Thành phần chủ yếu của màng tế bào là lớp phospholipid kép. Các phospholipid lưỡng tính và tích điện âm nhờ nhóm phosphate. Chính vì thế, các hạt nano tích điện dương sẽ dễ dàng hấp phụ trên bề mặt tế bào nhờ tương tác điện tích và nội bào hóa (endocytosis) vào bên trong tế bào. Hạt nano tạo ra, thành phần cấu tạo có chitosan tích điện dương nên có thể thấm vào tế bào theo con đường nội bào hóa. Curcumin trong hạt nano có thể phát quang khi soi huỳnh quang ở bước sóng 420-485 nm do đó có thể dễ dàng quan sát được
Dòng tế bào HEK293 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% penicillin-streptomycin , 2% L-glutamin,
ủ ở 37oC trong tủ ấm CO2. Khi tế bào đạt mật độ 2.105 tế bào/ml, tiến hành nhiễm hạt nano Chi-PF-Cur. 18-24 h sau khi nhiễm, tiến hành loại bỏ môi trường cũ, tế bào được rửa 3 lần với PBS. Xử lý tế bào bằng trypsin cho tế
bào bong ra, sau đó bất hoạt trypsin bằng cách bổ sung môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 1:1. Ly tâm thu cặn tế bào và loại bớt dịch nổi. Lấy một lượng nhỏ
huyền phù nhỏ lên lam kính, đậy lamen sạch để soi và kiểm tra sự phát quang của curcumin trong tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo hạt nano chitosan
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tạo gel ion (tạo nối ngang ion) sử dụng chất Tripolyphosphate (TPP) để tạo hạt nano chitosan kích thước nhỏ nhằm tăng khả năng hấp phụ thuốc. Điều kiện thí nghiệm
được thực hiện ở nồng độ chitosan phân tử lượng thấp 0,1% (w/v) trong acid acetic và TPP 0,025% (w/v), tỷ lệ Chi:TPP là 2:1.
Do bản chất phân ly, TPP phân ly trong nước và giải phóng ion OH-, do
đó trong dung dịch TPP đồng thời tồn tại cả ion OH- và ion P3O105- có thể
Những mảnh chitosan phân tử lượng thấp sẽ tham gia vào phản ứng tạo gel ion với phân tử TPP, kết hợp với quá trình khuấy trộn để hình thành các hạt nano chitosan kích thước nhỏ. Hạt nano chitosan sau khi tạo ra không bị
tách lớp sau 3 ngày bảo quản trong tủ 4oC, chứng tỏ hạt nano tạo thành có kích thước nhỏ, nếu hạt nano có kích thước lớn sẽ gây ra sự lắng cặn và tách pha trong quá trình bảo quản.
Hình 3.2. Ảnh SEM của chitosan
(a)Chitosan ban đầu khi chưa tạo nối
(b)Nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ Chi:TPP là 2:1
Hình 3.3. Kết quả đo size và phân bố size của nano chitosan
Hình ảnh chụp SEM của chitosan cho thấy hình dạng nguyên liệu chitosan ban đầu là từng lớp polymer với kích thước hạt lớn. Nano chitosan tạo ra bằng phương pháp tạo gel ion sử dụng TPP, có kích thước hạt nhỏ, tương đối đồng đều.
Kết quả đo size và phân bố kích cỡ hạt cho thấy, kích thước trung bình của hạt nano tạo ra là 119,9 nm. Trong đó có 55% hạt kích thước 117,2 nm; 26% hạt kích thước 596,7 nm; còn lại là hạt kích thước lớn hơn 1 µm. Điều này cho thấy mức độ đồng nhất của các hạt không cao, thể hiện ở chỉ số đa phân tán PdI 0,786; vì chỉ số này càng cao thì mức độ đồng nhất của mẫu càng thấp. Tuy vậy phương pháp này phần lớn đã tạo ra các hạt nano chitosan với kích thước nhỏ, những hạt nao có kích thước lớn được loại bỏ bằng cách lọc qua màng lọc 0,45 µm.
3.2. Hình thể học của hạt nano tích hợp cucurmin
Ảnh SEM của hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin cho thấy các hạt có dạng hình cầu và khá đồng nhất. Hình ảnh TEM của các hạt nano cũng khẳng
định các hạt là hình cầu, bên trong hạt có đốm sẫm màu, các đốm sẫm màu này chính là sự tương phản giữa Chi và PF. Điều này chứng tỏ sự hợp nhất của PF bên trong hạt nano chitosan.
Để kiểm tra sự tích hợp của curcumin vào bên trong cấu trúc hạt nano, mẫu được pha loãng và soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Ảnh soi huỳnh quang cho thấy, curcumin phát quang bên trong cấu trúc hạt nano, điều này chứng tỏ curcumin đã được tích hợp vào bên trong cấu trúc này (hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh huỳnh quang của nano Chi-PF tích hợp curcumin (a) Ảnh huỳnh quang truyền qua; (b) Ảnh huỳnh quang
3.3. Kết quả đo size, phân bố size và thế zeta của hạt nano tích hợp curcumin curcumin
Để có được các hạt nano kích thước dưới 200 nm, các hạt nano được bào chế từ chitosan phân tử lượng thấp (16-20 kDa). Các hạt nano được thực hiện theo phương pháp tạo gel ion khi bổ sung TPP và chitosan trong dung dịch acid acetic kèm theo khuấy từở nhiệt độ phòng. Các thông sốảnh hưởng
đến đặc tính của hạt nano bao gồm: pH, trọng lượng phân tử chitosan, tỉ lệ
Chi:TPP, sự có mặt của các polymer, copolymer và các chất hoạt động .
Trong các thông số, chitosan và TPP là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến khích thước của hạt nano tạo thành. Trong nghiên cứu này sử dụng chitosan 0,1% và TPP 0,025% với tỷ lệ dung dịch Chi:TPP là 2:1 đã tạo ra các hạt nano chitosan với kích thước trung bình 119 nm. Các hạt nano với
kích thước nhỏ có đặc tính như: cải thiện khả năng vận chuyển thuốc, kéo dài thời gian lưu hành của thuốc trong máu và giảm độc tính [16].
Kích thước hạt, phân bố kích cỡ và thế zeta của các hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin được đo bằng máy Zetasizer. Kết quả cho thấy các hạt nano tạo ra có kích thước khoảng 151 nm (hình 3.6) và kích thước này không thay đổi nhiều khi hạt nano Chi-PF không đóng gói curcumin điều này chứng tỏ curcumin chỉ tích hợp vào bên trong cấu trúc của hạt nano.
Hình 3.6. Kết quả đo size, phân bố size của nano Chi-PF mang curcumin
Thế zeta của micelle PF mang curcumin với sự có mặt và vắng mặt chitosan lần lượt là 5,09 mV và -2,19 mV (hình 3.7; 3.8). Kết quả cho thấy, thế zeta của các hạt nano không cao, các hạt có thể kết tụ lại, đó là một vấn đề
lớn trong ứng dụng vận chuyển thuốc. Tuy nhiên khi có mặt của chitosan, do chitosan tích điện dương, làm tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt, nên thế zeta
Hình 3.7. Thế zeta hạt nano có mặt chitosan
Hình 3.8. Thế zeta của hạt nano không có mặt chitosan
3.4. Hiệu suất đóng gói curcumin
Curcumin nồng độ 0,1 mg/ml trong DMSO được đo phổ hấp thụ ở
bước sóng từ 300 nm đến 700 nm, kết quả cho thấy độ hấp thụ của curcumin cao nhất ở bước sóng 430 nm (hình 3.9).
D12-Spectrum Wavelength (nm) O D 300 350 400 450 500 550 600 650 700 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500
Hình 3.9. Phổ hấp thụ của curcumin ở bước sóng từ 300-700 nm
Để xây dựng đường chuẩn curcumin, các dung dịch curcumin có nồng
độ lần lượt là: 0,01 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,08 mg/ml và 0,1 mg/ml được đo độ hấp thụở bước sóng 430 nm trên máy đo quang phổ
kế Synergy HT (Biotek), kết quảđo được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị OD và nồng độ curcumin trong mẫu chuẩn
Tên mẫu N(mg/ml) ồng độ OD 430 nm STD1 0.1 3.404 STD2 0.08 2.937 STD3 0.06 2.249 STD4 0.04 1.544 STD5 0.02 0.817
Dựa vào nồng độ và độ hấp thụ đo được, sử dụng phần mền Gen5 của máy đo quang phổ kế Synergy HT để xây dựng đường chuẩn curcumin (hình 3.10). Đường tương quan tuyến tính có phương trình:
Y = 33,7X + 0,151
Trong đó: X là nồng độ curcumin trong dung dịch (mg/ml) Y là độ hấp thụđo được (OD)
Hệ số tương quan R2 là 0,9902, phương trình này được sử dụng để tính nồng
độ curcumin khi biết độ hấp thụ.
Hình 3.10. Đường chuẩn curcumin
Hiệu suất đóng gói curcumin trong hạt nano Chi-PF được tính toán gián tiếp dựa vào lượng curcumin dư thừa (lượng curcumin tự do) không được
đóng gói nằm trong dịch sau ly tâm. Theo giá trị OD đo được, dựa vào phương trình tuyến tính và đường tương quan tuyến tính giữa độ hấp thu và nồng độ curcumin (đường chuẩn curcumin) có thể xác định được nồng độ
Hàm lượng curcumin tự do trong dịch sau ly tâm được tính toán theo công thức:
Lượng curcumin tự do (mg) = A.N.V
Trong đó: A là hệ số pha loãng
N là nồng độ curcumin tự do trong dịch sau ly tâm V là thể tích dịch sau ly tâm (ml)
Bảng 3.2. Giá trị OD, nồng độ và hàm lượng curcumin tự do
Mẫu OD430 Nồng độ (mg/ml) Hàm lượng (mg)
Bank 0,048 0,00 0,00
Curcumin tự do 0,812 0,0196 3,92
Dựa vào công thức tính hiệu suất đóng gói, chúng tôi tính toán được hiệu suất
đóng gói curcumin như sau:
Như vậy hiệu suất đóng gói curcumin trong hạt nano Chi-PF là 60,8 %, kết quả tương ứng với kết quả nghiên cứu của Hosniyeh H và Cs (2012).
3.5. Tính thấm của hạt nano vào tế bào HEKA293
Hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin, cấu tạo bao gồm một lõi là khối cầu PF được hình thành qua quá trình tự lắp ráp hoặc sử dụng nồng độ micelle tới hạn [63,64]. Tiếp theo là lớp chitosan phủ trên bề mặt của hạt nano bằng cách sử dụng tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và PF tích
điện âm. Chitosan là một polymer có tính phân hủy sinh học và tương thích sinh học, vỏ chitosan có thể bảo vệ các hợp chất có hoạt tính sinh học khỏi
được ghép cộng hóa trị với chitosan, chitosan tích điện dương nên dễ dàng
được hấp phụ trên bề mặt tế bào nhờ tương tác điện tích và có thể thấm vào tế
bào thông qua quá trình nội bào hóa (endocytosis) [67]. Sau khi vào bên trong tế bào, hoạt chất được phóng thích theo cơ chế hợp nhất hóa với thể lysosome tiêu thụ hạt nano hoặc tương tác làm phá vỡ thể nội bào trong môi trường tế
bào chất. Vỏ chitosan bị phá hủy bởi enzyme lysozyme, làm phá vỡ các micelle và giải phóng curcumin.
Tế bào HEKA293 được ủ với hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin trong 24h, sau đó tiến hành quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (hình 3.11).
Hình 3.11. Sự phát quang của curcumin trong tế bào HEKA293 (a) Ảnh truyền qua, (b) Ảnh huỳnh quang truyền qua
(c) Ảnh huỳnh quang
Hình ảnh phát huỳnh quang cho thấy, curcumin đã xâm nhập được vào 1 tế bào HEK trong trường kính quan sát. Tuy nhiên, chỉ có một vài tế bào, chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số tế bào, phát huỳnh quang màu xanh lá cây sau khi ủ với nano Chi-PF tích hợp curcumin. Điều này cho thấy hiệu quả hấp thu của tế bào không cao. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Manaspon và cs, cho rằng chỉ có 15% thuốc chống ung thưđược tích lũy sau 24h.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã chế tạo thành công nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion sử
dụng TPP. Hạt nano chitosan tạo ra có dạng hình cầu, khá đồng đều với kích thước trung bình là 119,9 nm.
2. Đã tạo được hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin bằng phương pháp tự
lắp ráp đơn giản, không cần sử dụng dung môi hữu cơ độc hại. Ảnh chụp SEM và chụp TEM đều cho thấy hạt có dạng hình cầu, khá đồng nhất. Kích thước trung bình của hạt là 151 nm, thế zeta là 5,09 mV. Sự
tương phản của chitosan và PF trong ảnh chụp TEM cho thấy sự hợp nhất của PF bên trong cấu trúc hạt nano chitosan. Ảnh soi huỳnh quang cho thấy curcumin đã được tích hợp vào bên trong cấu trúc của hạt nano với hiệu suất đóng gói là 60,8%.
3. Bước đầu kiểm tra tính thấm của hạt nano vào tế bào HEK293.
KIẾN NGHỊ
1. Tối ưu hóa quy trình tạo hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin nhằm tăng hiệu suất đóng gói curcumin.
2. Thử độc tính của hạt nano tạo ra trên tế bào ung thư, từ đó hướng đến
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Purusotam Basnet and Natasa Skalko-Basnet, 2011, Curcumin: An Anti- Inflammatory Molecule from a Curry Spice on the Path to Cancer Treatment Molecules 2011, 16, 4567-4598.
2. Bohorquez M, Koch C, Trygstad T, and Pandit N 1999, J Colloid Interf Sc
216(1), 34-40.
3. Wenzel JGW, Balaji K, Koushik K, et al 2002, J Control Release 85(1-3), 51-59.
4. Veyries M, Couarraze G, Geiger S, et al 1999, Int J Pharm 192(2), 183- 193.
5. Bae KH, Ha YJ, Kim C, Lee KR, and Park TG 2008, Journal of Biomaterials Science 19(12), 1571-1583.
6. Agnihotri SA, Mallikarjuna NN, Aminabhavi TM, 2004, J Control Release
100(1), 5-28.
7. Hosniyeh H, Fatemeh A, Rassoul D, and Aeyed NO 2012, Int. J. Nanomedicine 7, 1851-1863.
8. Nguyễn Minh Đức, Trương Công Trí, 2010, Hạt nano: kỹ thuật bào chế, phân tích tính chất ứng dụng trong ngành dược, Nxb Y học HCM.
9. Kumar MNVR, 2002, A review of chitin and chitosan applications,
Reactive & Functional Polymers, 46, 1-27.
10.Rinaudo M, 2006, Chitin and chitosan: Properties and applications,
Progress in Ploymer Science, 31, 603-632.
11.Zhang H, Wu S, Tao Y, Zang L, Su Z, 2010, Preparation and Characterrization of Water-Soluble Chitosan nanoparticles as Protein Delivery System, Journal of Nanometerials, 1-5.
12.Tiyaboonchai W, 2003, Chitosan Nanoparticles: APromising System for Drug Delivery, Naresuan University Journal, 11 (3), 51-66.
13.Gan Q, Wang T, 2007, Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier- Systematic examineation of fabrication conditions for efficient loading and release, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 59, 24-34.
14.Du WL, Niu SS, Xu YL, Xu ZR, Fan CL, 2009, Antibacterial activity of chitosan tripolyphosphate nanoparticles loaded with various metal ions,
Carbohydrate Plymers, 75, 385-389.
15.Qui L, Xu Z, Jiang X, Hu C, Zou X, 2004, Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles, Carbohydrate Reasearch, 339, 2693- 2700.
16.Chen L, Remondetto GE, Subirade M, 2006, Food protein-based materials as nutraceutical delivery systems, Trends in Food Science & Technology, 17, 272-283.
17.Chen L, Subirade M, 2005, Chitosan/β-lactoglobulin core-shell nanoparticles as nutraceutical carriers, Biomaterials, 26, 6041-6053.
18.Gan Q, Wang T, Cochrane C, McCarron P, 2005, Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 44, 65-73.
19.Nguyễn Anh Dũng, 2010, Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm tá chất miễn dịch cho vaccine cum A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên động vật, Trường Đại học Tây Nguyên, Thành Phố Hồ Chí Minh. 20.Tr n i Lâm, Phùng Nguy n Hào, 2006, T ng h p, c tr ng và ng
21.Conney A, 2003, Enzyme induction and dietary chemicals as approaches to cancer chemoprevention: The seventh DeWitt S, Goodman lecture, Cancer Res, 63, 7005-7031.
22.Aggarwal BB, Surh YJ, Shishodia S, Eds, 2007, Advances in experimental medicine and biology, In The Molecular Target and Therapeutic Uses of Curcumin in Health and Disease, Springer: New York, NY, USA.
23.Roughley PJ, Whiting DA, 1973, Experiments in the biosynthesis of curcumin, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 20, 2379-2388.
24.Basnet P, Tho I, Skalko-Basnet N. Curcumin, 2010, A Wonder Drug of 21st Century: Liposomal Delivery System Targeting Vaginal Inflammation,
5th International Congress on Complementary Medicine Research, Tromsø, Norway, Abstract Number A9M2K9C.
25.Jovanovic SV, Steenken S, Boone CW, Simic MG, 1999, H-atom transfer is a preferred antioxidant mechanism of curcumin, J. Am. Chem. Soc, 121, 9677-9681.
26.Wahlstrom B, Blennow GA, 1978, Study on the fate of curcumin in the rat, Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh), 43, 86-92.
27.Ravindranath V, Chandrasekhara N, 1981, In vitro studies on the intestinal absorption of curcumin in rats, Toxicology, 20, 251-257.
28.Ravindranath V, Chandrasekhara N, 1981, Metabolism of curcumin: Studies with curcumin, Toxicology, 22, 337-344.
29.Holder GM, Plummer JL, Ryan AJ, 1978, The metabolism and excretion of curcumin (1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6- heptadiene-3,5- dione) in the rat, Xenobiotica, 8, 761-768.
30.Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Srinivas PS, 1998, Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers, Planta Med, 64, 353-356.
31.Strimpakos AS, Sharma RA, 2008, Curcumin: Preventative and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trials, Antioxid. Redox Sign, 10, 511-545.
32.Kurien BT, Scofield RH, 2009, Oral administration of heat-solubilized