mang trong các hệ thống vận chuyển thuốc kích cỡ nano. Chitosan không độc, có khả năng tương thích sinh học, phân hủy sinh học và đã được chứng minh để kiểm soát sự giải phóng thuốc, protein hay các peptide. Chitosan hòa tan tốt trong nước, tránh việc sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại, và không cần tinh sạch khi tạo ra các hạt nano [7]. Sự kết hợp polymer-micelles, phức hệ nano Chitosan-PF tích hợp curcumin tạo ra hệ vận chuyển curcumin đầy hứa hẹn. Xuất phát từ những cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu tạo phức hệ nano tích hợp curcumin” với mục tiêu: - Tạo được phức hệ nano tích hợp curcumin - Kiểm tra, đánh giá phức hệ nano đã tạo được - Khảo sát tính thấm của hạt nano vào tế bào động vật, kiểm tra độc tính trên tế bào ung thư, từ đó định hướng ứng dụng trong điều trị ung thư. 8Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Các hệ vận chuyển thuốc kích thước nano 1.1.1. Khái niệm Hệ vận chuyển thuốc kích thước nano là hệ được cấu tạo như các hạt nano có kích thước từ 1-1000 nm, với thiết kế thích hợp có vai trò như một phương tiện vận chuyển chuyên biệt, đảm bảo vận chuyển các hoạt chất đến đích tác dụng. Công nghệ nano đã tạo ra hàng loạt hệ vật chất với kích thước từ vài nm tới hàng trăm nm được sử dụng để vận chuyển dược chất đến các bộ phận mong muốn trong cơ thể với liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mong muốn, đảm bảo được 3 yếu tố góp phần tạo nên tính an toàn và hiệu quả của thuốc: đúng nơi, đúng lúc và đúng liều. Các hệ vận chuyển thuốc có nhiều triển vọng là polymer-micelles, dendrimers, các hạt nano có nguồn gốc kim loại polymer, ceramic, protein, virus, và các hạt nano liposome. Các dược chất hoặc các tác nhân chẩn đoán sẽ được đưa vào bên trong liên kết hoá học hoặc gắn vào bề mặt của các hạt nano này. 1.1.2. Phân loại Hiện nay các hạt nano vận chuyển thuốc thường được phân loại theo thành phần cấu tạo, cấu trúc và đặc tính bề mặt của hạt nano. Thành phần cấu tạo của các hạt nano chủ yếu là polyme, lipid và các hợp chất vô cơ, do vậy có thể phân thành 3 lớp lớn: • Hạt nano polyme (polymeric nanoparticles) • Hạt nano lipid (lipid nanoparticles) • Hạt nano vô cơ (inorganic nanoparticles) 9Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Hình 1.1. Một số hạt nano thường gặp Ngoài ra, còn có những hạt nano có cấu trúc hỗn hợp giữa polyme, lipid và hợp chất vô cơ. Các polymer có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học thường được sử dụng là polylactide, polyglycolide, poly(lactide-co-glycolide), poly(ε-caprolactone), poly(alkyl-cyanoacrylate), gelatine, chitosan… Các lipid thường được sử dụng là các lipid không độc với cơ thể, có cấu tạo khá tương đồng với lipid sinh học như phospholipid, cholesterol, glyceride… và dẫn xuất của các lipid này. Các hạt nano vô cơ thường được sử dụng trong chẩn đoán và điều trị như: hạt nano từ tính (magnetic nanoparticle), chấm lượng tử (quantum dots). Phân loại theo cấu trúc, các hạt nano có thể chia thành 3 dạng: • Hạt nano dạng màng bao: cấu tạo giống như túi (vesicle) hoặc nang (capsule), gồm một thành phần polymer hoặc một màng đơn hay màng kép lipid bao quanh một lõi có thể ở trạng thái rắn, rắn-lỏng hoặc lỏng ưa nước hoặc ưa dầu. • Hạt nano cấu trúc dạng khung xốp (matrix): khung xốp polyme, lipid hoặc các hợp chất vô cơ phân bố đều bên trong hạt nano thường có dạng hình cầu. 10Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... [43] Wu và cs phát triển nanogel để vận chuyển curcumin trong tế bào với mục đích điều trị [44] Dạng lai kết hợp hạt nano Au/Ag, lớp gel polystyrene, gel polyethylene có tiềm năng gây độc mạnh chống lại tế bào B16F10 bằng cách kết hợp với hóa trị liệu Một số nhóm nghiên cứu đã đề xuất tạo phức hợp curcuminphosholipid như là cách cải thiện vận chuyển curcumine Phức hợp của curcumin với phosphatidylcholine... trúc hóa học của curcumin Màu vàng của nghệ chủ yếu là do sự hiện diện của curcuminoids polyphenolic, chiếm khoảng 3% đến 5% của hầu hết các chế phẩm nghệ Các chiết xuất từ cồn của củ nghệ chủ yếu có chứa ba loại curcuminoids, cụ thể là chất curcumin (cũng được gọi là curcumin I hoặc diferuloylmethane), demethoxycurcumin (curcumin II), và bisdemethoxycurcumin (curcumin III) (hình 1.4) Curcumin lần đầu... Hạt nano cấu trúc dạng phức hợp (complex): thường là một phức hợp đa thành phần giữa polymer hoặc lipid tích điện dương và hoạt chất tích điện âm (protein, peptide và acid nucleic) kết hợp với nhau nhờ tương tác điện tích Phân loại theo tính chất bề mặt của hạt nano, dựa trên các thay đổi bề mặt hạt nano như: tính ưa dầu, hiệu ứng cản trở không gian và thành phần cấu tạo bề mặt nhằm hướng hạt nano. .. học và tăng hoạt tính bảo vệ gan so với pha trộn vật lý của curcumin và phosphatidylcholine [45] Phức hợp curcumin- phospholipid dùng đường uống có nồng độ trong huyết thanh cao hơn so với curcumin không được phức hợp Hơn nữa, phức hợp duy trì hiệu quả nồng độ curcumin trong khoảng thời gian dài Tuy nhiên, hàm lượng của curcumin trong phức hợp được tìm thấy là giới hạn trong khoảng 17 và 32 % (w/w),... Phương pháp tạo phức hệ nano tích hợp curcumin Sau khi tạo được nano chitosan, PF-127 được tích hợp vào nano chitosan bằng cách bổ sung PF 15% (w/v) trong dung dịch TPP 0,25% (w/v) Curcumin được hòa tan trong dung dịch TPP 0,25% w/v với nồng độ 10 mg/ml Sau đó được bổ sung vào dung dịch Chi-PF, để tạo hạt nano tích hợp curcumin Phức hệ nano được tách ra khỏi môi trường lỏng bằng cách ly tâm 5000 vòng... có triển vọng xuất hiện là “nanocurcumin”, trùng hợp hạt nano đóng gói curcumin, dễ dàng phân tán trong dung dịch và có tiềm năng chống ung thư trong các nghiên cứu tiền lâm sàn ở cơ thể sống Nanocurcumin giữ lại được các đặc trưng vốn có của curcumin, ức chế sự hoạt hóa của yếu tố phiên mã NF-kB và giảm mức độ ổn định của các cytokine tiền viêm như là ILs và TNF-α [42] Nanocurcumin được phát triển bởi... thuốc; điều chế nano chitosan với cholesterol để dẫn thuốc đến mắt; biến tính với N-trimethyl mang protein làm hệ thống dẫn truyền đường mũi; tạo phức với acid deoxycholic để dẫn truyền gen [13] Ngoài ra, nano chitosan còn được nghiên cứu về khả năng diệt khuẩn [14], [15], ứng dụng trong thực phẩm chức năng [16], [17] Nhiều công trình cũng tiến hành nghiên cứu về kích cỡ, điện tích bề mặt hạt nano chitosan... 3 loại curcuminoids chính trong củ nghệ Curcumin được sử dụng nhiều nhất không phải là curcumin tinh khiết, mà là một hỗn hợp của curcumin (khoảng 77%), desmethoxy curcumin (khoảng 18%) và bisdesmethoxy curcumin (khoảng 5%) [24] Trong số hơn 120 loài Curcuma được tìm thấy, chỉ có những loài C.aromatica, C.phaecaulis, C.zedoaria, C.xanthorrhiza, C.Mangga chứa hợp chất curcuminoid Trong số các curcuminoids,... Hạt nano chủ động (active nanoparticles): Các hạt nano được gắn kết với các ligand trên bề mặt nhằm nhận biết đặc hiệu các receptor ở mô và tế bào đích Các hạt nano này còn được gọi là hạt nano hướng đích [8] 11Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn Hạt nano thụ động Hạt nano Stealth® Hạt nano chủ động Hình 1.2 Cấu trúc hạt nano 1.2 Tổng quan về chitosan và nano. .. được tạo ra theo phương pháp gel hóa ion của Calvo và cs[62]: • Hòa tan chitosan trọng lượng phân tử thấp trong dung dịch acid acetic 1% (w/v) để thu được dung dịch chitosan 0,1% (w/v) • Thêm dung dịch TPP 0,025% (w/v) với tỉ lệ dung dịch Chi:TPP là 2:1, khuấy trong vòng 1h ở nhiệt độ phòng Dung dịch thu được chính là các hạt nano chitosan 2.2.3 Phương pháp tạo phức hệ nano tích hợp curcumin Sau khi tạo . tài: “ Nghiên cứu tạo phức hệ nano tích hợp curcumin với mục tiêu: - Tạo được phức hệ nano tích hợp curcumin - Kiểm tra, đánh giá phức hệ nano đã tạo được - Khảo sát tính thấm của hạt nano. độc hại, và không cần tinh sạch khi tạo ra các hạt nano [7]. Sự kết hợp polymer-micelles, phức hệ nano Chitosan-PF tích hợp curcumin tạo ra hệ vận chuyển curcumin đầy hứa hẹn. Xuất phát từ những. ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ooo0ooo ĐẶNG THỊ MINH LỤA NGHIÊN CỨU TẠO PHỨC HỆ NANO TÍCH HỢP CURCUMIN