Bài giảng Công nghệ sản xuất các chất kháng sinh và vitamin

Nha Trang, năm 2014BÀI GIẢNG ĐIỆN TỬ CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CÁC CHẤT KHÁNG SINH VÀ VITAMIN GV: Lê Phương Chung Bộ môn Công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học và môi trường 1... MỞ ĐẦU: G

Nha Trang, năm 2014

BÀI GIẢNG ĐIỆN TỬ

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

CÁC CHẤT KHÁNG SINH VÀ VITAMIN

GV: Lê Phương Chung

Bộ môn Công nghệ sinh học Viện Công nghệ sinh học và môi trường

1

MỞ ĐẦU: GiỚI THIỆU VỀ HỌC PHẦN

 Tên học phần: Công nghệ sản xuất kháng sinh và vitamin

 Nội dung các chủ đề:

 Cơ sở khoa học của quá trình sinh tổng hợp kháng sinh

 Tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh

 Nuôi cấy vi sinh vật sinh kháng sinh

 Chiết xuất và tinh chế kháng sinh

 Công nghệ sản xuất vitamin

2

Tài liệu tham khảo

 Kỹ thuật sản xuất dược phẩm : Từ Minh Kóong; NXB Y học HN

 Công nghệ sinh học phân tử: Nguyên lý và ứng dụng của AND tái tổ hợp: Bernard R.Glick và cs, do Đỗ Lê Thăng và cs dịch;

NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà nội

 Bài giảng môn Công nghệ dược phẩm: Trương Thị Minh Hạnh;

NXB Trường ĐH bách khoa Đà Nẵng

3

Đánh giá kết quả

(%)

1 Điểm các lần kiểm tra giữa kỳ 20%

2 Điểm chuyên cần/thái độ 10%

3 Điểm làm bài tập nhóm và thảo luận trên

Vấn đề 1:

Cơ sở khoa học của quá trình sinh tổng hợp

kháng sinh

1 Khái niệm, phân loại kháng sinh

2 Cơ chế tác dụng của kháng sinh

3 Bản chất của hiện tượng đề

kháng kháng sinh

5

Chất kháng sinh (antibiotic) là gì?

Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần đầu tiên được Pasteur và

Joubert (1877) sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả nănggây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên động vật nhiễm

bệnh nếu tiêm vào các động vật này một số loại vi khuẩn hiếu khílành tính khác

Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tínhkháng khuẩn của Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình

thành bào tử của loại trực khuẩn này Gratia và đồng nghiệp(1925) đã tách được từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng

để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn

Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh

Sự phát triển về vi sinh vậthọc nói chung, và vi sinh vật công

nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch

sử là phát minh vĩ đại về chất kháng

sinh của Alexander Fleming (1928)

đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học:

khai sinh ra ngành công nghệ sản

xuất chất kháng sinh và ứng dụng

thuốc kháng sinh vào điều trị cho

con người

Năm 1928, Alexander Flemming, một nhà khoa học

Scotland, lần đầu tiên thấy trong môi

trường nuôi cấy tụ cầu vàng nếu có

lẫn nấm penicillium thì khuẩn lạc

gần nấm sẽ không phát triển được.

Năm 1939, Florey và Chain

đã chiết được ra từ nấm đó chất

penicillin dùng trong điều trị. Alexander Fleming (6.8.1881 – 11.3.1955)

Vì bộ phận sinh sản của loài mốc đó có hình dạng giống cái bút lông nên được đặt tên là penicillium (tiếng la tinh penicillium nghĩa là cái bút lông).

8

Năm 1938, Fleming nhận được thư của hai nhà khoa học từtrường Đại học Oxford là Ernst Boris Chain và Howard WalterFlorey, với lời đề nghị được hợp tác với ông để tiếp tục thực hiệncông trình nghiên cứu về penicillin và họ đã thử nghiệm thành côngpenicillin trên chuột vào 1940.

Năm 1941, nhóm đã chọn được loại nấm penicillin ưu việt

nhất là chủng Penicillin Chrysogenium, chế ra loại penicillin có hoạt

tính cao hơn cả triệu lần penicillin do Fleming tìm thấy lần đầu năm1928

Năm 1945, Fleming được giải thưởng Nobel về y học cùngvới Ernst Boris Chain và Howard Walter Florey

9

Ngày nay con người biết được khoảng 8000 chất kháng sinh,

100 loại được dùng trong Y khoa và Thú y

10

Phân loại kháng sinh

Dựa vào tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh:

- Nồng độ ức chế tối thiểu MIC: là nồng độ thấp nhất của 1 KS cókhả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn sau khoảng 24h nuôicấy

- Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC: là nồng độ thấp nhất làm giảm99.9% lượng vi khuẩn

- Kháng sinh diệt khuẩn: MBC/MIC ~ 1 và dễ dàng đạt được MBCtrong huyết tương: penicillin, cephalosporin, aminosid, polymyxin

- Kháng sinh kìm khuẩn: MBC/MIC>4 và khó đạt được nồng độbằng nồng độ MBC trong huyết tương: tetracyclin, cloramphenicol,macrolid

11

Phân loại dựa trên cơ chế tác dụng

- Thuốc ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn: penicillin,cephalosporin, imipenem, moxalactam, vancomycin, bacitracin

- Thuốc ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn: tetracyclin,cloramphenicol, macrolid, lincosamid và aminoglycosid

- Thuốc ức chế tổng hợp acid nhân: quinolon, rifampicin

- Thuốc ức chế chuyển hoá: co trimoxazol

- Thuốc làm thay đổi tính thấm của màng tế bào: polymyxin,amphotericin

12

Phân loại dựa theo cấu trúc hóa học

Chemical group Example

CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA KHÁNG SINH

Ức chế sự tổng hợp vách tế bào

Chức năng của vách (thành) tế bào :

 Giữ hình dạng đặc trưng của tế bào vi khuẩn

 Bảo vệ tế bào dưới áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào

 Làm khuôn mẫu để tổng hợp vách tế bào mới

15

Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế

+ VK Gr(+) biến thành dạng hình cầu không có vách (protoplast)

+ Tế bào dễ vỡ ở môi trường có trương lực bình thường

16

 Giai đoạn 2 :

Hoạt hóa các enzym tự tiêu  ly giải tế bào ở

môi trường đẳng trương

* Các chất kháng sinh nhóm này gồm: Bacitracin, Cephalosporin, Cycloserine, Penicillin, Rostocetin, Vancomycin

18

Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào

Chất kháng sinh tác động:

 Mất sự toàn vẹn của màng tế bào  đại phân

tử và ion thoát ra khỏi tế bào  tế bào chết

 Màng tế bào VK và vi nấm dễ bị phá hủy bởi một số tác nhân

* KS thuộc nhóm này : Amphotericin B, Colistin, Imidazole, Nystatin, Polymycins

20

Ức chế sự tổng hợp protein

Aminoglycosides : Streptomycin

 GĐ 1: thu ốc gắn vào thụ thể trên tiểu đơn vị 30S

 GĐ 2 : phong bế hoạt tính của phức hợp đầu tiên

trong quá trình thành l ập chuỗi peptid

 GĐ 3 : thông tin mRNA bị đọc sai  1 acid amin không phù hợp

 GĐ 4 : làm vỡ các polysomes thành monosomes 

không có chức năng tổng hợp protein

21

THẢO LUẬN TẠI LỚP

CHỦ ĐỀ:

HIỆN TƯỢNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH? BẢN CHẤT VÀ CÁCH PHÒNG TRÁNH

24

C ơ chế đề kháng kháng sinh

 VK sản xuất enzym phá hủy hoạt tính của thuốc

 VK làm thay đổi khả năng thẩm thấu của màng tế bào đối với thuốc

 Điểm gắn của thuốc có cấu trúc bị thay đổi

 VK thay đổi đường biến dưỡng làm mất tác dụng của thuốc

 VK có enzym đã bị thay đổi

25

Một số phối hợp thuốc có tác dụng hiệp đồng

Một số phối hợp đối kháng cần tránh

 Aminoglycoside + chloramphenicol

 Aminoglycoside + tetracyclin

 Quinolon + chlormphenicol

 Penicillin G / ampicillin + tetracyclin

 Penicillin G / ampicillin + macrolide

28

VẤN ĐỀ 2:

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI SINH

VẬT SINH KHÁNG SINH

29

Nguồn thu mẫu

ở sông hồ…

30

Phương pháp cấy vi sinh vật

 Phương pháp cấy dịch chiết đất lên bề mặt thạch:

lượng nước, sau đó cho vào bình và lắc khoảng 5 phút.

nhau.

31

 Phương pháp cấy đất trực tiếp lên bề mặt thạch đã chứa sẵn vi sinh vật kiểm định

 Trên đĩa petri có môi trường dinh dưỡng và chứa vi sinh vật kiểm định, đem gieo trực tiếp mẫu đất lên trên bề mặt thạch

 Để tủ ấm 2 – 3 ngày rồi quan sát Nếu xung quanh mẫu đất cấy trên đĩa có vòng vô khuẩn, biết được vi sinh vật trong mẫu đất đó có sinh

ra chất kháng sinh chống lại vi sinh vật kiểm định.

32

Nuôi vi sinh vật sinh kháng sinh

 Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh trong các bình tam giác, môi trường nuôi cấy đặc hiệu

33

Kiểm tra hoạt tính kháng sinh trên

các vi sinh vật kiểm định

 Ly tâm thu dịch lên men sau khi nuôi cấy các chủng vi sinh vật

 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp đặt thỏi thạch hoặc đục lỗ trên môi trường có chứa vi sinh vật kiểm định

 Các nhóm vi sinh vật kiểm định tùy thuộc loại kháng sinh nhưng thường mang tính đại diện

M.luteus

E.coli F.oxysporium

C.albicans

34

Các phương pháp gây đột biến

kháng sinh”

35

THẢO LUẬN TẠI LỚP

CHỦ ĐỀ:

Thiết kế thí nghiệm phân lập và tuyển chọn vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh từ mẫu đất ruộng?

37

VẤN ĐỀ 3:

NUÔI CẤY VI KHUẨN SINH KHÁNG SINH

38

- Việc tối ưu hóa thành phần môi trường lên men có vai trò rất quan trọng, quyết định năng lực và hiệu quả chung của toàn quá trình

- Điều kiện nuôi cấy vi sinh vật sinh kháng sinh: thành phần môi trường, hàm lượng oxy hòa tan, pH, nhiệt độ, tiền chất…

- Xác định nguồn nguyên liệu chính, thành phần môi trường lên men, nồng độ tương ứng của từng cấu tử trong từng thời điểm cụ thể

39

- Nguồn thức ăn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường (glucoza, fructoza, maltoza, lactoza …) dextrin, glycerin, axit axetic, manit, các loại rượu…

- Nguồn thức ăn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước chiết nấm nem, pepton, các muối NO3- , NH4+ …

- Các nguyên tố khoáng đa lượng thường gặp như: photpho, lưu huỳnh,

ma nhê, sắt, canxi, kali, natri; các nguyên tố vi lượng như: đồng, kẽm, coban, molipden… và các chất sinh trưởng

40

 Trong quá trình lên men, nghiên cứu và hiệu chỉnh tác động của các yếu tố khác trong môi trường như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng

độ oxy, thế oxy hóa khử, cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men.

 Đối với sản xuất các loại kháng sinh khác nhau, đối với nuôi cấy các vi sinh vật sinh kháng sinh khác nhau sẽ tương ứng có các điều kiện nuôi cấy khác nhau

41

BÀI TẬP VỀ NHÀ VÀ THẢO LUẬN

CHỦ ĐỀ:

Vai trò các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi vi

sinh vật sinh kháng sinh? Cho ví dụ cụ thể

42

VẤN ĐỀ 4:

CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ KHÁNG SINH

43

Các bước thu kháng sinh từ sinh khối

 Lọc hoặc ly tâm để loại bỏ sinh khối tế bào

(pH, độ nhớt,…)

 Rửa để loại bỏ tạp chất

 Sử dụng dung môi để tách chiết kháng sinh

 Tinh sạch và tinh chế kháng sinh

44

Ph ương pháp tách chiết

 Phần lớn các chủng sản sinh kháng sinh và tiết ra môi trường xung quanh, nhưng có một số chủng chỉ tiết một phần vào môi trường còn chủ yếu là vẫn nằm trong sinh khối.

 Tùy thuộc vào tính chất tan trong nước hay tan trong dung môi hữu

cơ mà lựa chọn dung môi chiết phù hợp

 Lựa chọn dung môi chiết và điều kiện tách chiết (chế độ ly tâm

tách tế bào, pH) có tính quyết định đến hiệu suất chiết kháng sinh từ

dịch nuôi cấy

45

Dung môi chiết

 Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết: độ phân cực, độ nhớt, sức căng bề mặt

 Độ phân cực: dung môi phân cực ít thì dễ hòa tan các chất không phân cực và khó hòa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và ngược lại

Dung môi không phân cực

Dung môi phân cực yếu

Dung môi phân cực mạnh

Ether, dầu hỏa, xăng,

hexan, heptan,

benzen

Chloroform, diclorethan, aceton,

ethylaetat…

Nước, glycerin, methanol, isopropanol…

46

Các phương pháp cơ bản để tinh sạch kháng sinh

CÔNG NGHỆ LÊN MEN VÀ SẢN XUẤT

PENICILLIN

48

Trong Chiến tranh thế giới II , một nhóm các nhà khoa học tìm kiếm cách chữa

trị cho những vết thương bị nhiễm trùng ,

tình cờ phát hiện ra khám phá của Fleming

và thử nghiệm với một dạng của nấm mốc

đó Chúng như có sức mạnh thần kỳ Ngay

sau đó, nó được sản xuất với số lượng

không thể tin nổi và được đưa ra mặt trận

Hơn 50 năm sau, penicillin vẫn là chất kháng sinh được sử dụng nhiều nhất thế giới Đó là nhờ vào khoa học không thích dọn dẹp Hơn 21 công ty hoá chất tham gia vào chương trình sản xuất cấp tốc penicillin trong suốt Chiến tranh thế giới II Cho đến khi kết thúc cuộc chiến họ đã sản xuất

650 tỉ đơn vị mỗi tháng

49

Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P chrysogenum

notatum và P baculatum

P.chrysogenum, tất cả các công ty sản xuất penicillin trên thế

giới đều sử dụng các biến chủng P.chrysogenum công nghiệp

 Kỹ thuật gây đột biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin là: xử

lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím và tạo đột biến bằng hoá chất, thí dụ như Metylbis - amin (metyl -2--clo- etylamin), N-

Dimetylsulfat, 1,2,3,4 -diepoxybutan.

50

Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc

P chrysogenum

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp penicillin từ axit L- - aminoadipic, L-cystein và L-valin

51

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp cystein từ xerin

52

Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp cistein từ homoxerin với sự biến đổi

-cetobutyrat thành oxaloacetat

53

Các thông số công nghệ đến quá trình sinh

tổng hợp penicillin

 Sự phát triển hệ sợi và đặc điểm hình thái hệ sợi nấm

 Đặc tính nhiệt động của dịch lên men

 Thành phần môi trường lên men

 Điều kiện tiến hành lên men

 Sự tích tụ và phân huỷ penicillin

54

QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG NGHIỆP

 Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn

bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinh penicillin có thể phânchia làm bốn công đoạn chính như sau:

 Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặcpenicillin G)

 Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên

 Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tựnhiên)

 Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại

55

Sơ đồ dây chuyền sản xuất penicillin

(theo Gist-Brocades Copr Hà Lan)

56

Chuẩn bị lên men

 Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất

 Chuẩn bị môi trường lên men

 Thiết bị lên men

 Kỹ thuật lên men

57

XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN VÀ TINH CHẾ

THU PENICILLIN TỰ NHIÊN

Sơ đồ tóm tắt công đoạn xử lý dịch lên men thu penicillin tự nhiên

58

SẢN XUẤT KHÁNG SINH

CHỐNG UNG THƯ

59

 Tên và nguồn gốc các dược phẩm được dùng trong điều trị ung thư

 Phân loại các kháng sinh dùng điều trị ung thư

 Quy trình lên men sản xuất một loại kháng sinh chống ung thư

Mục tiêu

60

Bệnh ung thư

mới; 7,6 ca tử vong

mới; 8,2 triệu ca tử vong

61

 Tuổi thọ càng cao, nguy cơ ung thư càng tăng

 Ung thư phổi là loại phổ biến nhất:

dày

 Ung thư vú là loại phổ biến đối với phụ nữ, chiếm 29%; ung thư phổi và đại tràng và ung thư vú: trên 50%

ung thư và trên 75.000 ca tử vong

62

Nguyên nhân chính

63

Các phương pháp điều trị

 Điều trị bằng phẫu thuật

 Điều trị bằng hóa trị liệu

 Điều trị nội tiết

 Điều trị miễn dịch

 Điều trị bằng tia xạ

64

Các kháng sinh chống ung thư có nguồn gốc sinh học

65

Phân loại các kháng sinh chống ung thư

 Actinomycin

 Bleomycin

 Anthracyclin

66

Cơ chế tác động

sinh học của DNA

68

Sản phẩm kháng sinh chống ung thư 69

 Sự đa dạng và vô cùng phong phú về vi sinh vật

chiều sâu vẫn còn hạn chế

sức khỏe con người

70

Collection of samples from Catba island Isolation by dry – heating and rehydration – centrifugation

Collection and isolation of actinomycetes

Screening of antibiotic producing

actinomycetes

Primary screening by agar disc method Secondary screening by culture broth method

Chromatography analyses of antibiotics Ethyl-acetate extraction

Analysis via TLC and HPLC

Primary study on cytotoxicity activity Color test method

Cytotoxicity assay

Taxonomical identification of actinomycetes

Morphological characterization DNA extraction

PCR amplification of the 16S rDNA sequencing, and phylogenetic analysis

Quy trình nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh

71

8

A1018

Hình dạng và màu sắc khác nhau của các khuẩn lạc xạ khuẩn

72

Đặc điểm hình thái khi soi kính hiển vi

(A)

A390

(C) A1073

(D) A1043

73

Khảo sát khả năng kháng sinh trên các chủng chỉ thị

74

VẤN ĐỀ 5

76

 Vitamin là nhóm các hợp chất có phân tử lượng tương đối nhỏ, có tính chất lý hóa khác nhau nhưng đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống của bất kỳ cơ thể sinh vật nào.

(trong khi các chất dinh dưỡng khác khoảng 600g) và có vai trò như chất xúc tác.

trúc hóa học, khảo sát về tính chất vật lý, tính chất hóa học cũng như tác dụng sinh học của chúng

77

2 Nhóm vitamin hòa tan trong dầu béo: Vitamin A(antixerophtalmias), các vitamin D, các vitamin E, các vitamin K

78

Vai trò và tác dụng của vitamin

 Nhóm các vitamin chi phối tới hoạt động sinh dục gồm có A, C, E

 Nhóm trợ giúp sự tăng trưởng: gồm tất cả các vitamin (trừ H)

79