Electron Microscope - TEM)
Kính hiển vi điện tử truyền qua là một thiết bị hình trụ cao khoảng 2m, có một nguồn phát xạđiện tử trên đỉnh (súng điện tử) để phát ra chùm điện tử. Chùm này được tăng tốc trong môi trường chân không cao, sau khi đi qua tụ
kính, chùm điện tử tác động lên mẫu mỏng, tùy thuộc vào từng vị trí và loại mẫu mà chùm điện tử bị tán xạ ít hoặc nhiều. Mật độđiện tử truyền qua ngay dưới mặt mẫu phản ảnh lại tình trạng của mẫu, hình ảnh được phóng đại qua một loạt các thấu kính trung gian và cuối cùng thu được trên màn huỳnh quang. Do vậy, ảnh hiển vi điện tử truyền qua là hình ảnh bề mặt dưới của mẫu (ảnh đen trắng) thu được bởi chùm điện tử truyền qua mẫu. Với độ phân giải cao cỡ 2A°, độ phóng đại từ x50 tới x1.500.000, TEM đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu siêu cấu trúc sinh vật, vi sinh vật và các vật liệu nano.
Cấu tạo chính của TEM gồm cột kính với các bộ phận từ trên xuống dưới: súng điện tử, tụ kính, buồng đặt mẫu, hệ thống thấu kính tạo ảnh (vật kính, kính trung gian, kính phóng); buồng quan sát và bộ phận ghi ảnh. Cột kính có chân không cao, áp suất 10-5-10-6 Torr đối với TEM thông thường và cỡ 10-8-10-10 Torr đối với HR-TEM). Hệ thống bơm chân không, hệ thống
điện, điện tử, hệ thống điều khiển bằng máy tính là những bộ phận kèm theo
đểđảm bảo cho quá trình làm việc liên tục của TEM.
Vì sử dụng chế độ điện tử đâm xuyên qua mẫu vật nên mẫu quan sát trong TEM luôn phải đủ mỏng. Theo nguyên tắc, TEM bắt đầu ghi nhận được
ảnh với các mẫu có chiều dày dưới 500 nm, tuy nhiên ảnh có chất lượng tốt khi mẫu mỏng dưới 150 nm. Vì vậy, việc xử lý mẫu cho phép đo TEM là cực kỳ quan trọng. Phương pháp truyền thống là sử dụng hệ thống mài cắt cơ học.
sử dụng chùm ion hội tụ, được điều khiển nhờ hệ thấu kính điện từ để cắt ra các lát mỏng, hàn gắn trên giá mẫu và mài mỏng. Phép xử lý này tiến hành rất nhanh và cho mẫu rất mỏng nhưng mẫu có thể bị nhiễm bẩn từ các ion.
Ảnh TEM được xử lý và chụp tại Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương, trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010 với các thông số M=x50 - x600.000, δ=3A0, U=40-100kV.
Hình 2.1. Kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010 (JEOL)
2.2.5. Phương pháp chụp kính hiển vi điện tử quét (Scanning Electron
Microscope - SEM)
Kính hiển vi điện tử quét là thiết bị có khả năng quan sát bề mặt của mẫu vật, bao gồm: súng điện tử, tụ kính, buồng tiêu bản, hệ thống đầu dò điện tử, hệ thống khuếch đại - máy tính và màn hình để quan sát ảnh. Chùm điện tử
xuất phát từ súng điện tửđi qua tụ kính, rồi vật kính, sau đó chùm tia hội tụ và quét trên toàn bộ bề mặt của mẫu, sự tương tác của chùm điện tử tới với bề
mặt mẫu tạo ra các tia khác nhau (điện tử thứ cấp, điện tử tán xạ ngược, điện tử Auger, tia huỳnh quang catot, tia X đặc trưng...). Hình ảnh hiển vi điện tử
quét được phản ảnh lại bởi các điện tử thứ cấp và điện tử tán xạ ngược thu
phản ánh thành phần nguyên tố trong mẫu phân tích nhờ bộ phân tích phổ tán sắc năng lượng tia X (EDS – Energy Dispersive X- ray Spectroscopy).
Cấu tạo chính của SEM gồm cột kính (súng điện tử, tụ kính, vật kính), buồng mẫu và đầu dò tín hiệu điện tử. Cột kính có chân không cao, áp suất 10-
5-10-6 Torr đối với SEM thông thường và 10-8-10-9 Torr đối với SEM có độ
phân giải cao (FE-SEM) . Buồng mẫu có thể nằm ở hai chế độ chân không cao hoặc thấp. Hệ thống bơm chân không, hệ thống điện, điện tử, hệ thống
điều khiển và xử lý tín hiệu là những bộ phận đảm bảo cho sự làm việc liên tục của SEM.
Ảnh SEM được chụp trên kính hiển vi điện tử quét phân giải cao tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương S-4800 (M: x25 - x800.000, δ=1nm, U=0,5- 30kV).
Hình 2.2. Kính hiển vi điện tử quét S-4800 (FE-SEM, Hitachi).
2.2.6. Phương pháp soi kính hiển vi huỳnh quang
Kính hiển vi huỳnh quang hoạt động dựa trên nguyên lý sử dụng ánh sáng có bước sóng ngắn, năng lượng cao để kích thích các điện tử nội tại
khi chưa bị kích thích) chúng phát ra một ánh sáng có bước sóng dài hơn, năng lượng thấp hơn (thường nằm trong phổ ánh sáng nhìn thấy) để tạo ra hình ảnh huỳnh quang. Kính hiển vi huỳnh quang sử dụng đèn xenon hoặc thủy ngân để tạo ra ánh sáng tia cực tím, qua bộ lọc để dẫn vào kính và đi đến gương lưỡng hướng sắc - loại gương có khả năng phản xạ dải bước sóng dãi bước sóng nhất định và cho phép một dải bước sóng khác đi qua. Gương này phản xạ ánh sáng tia cực tím lên mẫu để kích thích huỳnh quang nội tại trong các phân tử của mẫu. Vật kính sẽ thu lại những ánh sáng có bước sóng huỳnh quang được tạo ra đi đến gương lưỡng hướng sắc và thông qua một bộ lọc (để
loại bỏ những ánh sáng không có bước sóng huỳnh quang) dẫn đến thị kính để
tạo ảnh huỳnh quang.
Hình 2.3. Sơ đồ nguyên lý hoạt động của kính hiển vi huỳnh quang 2.2.7. Phương pháp đo size, phân bố size và thế zeta
Kích thước hạt và phân bố kích thước là những thông số quan trọng trong kiểm tra độ ổn định của chế phẩm và sự phù hợp của kích cỡ hạt nano
với đường đưa thuốc vào cơ thể, đây là các thông số luôn được xem xét trong quá trình bào chế, sản xuất và bảo quản.
Kích thước hạt (nanoparticle size)
Đo kích thước hạt theo phương pháp tán xạ ánh sáng động học (Dynamic Light Scattering – DLS): là phương pháp có thể đo được kích thước của các hạt siêu nhỏ, thậm chí nhỏ hơn 1 nm, bằng cách quan sát sự
chuyển động nhiệt hoặc chuyển động Brown của các hạt trong môi trường phân tán. Kích thước của các hạt được đo bằng cách quan sát sự tán xạ của ánh sáng laser từ các hạt, xác định tốc độ khuếch tán và kích thước của các hạt nano được tính toán theo phương trình Stockes-Einstein:
D = kT/3πηd
D: hệ số khuếch tán k: hằng số Boltzmann
T: nhiệt độ η: độ nhớt môi trường phân tán d: đường kính trung bình các hạt nano trong mẫu khảo sát
Phương pháp DLS là phương pháp nhạy cảm với cường độ của ánh sáng tán xạ phát ra từ các hạt. Các hạt lớn thì phát tán ánh sáng lớn hơn là các hạt nhỏ, hạt kích thước 1 nm tán xạ một phần triệu lượng ánh sáng so với hạt kích thước 10 nm. Zetasier Nano sử dụng công nghệ NIBS đã được cấp bằng sáng chế, với việc kết hợp độ nhạy cao và hiệu quả lượng tử lớn hơn 60% (so với 4% của các máy đo truyền thống).
Phân bố kích thước hạt (size distribution)
Phân bố kích thước hạt biểu thị tỉ lệ hạt theo đường kính hạt nano trong mẫu khảo sát. Có 3 kiểu phân bố: phân bố liên tục, phân bố rời rạc và phân bố
biểu thị ở chỉ số đa phân tán (polydispersity index- PdI), chỉ số càng cao thì mức độđồng nhất của mẫu càng thấp.
Thế zeta (zeta potential)
Thế zeta thể hiện lực đẩy giữa các hạt nano, các hạt nano tích điện ở bề
mặt thường đặc trưng bởi thế zeta (ζ). Thế zeta được đo bởi tốc độ di chuyển của các hạt nano trong vùng điện trường. Thế zeta thường được xác định nhờ
phép đo gió bởi một Doppler laser. Nguyên tắc cơ bản dựa trên xác định tần số chuyển động của hạt nano trong vùng điện trường quan sát được nhờ nhiễu xạ tia laser. Trong thực nghiệm, hệ hạt nano phân tán có giá trị tuyệt đối của thế zeta giữa 30 và 60 mV sẽ tạo sự ổn định tĩnh điện học nhờ lực đẩy giữa các hạt nano tích điện cùng dấu, nếu giá trị này từ 5 đến 15 mV sẽ giới hạn độ
bền vững của hệ phân tán, thế zeta từ 3 đến 5 mV thường xuất hiện các hiện tượng không bền.
Kích thước hạt nano, phân bố kích thước và thế zeta được đo trên máy Zetasizer (Nano-ZS; Malvern Instruments, Malvern, UK).
2.2.8. Phương pháp xác định hiệu suất đóng gói
Hiệu xuất đóng gói của (Encapsulation Efficiency – EE) của curcumin
được xác định gián tiếp bằng cách đo lượng curcumin tự do trong dung dịch thu được ở đáy ống falcon, sử dụng máy đo quang phổ kế Synergy HT (Biotek) đo độ hấp thụ (OD) của curcumin ở bước sóng 430 nm. Hiệu suất
đóng gói được tính toán theo công thức sau:
Để xác định mối tương quan giữa nồng độ curcumin và độ hấp thụ của curcumin, curcumin được pha ra các nồng độ 0,01 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,08 mg/ml và 0,1 mg/l; sau đó được đo OD ở bước sóng 430 nm. Đường chuẩn curcumin được xây dựng dựa vào nồng độ curcumin và giá trị OD đo được.
2.2.9. Khảo sát tính thấm của hạt nano vào tế bào động vật
Thành phần chủ yếu của màng tế bào là lớp phospholipid kép. Các phospholipid lưỡng tính và tích điện âm nhờ nhóm phosphate. Chính vì thế, các hạt nano tích điện dương sẽ dễ dàng hấp phụ trên bề mặt tế bào nhờ tương tác điện tích và nội bào hóa (endocytosis) vào bên trong tế bào. Hạt nano tạo ra, thành phần cấu tạo có chitosan tích điện dương nên có thể thấm vào tế bào theo con đường nội bào hóa. Curcumin trong hạt nano có thể phát quang khi soi huỳnh quang ở bước sóng 420-485 nm do đó có thể dễ dàng quan sát được
Dòng tế bào HEK293 được nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% penicillin-streptomycin , 2% L-glutamin,
ủ ở 37oC trong tủ ấm CO2. Khi tế bào đạt mật độ 2.105 tế bào/ml, tiến hành nhiễm hạt nano Chi-PF-Cur. 18-24 h sau khi nhiễm, tiến hành loại bỏ môi trường cũ, tế bào được rửa 3 lần với PBS. Xử lý tế bào bằng trypsin cho tế
bào bong ra, sau đó bất hoạt trypsin bằng cách bổ sung môi trường nuôi cấy với tỷ lệ 1:1. Ly tâm thu cặn tế bào và loại bớt dịch nổi. Lấy một lượng nhỏ
huyền phù nhỏ lên lam kính, đậy lamen sạch để soi và kiểm tra sự phát quang của curcumin trong tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang.
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tạo hạt nano chitosan
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tạo gel ion (tạo nối ngang ion) sử dụng chất Tripolyphosphate (TPP) để tạo hạt nano chitosan kích thước nhỏ nhằm tăng khả năng hấp phụ thuốc. Điều kiện thí nghiệm
được thực hiện ở nồng độ chitosan phân tử lượng thấp 0,1% (w/v) trong acid acetic và TPP 0,025% (w/v), tỷ lệ Chi:TPP là 2:1.
Do bản chất phân ly, TPP phân ly trong nước và giải phóng ion OH-, do
đó trong dung dịch TPP đồng thời tồn tại cả ion OH- và ion P3O105- có thể
Những mảnh chitosan phân tử lượng thấp sẽ tham gia vào phản ứng tạo gel ion với phân tử TPP, kết hợp với quá trình khuấy trộn để hình thành các hạt nano chitosan kích thước nhỏ. Hạt nano chitosan sau khi tạo ra không bị
tách lớp sau 3 ngày bảo quản trong tủ 4oC, chứng tỏ hạt nano tạo thành có kích thước nhỏ, nếu hạt nano có kích thước lớn sẽ gây ra sự lắng cặn và tách pha trong quá trình bảo quản.
Hình 3.2. Ảnh SEM của chitosan
(a)Chitosan ban đầu khi chưa tạo nối
(b)Nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ Chi:TPP là 2:1
Hình 3.3. Kết quả đo size và phân bố size của nano chitosan
Hình ảnh chụp SEM của chitosan cho thấy hình dạng nguyên liệu chitosan ban đầu là từng lớp polymer với kích thước hạt lớn. Nano chitosan tạo ra bằng phương pháp tạo gel ion sử dụng TPP, có kích thước hạt nhỏ, tương đối đồng đều.
Kết quả đo size và phân bố kích cỡ hạt cho thấy, kích thước trung bình của hạt nano tạo ra là 119,9 nm. Trong đó có 55% hạt kích thước 117,2 nm; 26% hạt kích thước 596,7 nm; còn lại là hạt kích thước lớn hơn 1 µm. Điều này cho thấy mức độ đồng nhất của các hạt không cao, thể hiện ở chỉ số đa phân tán PdI 0,786; vì chỉ số này càng cao thì mức độ đồng nhất của mẫu càng thấp. Tuy vậy phương pháp này phần lớn đã tạo ra các hạt nano chitosan với kích thước nhỏ, những hạt nao có kích thước lớn được loại bỏ bằng cách lọc qua màng lọc 0,45 µm.
3.2. Hình thể học của hạt nano tích hợp cucurmin
Ảnh SEM của hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin cho thấy các hạt có dạng hình cầu và khá đồng nhất. Hình ảnh TEM của các hạt nano cũng khẳng
định các hạt là hình cầu, bên trong hạt có đốm sẫm màu, các đốm sẫm màu này chính là sự tương phản giữa Chi và PF. Điều này chứng tỏ sự hợp nhất của PF bên trong hạt nano chitosan.
Để kiểm tra sự tích hợp của curcumin vào bên trong cấu trúc hạt nano, mẫu được pha loãng và soi trên kính hiển vi huỳnh quang. Ảnh soi huỳnh quang cho thấy, curcumin phát quang bên trong cấu trúc hạt nano, điều này chứng tỏ curcumin đã được tích hợp vào bên trong cấu trúc này (hình 3.5).
Hình 3.5. Ảnh huỳnh quang của nano Chi-PF tích hợp curcumin (a) Ảnh huỳnh quang truyền qua; (b) Ảnh huỳnh quang
3.3. Kết quả đo size, phân bố size và thế zeta của hạt nano tích hợp curcumin curcumin
Để có được các hạt nano kích thước dưới 200 nm, các hạt nano được bào chế từ chitosan phân tử lượng thấp (16-20 kDa). Các hạt nano được thực hiện theo phương pháp tạo gel ion khi bổ sung TPP và chitosan trong dung dịch acid acetic kèm theo khuấy từở nhiệt độ phòng. Các thông sốảnh hưởng
đến đặc tính của hạt nano bao gồm: pH, trọng lượng phân tử chitosan, tỉ lệ
Chi:TPP, sự có mặt của các polymer, copolymer và các chất hoạt động .
Trong các thông số, chitosan và TPP là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến khích thước của hạt nano tạo thành. Trong nghiên cứu này sử dụng chitosan 0,1% và TPP 0,025% với tỷ lệ dung dịch Chi:TPP là 2:1 đã tạo ra các hạt nano chitosan với kích thước trung bình 119 nm. Các hạt nano với
kích thước nhỏ có đặc tính như: cải thiện khả năng vận chuyển thuốc, kéo dài thời gian lưu hành của thuốc trong máu và giảm độc tính [16].
Kích thước hạt, phân bố kích cỡ và thế zeta của các hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin được đo bằng máy Zetasizer. Kết quả cho thấy các hạt nano tạo ra có kích thước khoảng 151 nm (hình 3.6) và kích thước này không thay đổi nhiều khi hạt nano Chi-PF không đóng gói curcumin điều này chứng tỏ curcumin chỉ tích hợp vào bên trong cấu trúc của hạt nano.
Hình 3.6. Kết quả đo size, phân bố size của nano Chi-PF mang curcumin
Thế zeta của micelle PF mang curcumin với sự có mặt và vắng mặt chitosan lần lượt là 5,09 mV và -2,19 mV (hình 3.7; 3.8). Kết quả cho thấy, thế zeta của các hạt nano không cao, các hạt có thể kết tụ lại, đó là một vấn đề
lớn trong ứng dụng vận chuyển thuốc. Tuy nhiên khi có mặt của chitosan, do chitosan tích điện dương, làm tăng lực đẩy tĩnh điện giữa các hạt, nên thế zeta
Hình 3.7. Thế zeta hạt nano có mặt chitosan
Hình 3.8. Thế zeta của hạt nano không có mặt chitosan
3.4. Hiệu suất đóng gói curcumin
Curcumin nồng độ 0,1 mg/ml trong DMSO được đo phổ hấp thụ ở
bước sóng từ 300 nm đến 700 nm, kết quả cho thấy độ hấp thụ của curcumin cao nhất ở bước sóng 430 nm (hình 3.9).
D12-Spectrum Wavelength (nm) O D 300 350 400 450 500 550 600 650 700 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500
Hình 3.9. Phổ hấp thụ của curcumin ở bước sóng từ 300-700 nm