Curcumin nồng độ 0,1 mg/ml trong DMSO được đo phổ hấp thụ ở
bước sóng từ 300 nm đến 700 nm, kết quả cho thấy độ hấp thụ của curcumin cao nhất ở bước sóng 430 nm (hình 3.9).
D12-Spectrum Wavelength (nm) O D 300 350 400 450 500 550 600 650 700 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000 2.500 3.000 3.500
Hình 3.9. Phổ hấp thụ của curcumin ở bước sóng từ 300-700 nm
Để xây dựng đường chuẩn curcumin, các dung dịch curcumin có nồng
độ lần lượt là: 0,01 mg/ml; 0,02 mg/ml; 0,04 mg/ml; 0,06 mg/ml; 0,08 mg/ml và 0,1 mg/ml được đo độ hấp thụở bước sóng 430 nm trên máy đo quang phổ
kế Synergy HT (Biotek), kết quảđo được thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Giá trị OD và nồng độ curcumin trong mẫu chuẩn
Tên mẫu N(mg/ml) ồng độ OD 430 nm STD1 0.1 3.404 STD2 0.08 2.937 STD3 0.06 2.249 STD4 0.04 1.544 STD5 0.02 0.817
Dựa vào nồng độ và độ hấp thụ đo được, sử dụng phần mền Gen5 của máy đo quang phổ kế Synergy HT để xây dựng đường chuẩn curcumin (hình 3.10). Đường tương quan tuyến tính có phương trình:
Y = 33,7X + 0,151
Trong đó: X là nồng độ curcumin trong dung dịch (mg/ml) Y là độ hấp thụđo được (OD)
Hệ số tương quan R2 là 0,9902, phương trình này được sử dụng để tính nồng
độ curcumin khi biết độ hấp thụ.
Hình 3.10. Đường chuẩn curcumin
Hiệu suất đóng gói curcumin trong hạt nano Chi-PF được tính toán gián tiếp dựa vào lượng curcumin dư thừa (lượng curcumin tự do) không được
đóng gói nằm trong dịch sau ly tâm. Theo giá trị OD đo được, dựa vào phương trình tuyến tính và đường tương quan tuyến tính giữa độ hấp thu và nồng độ curcumin (đường chuẩn curcumin) có thể xác định được nồng độ
Hàm lượng curcumin tự do trong dịch sau ly tâm được tính toán theo công thức:
Lượng curcumin tự do (mg) = A.N.V
Trong đó: A là hệ số pha loãng
N là nồng độ curcumin tự do trong dịch sau ly tâm V là thể tích dịch sau ly tâm (ml)
Bảng 3.2. Giá trị OD, nồng độ và hàm lượng curcumin tự do
Mẫu OD430 Nồng độ (mg/ml) Hàm lượng (mg)
Bank 0,048 0,00 0,00
Curcumin tự do 0,812 0,0196 3,92
Dựa vào công thức tính hiệu suất đóng gói, chúng tôi tính toán được hiệu suất
đóng gói curcumin như sau:
Như vậy hiệu suất đóng gói curcumin trong hạt nano Chi-PF là 60,8 %, kết quả tương ứng với kết quả nghiên cứu của Hosniyeh H và Cs (2012).
3.5. Tính thấm của hạt nano vào tế bào HEKA293
Hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin, cấu tạo bao gồm một lõi là khối cầu PF được hình thành qua quá trình tự lắp ráp hoặc sử dụng nồng độ micelle tới hạn [63,64]. Tiếp theo là lớp chitosan phủ trên bề mặt của hạt nano bằng cách sử dụng tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và PF tích
điện âm. Chitosan là một polymer có tính phân hủy sinh học và tương thích sinh học, vỏ chitosan có thể bảo vệ các hợp chất có hoạt tính sinh học khỏi
được ghép cộng hóa trị với chitosan, chitosan tích điện dương nên dễ dàng
được hấp phụ trên bề mặt tế bào nhờ tương tác điện tích và có thể thấm vào tế
bào thông qua quá trình nội bào hóa (endocytosis) [67]. Sau khi vào bên trong tế bào, hoạt chất được phóng thích theo cơ chế hợp nhất hóa với thể lysosome tiêu thụ hạt nano hoặc tương tác làm phá vỡ thể nội bào trong môi trường tế
bào chất. Vỏ chitosan bị phá hủy bởi enzyme lysozyme, làm phá vỡ các micelle và giải phóng curcumin.
Tế bào HEKA293 được ủ với hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin trong 24h, sau đó tiến hành quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang (hình 3.11).
Hình 3.11. Sự phát quang của curcumin trong tế bào HEKA293 (a) Ảnh truyền qua, (b) Ảnh huỳnh quang truyền qua
(c) Ảnh huỳnh quang
Hình ảnh phát huỳnh quang cho thấy, curcumin đã xâm nhập được vào 1 tế bào HEK trong trường kính quan sát. Tuy nhiên, chỉ có một vài tế bào, chiếm tỷ lệ rất nhỏ trong tổng số tế bào, phát huỳnh quang màu xanh lá cây sau khi ủ với nano Chi-PF tích hợp curcumin. Điều này cho thấy hiệu quả hấp thu của tế bào không cao. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu trước đây của Manaspon và cs, cho rằng chỉ có 15% thuốc chống ung thưđược tích lũy sau 24h.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Đã chế tạo thành công nano chitosan bằng phương pháp tạo gel ion sử
dụng TPP. Hạt nano chitosan tạo ra có dạng hình cầu, khá đồng đều với kích thước trung bình là 119,9 nm.
2. Đã tạo được hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin bằng phương pháp tự
lắp ráp đơn giản, không cần sử dụng dung môi hữu cơ độc hại. Ảnh chụp SEM và chụp TEM đều cho thấy hạt có dạng hình cầu, khá đồng nhất. Kích thước trung bình của hạt là 151 nm, thế zeta là 5,09 mV. Sự
tương phản của chitosan và PF trong ảnh chụp TEM cho thấy sự hợp nhất của PF bên trong cấu trúc hạt nano chitosan. Ảnh soi huỳnh quang cho thấy curcumin đã được tích hợp vào bên trong cấu trúc của hạt nano với hiệu suất đóng gói là 60,8%.
3. Bước đầu kiểm tra tính thấm của hạt nano vào tế bào HEK293.
KIẾN NGHỊ
1. Tối ưu hóa quy trình tạo hạt nano Chi-PF tích hợp curcumin nhằm tăng hiệu suất đóng gói curcumin.
2. Thử độc tính của hạt nano tạo ra trên tế bào ung thư, từ đó hướng đến
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Purusotam Basnet and Natasa Skalko-Basnet, 2011, Curcumin: An Anti- Inflammatory Molecule from a Curry Spice on the Path to Cancer Treatment Molecules 2011, 16, 4567-4598.
2. Bohorquez M, Koch C, Trygstad T, and Pandit N 1999, J Colloid Interf Sc
216(1), 34-40.
3. Wenzel JGW, Balaji K, Koushik K, et al 2002, J Control Release 85(1-3), 51-59.
4. Veyries M, Couarraze G, Geiger S, et al 1999, Int J Pharm 192(2), 183- 193.
5. Bae KH, Ha YJ, Kim C, Lee KR, and Park TG 2008, Journal of Biomaterials Science 19(12), 1571-1583.
6. Agnihotri SA, Mallikarjuna NN, Aminabhavi TM, 2004, J Control Release
100(1), 5-28.
7. Hosniyeh H, Fatemeh A, Rassoul D, and Aeyed NO 2012, Int. J. Nanomedicine 7, 1851-1863.
8. Nguyễn Minh Đức, Trương Công Trí, 2010, Hạt nano: kỹ thuật bào chế, phân tích tính chất ứng dụng trong ngành dược, Nxb Y học HCM.
9. Kumar MNVR, 2002, A review of chitin and chitosan applications,
Reactive & Functional Polymers, 46, 1-27.
10.Rinaudo M, 2006, Chitin and chitosan: Properties and applications,
Progress in Ploymer Science, 31, 603-632.
11.Zhang H, Wu S, Tao Y, Zang L, Su Z, 2010, Preparation and Characterrization of Water-Soluble Chitosan nanoparticles as Protein Delivery System, Journal of Nanometerials, 1-5.
12.Tiyaboonchai W, 2003, Chitosan Nanoparticles: APromising System for Drug Delivery, Naresuan University Journal, 11 (3), 51-66.
13.Gan Q, Wang T, 2007, Chitosan nanoparticle as protein delivery carrier- Systematic examineation of fabrication conditions for efficient loading and release, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 59, 24-34.
14.Du WL, Niu SS, Xu YL, Xu ZR, Fan CL, 2009, Antibacterial activity of chitosan tripolyphosphate nanoparticles loaded with various metal ions,
Carbohydrate Plymers, 75, 385-389.
15.Qui L, Xu Z, Jiang X, Hu C, Zou X, 2004, Preparation and antibacterial activity of chitosan nanoparticles, Carbohydrate Reasearch, 339, 2693- 2700.
16.Chen L, Remondetto GE, Subirade M, 2006, Food protein-based materials as nutraceutical delivery systems, Trends in Food Science & Technology, 17, 272-283.
17.Chen L, Subirade M, 2005, Chitosan/β-lactoglobulin core-shell nanoparticles as nutraceutical carriers, Biomaterials, 26, 6041-6053.
18.Gan Q, Wang T, Cochrane C, McCarron P, 2005, Modulation of surface charge, particle size and morphological properties of chitosan-TPP nanoparticles intended for gene delivery, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 44, 65-73.
19.Nguyễn Anh Dũng, 2010, Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm tá chất miễn dịch cho vaccine cum A H5N1 và xây dựng mô hình thử nghiệm trên động vật, Trường Đại học Tây Nguyên, Thành Phố Hồ Chí Minh. 20.Tr n i Lâm, Phùng Nguy n Hào, 2006, T ng h p, c tr ng và ng
21.Conney A, 2003, Enzyme induction and dietary chemicals as approaches to cancer chemoprevention: The seventh DeWitt S, Goodman lecture, Cancer Res, 63, 7005-7031.
22.Aggarwal BB, Surh YJ, Shishodia S, Eds, 2007, Advances in experimental medicine and biology, In The Molecular Target and Therapeutic Uses of Curcumin in Health and Disease, Springer: New York, NY, USA.
23.Roughley PJ, Whiting DA, 1973, Experiments in the biosynthesis of curcumin, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 20, 2379-2388.
24.Basnet P, Tho I, Skalko-Basnet N. Curcumin, 2010, A Wonder Drug of 21st Century: Liposomal Delivery System Targeting Vaginal Inflammation,
5th International Congress on Complementary Medicine Research, Tromsø, Norway, Abstract Number A9M2K9C.
25.Jovanovic SV, Steenken S, Boone CW, Simic MG, 1999, H-atom transfer is a preferred antioxidant mechanism of curcumin, J. Am. Chem. Soc, 121, 9677-9681.
26.Wahlstrom B, Blennow GA, 1978, Study on the fate of curcumin in the rat, Acta Pharmacol. Toxicol. (Copenh), 43, 86-92.
27.Ravindranath V, Chandrasekhara N, 1981, In vitro studies on the intestinal absorption of curcumin in rats, Toxicology, 20, 251-257.
28.Ravindranath V, Chandrasekhara N, 1981, Metabolism of curcumin: Studies with curcumin, Toxicology, 22, 337-344.
29.Holder GM, Plummer JL, Ryan AJ, 1978, The metabolism and excretion of curcumin (1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6- heptadiene-3,5- dione) in the rat, Xenobiotica, 8, 761-768.
30.Shoba G, Joy D, Joseph T, Majeed M, Rajendran R, Srinivas PS, 1998, Influence of piperine on the pharmacokinetics of curcumin in animals and human volunteers, Planta Med, 64, 353-356.
31.Strimpakos AS, Sharma RA, 2008, Curcumin: Preventative and therapeutic properties in laboratory studies and clinical trials, Antioxid. Redox Sign, 10, 511-545.
32.Kurien BT, Scofield RH, 2009, Oral administration of heat-solubilized curcumin for potentially increasing curcumin bioavailability in experimental animals, Int. J. Cancer, 125, 1992-1993.
33.Zebib B, Mouloungui Z, Noirot V,2010, Stabilization of curcumin by complexation with divalent cations in glycerol/water system, Bioinorg. Chem. Appl, doi:10.1155/2010/292760.
34.Kudva AK, Manoj MN, Swamy BN, Ramadoss CS, 2011, Complexation of
amphoterecin B and curcumin with serum albumin: Solubility and effect on erythrocyte membrane damage, J. Expt. Pharmacol, 3, 1-6.
35.Qiu X, Du Y, Lou B, Zuo Y, Shao W, Huo Y, Huang J, Yu Y, Zhou B, Du J, Fu H, Bu X, 2010, Synthesis and identification of new 4-arylidene curcumin analogues as potential anticancer agents targeting nuclear factor-
κB signaling pathway, J. Med. Chem, 53, 8260-8273.
36.Safavy A, Raisch KP, Mantena S, Sanford LL, Sham SW, Rama Krishna N, Bonner JA, 2007, Design and development of water-soluble curcumin conjugates as potential anti-cancer agents, J. Med. Chem, 50, 6284-6288. 37.Ma Z, Haddadi A, Molavi O, Lavasanifar A, Lai R, Samuel J, 2008,
38.Song Z, Feng R, Sun M, Guo C, Gao Y, Li L, Zhai G, 2011, Curcumin- loaded PLGA-PEG-PLGA triblock copolymeric micelles: Preparation, pharmacokinetics and distribution in vivo, J. Colloid Interface Sci, 354, 116-123.
39.Shaikh J, Ankola DD, Beniwal V, Singh D, Ravi Kumar MNV, 2009, Nanoparticle encapsulation improves oral bioavailability of curcumin by at least 9-fold when compared to curcumin administered with piperine as absorption enhancer, Eur. J. Pharm. Sci, 37, 223-230.
40.Tsai YM, Jan WC, Chien CF, Lee WC, Lin LC, Tsai TH, 2011, Optimized nano-formulation on the bioavailability of hydrophobic polyphenol, curcumin, in freely-moving rats, Food Chem, 127, 918-925.
41.Anitha A, Deepagan VG, Divya Rani VV, Menon D, Nair SV, Jayakumar R, 2011, Preparation, characterization, in vitro drug release and biological studies of curcumin loaded dextran sulphate-chitosan nanoparticles,
Carbohyd. Polym, 84, 1158-1164.
42.Bisht S, Feldmann G, Soni S, Ravi R, Karikar C, Maitra A, 2007, Polymeric nanoparticle-encapsulated curcumin (“nanocurcumin”): A novel strategy for human cancer therapy, J. Nanobiotechnol, 5, 1-18.
43.Bhawana, Basniwal RK, Buttar HS, Jain VK, Jain N, 2011, Curcumin nanoparticles: preparation, characterization, and antimicrobial study, J. Agric. Food Chem, 59, 2056-2061.
44.Wu W, Shen J, Banerjee P, Zhou S, 2011, Water-dispersible multifunctional hybrid nanogels for combined curcumin and photothermal therapy, Biomaterials, 32, 598-609.
45.Gupta NK, Dixit VK, 2011, Bioavailability enhancement of curcumin by complexation with phosphatidylcholine, J. Pharm. Sci, 100, 1987-1995.
46.Sou K, Inenaga S, Takeoka S, Tsuchida E, 2008, Loading of curcumin into macrophages using lipid-based nanoparticles, Int. J. Pharm, 352, 287-293. 47.Kakkar V, Singh S, Singla D, Kaur IP, 2011, Exploring solid lipid
nanoparticles to enhance the oral bioavailability of curcumin, Mol. Nutr. Food Res, 55, 495-503.
48.Mulik RS, Moenkkoenen J, Juvonen RO, Mahadik KR, Paradkar AR, 2010, Transferrin mediated solid lipid nanoparticles containing curcumin: enhanced in vitro anti-cancer activity by induction of apoptosis, Int. J. Pharm, 398, 190-203.
49.Yadav VR, Suresh S, Devi K, Yadav S, 2009, Novel formulation of solid lipid microparticles of curcumin for anti-angiogenic and anti-inflammatory activity for optimization of therapy of inflammatory bowel disease, J. Pharm. Pharmacol, 61, 311-321.
50.Di Cagno M, Styskala J, Hlaváč J, Brandl M, Bauer-Brandl A, Skalko- Basnet N, 2011, Liposomal solubilization of new 3-hydroxy-quinolinone derivatives with promising anti-cancer activity: A screening method to
identify maximum incorporation capacity, J. Liposome Res,
doi:10.3109/08982104.2010.550265.
51.Kunwar A, Barik A, Pandey R, Priyadarsini IK, 2006, Transport of liposomal and albumin loaded curcumin to living cells: An absorption and fluorescence spectroscopic study, BBA-Gen. Subjects, 1760, 1513-1520. 52.Chen C, Johnston TD, Jeon H, Gedaly R, McHugh PP, Burke TG, Ranjan
D, 2009, An in vitro study of liposomal curcumin: Stability, toxicity and biological activity in human lymphocytes and Epstein-Barr virus-
53.Li L, Braiteh FS, Kurzrock R, 2005, Liposome-encapsulated curcumin: In vitro and in vivo effects on proliferation, apoptosis, signalling, and angiogenesis, Cancer, 104, 1322-1331.
54.Li L, Ahmed B, Mehta K, Kurzrock R, 2007, Liposomal curcumin with and without oxaliplatin: Effects on cell growth, apoptosis, and angiogenesis in colorectal cancer, Mol. Cancer Ther, 6, 1276-1282.
55.Thangapazham RL, Puri A, Tele S, Blumenthal R, Maheshwari RK, 2008, Evaluation of a nanotechnology-based carrier for delivery of curcumin in prostate cancer cells, Int. J. Oncol, 32, 1119-1123.
56.Wang D, Veena MS, Stevenson K, Tang C, Ho B, Suh JD, Duarte VM, Faull KF, Mehta K, Srivatsan ES, Wang MB, 2008, Liposome- encapsulated curcumin suppresses growth of head and neck squamous cell carcinoma in vitro and in xenografts through the inhibition of nuclear factor-κB by an AKT-independent pathway, Clin. Cancer Res, 14, 6228- 6236.
57.Takahashi M, Inafuku K, Miyagi T, Oku H, Wada K, Imura T, Kitamoto D, Efficient preparation of liposomes encapsulating food materials using lecithins by a mechanochemical method, J. Oleo Sci, 56, 35-42.
58.Aukunuru J, Joginapally S, Gaddam N, Burra M, Bonepally CR, Prabhakar K, 2009, Preparation, characterization and evaluation of hepatoprotective activity of an intravenous liposomal formulation of bis-demethoxy curcumin analogue (BDMCA), Int. J. Drug Dev. Res, 1, 37-46.
59.Narayanan NK, Nargi D, Randolph C, Narayanan BA, 2009, Liposome encapsulation of curcumin and resveratrol in combination reduces prostate cancer incidence in PTEN knockout mice, Int. J. Cancer, 125, 1-8.
60.Mourtas S, Canovi M, Zona C, Aurilia D, Niarakis A, La Ferla B, Salmona M, Nicotra F, Gobbi M, Antimisiaris SG, 2011, Curcumin-decorated nanoliposomes with very high affinity for amyloid-β1-42 peptide,
Biomaterials, 32, 1635-1645.
61.Moghaddam FA, Atyabi F, Dinarvand R 2009, Nanomedicine 5(2), 208- 215.
62.Calvo P, Remunan LC, Vila Jato J, and Alonso M 1997, Appl Polym Sci 63 (1), 125-132.
63.Sharma PK and Bhatia SR 2004, Int. J. Pharm. 278(2), 361-377.
64.Kabanov AV, Lemieux P, Vinogradov, and Alakhov V 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54(2), 223-233.
65.Zhongli L., Shuxian B 2007, Enz and Microbial technology 40(5), 1442- 1447.
66.Beom K, Cheol-Sang K, and Kang-Min L 2008, Archives of Pharm Research 31(8), 1050-1054.
67.Stromhaug PE, Berq TO, Gjoen T, and Seglen PO 1997, European Journal of Cell Biology 73(1), 28-39.