kỹ thuật thao tác trên gen

1 KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN 2 3 Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng 4 Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng 5 Tạo dòng DNA mục tiêu được nhân bản bằng kỹ thuật PCR 6 7 1. KỸ THUẬT PCR 8 PCR: nhân bản sao một đoạn DNA mục tiêu in vitro Phản ứng PCR: nhiều chu kỳ sao mã, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Biến tính (denaturation) - Bắt cặp (annealing) - Kéo dài (elongation) 9 10 Các bước trong phản ứng PCR và phân tích sản phẩm [...]... ứng PCR 15 Sản phẩm của phản ứng PCR và phân tích - PCR phân tích: nhằm có thơng tin về sự hiện diện hay khơng của một trình tự DNA chun biệt, số lượng bản sao của gen, sự biểu hiện của gen (RT-PCR)… - PCR điều chế: nhằm thu được đoạn DNA, gen mục tiêu - Phân tích sản phẩm PCR phân tích: + Điện di xác định kích thước sản phẩm PCR + Phân tích bằng enzyme cắt giới hạn + Lai phân tử + Giải trình tự - Phân... của PCR quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR 12 Chiều dài của mồi ảnh hưởng đến tính đặc hiệu của phản ứng PCR - Mồi 8bp: tần suất xuất hiện 48 = 1/65.536bp, tương đương 46.000 trình tự trên 3 x 109bp ở bộ gen người - Mồi 17bp: tần suất xuất hiện 417 = 1/18x109 - Mồi q dài: thời gian bắt cặp sẽ tăng lên - Kích thước trung bình tối ưu của mồi: ≈ 20bp 13 Nhiệt độ các bước trong phản ứng PCR - Nhiệt... trình tự nhận biết của RE trên DNA - Tùy thuộc vào số base trong trình tự nhận diện: + 4 base: tần số là 1:44 (hay 1/256) + 6 base: tần số là 1:46 (hay 1/4096) 26 Bản đồ giới hạn của λ 27 Qui trình cắt DNA bằng RE Thành phần phản ứng: DNA 2µg 16µl Buffer 10X 2µl Enzyme 0,5µl H2O 1,5µl Điều kiện: 37oC, 1h 28 Đệm 10X cho phản ứng cắt DNA bằng BglII 29 Điện di DNA trong pha lỏng 30 Tách các đoạn DNA theo... phản ứng cắt DNA bằng BglII 29 Điện di DNA trong pha lỏng 30 Tách các đoạn DNA theo kích thước bằng điện di trong gel 31 Hiển thị các vạch DNA bằng EtBr 32 Điện di trên gel agarose và xem vạch DNA 33 Ảnh kết quả phân tích DNA bằng điện di trên gel agarose 34 Xác định kích thước vạch DNA bằng độ di động điện di - Dùng thang kích thước gồm các vạch DNA đã biết trước kích thước (bp) - Kích thước vạch DNA... bằng các phương pháp đánh dấu và phát hiện - Đánh dấu (labelling): + Đồng vị phóng xạ (radioisotope): phương pháp „nóng“ (hot) + Khơng đồng vị: phương pháp „nguội“ (cold) - Phát hiện (detection): ảnh trên phim hoặc màu 36 . 1 KỸ THUẬT THAO TÁC TRÊN GEN 2 3 Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng 4 Nhu cầu cắt chính xác vị trí trên DNA trong tạo dòng 5 Tạo dòng DNA mục tiêu được nhân bản bằng kỹ thuật. không của một trình tự DNA chuyên biệt, số lượng bản sao của gen, sự biểu hiện của gen (RT-PCR)… - PCR điều chế: nhằm thu được đoạn DNA, gen mục tiêu - Phân tích sản phẩm PCR phân tích: + Điện. PCR - Mồi 8bp: tần suất xuất hiện 4 8 = 1/65.536bp, tương đương 46.000 trình tự trên 3 x 10 9 bp ở bộ gen người - Mồi 17bp: tần suất xuất hiện 4 17 = 1/18x10 9 - Mồi quá dài: thời gian