nghiên cứu tính nhạy cảm kháng sinh của trực khuẩn mủ xanh (pseudomonas aeruginosa)

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh thường gặp ở Việt Nam thì P.aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện bộ môn vi s

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS.BS LƯU THỊ KIM THANH

THÁI NGUYÊN - 2010

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Xã hội càng phát triển thì nhu cầu về chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ của con người ngày càng cao; có sức khoẻ con người có thể làm ra nhiều của cải vật chất, nâng cao chất lượng cuộc sống Vì vậy việc tìm hiểu, nghiên cứu các tác nhân gây bệnh và cách chữa trị cho con người là việc làm thiết thực có ý nghĩa quan trọng, góp phần vào sự phát triển chung của nhân loại

Tồn tại xung quanh chúng ta có biết bao nhiêu tác nhân gây bệnh mà mắt thường không nhận biết được, trong đó có các vi sinh vật Khi cơ thể suy yếu, sức

đề kháng giảm, chúng ta đều có thể bị tấn công

Hiện nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của khoa học cũng như y học, người ta đã phân lập, phát hiện ra rất nhiều loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh; đặc biệt là loại vi

khuẩn gây nhiễm trùng cơ hội Trực khuẩn mủ xanh (tên khoa học là Pseudomonas

aeruginosa) - một trong những tác nhân quan trọng gây nhiễm khuẩn bệnh viện

Trực khuẩn mủ xanh là trực khuẩn Gram âm, chúng phân bố rộng rãi trong các môi trường ngoại cảnh như đất, nước, không khí, nhất là ở môi trường ẩm ướt chúng có nhiều cơ hội xâm nhập và gây bệnh Nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh gây ra điển hình là nhiễm trùng da (nhiễm trùng vết thương, vết bỏng…), nhiễm trùng đường hô hấp (viêm phổi, viêm phế quản…), nhiễm trùng đường tiểu và nặng hơn là gây nhiễm trùng huyết Nếu vi khuẩn xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận, sẽ gây ra những hậu quả chết người vì vi khuẩn này phát triển tốt trên các bề mặt bên trong cơ thể

Trực khuẩn mủ xanh là loại vi khuẩn có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách trong cộng đồng và chưa hợp lý trong bệnh viện đã đưa tới mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và Trực khuẩn mủ xanh nói riêng ngày một tăng

Sử dụng kháng sinh an toàn và hợp lý trên cơ sở hiểu biết những cơ chế tác dụng của kháng sinh cũng như đặc tính của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của chúng đóng vai trò góp phần hết sức quan trọng trong việc điều trị bệnh cho bệnh nhân

Trước yêu cầu của thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính

nhạy cảm kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh (Pseudomonas aeruginosa)”

nhằm những mục tiêu nghiên cứu sau:

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định tỷ lệ nhiễm trùng do Trực khuẩn mủ xanh trên bệnh nhân và tỉ lệ

ô nhiễm Trực khuẩn mủ xanh ở môi trường bệnh viện

- Định loại Trực khuẩn mủ xanh

- Xác định mức độ đơn kháng và đa kháng kháng sinh của Trực khuẩn mủ xanh

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập P.aeruginosa từ một số bệnh phẩm (mủ vết thương, dịch mũi

họng, nước tiểu), từ môi trường (nước, không khí, bề mặt dụng cụ y tế đang sử dụng) trong bệnh viện

- Nghiên cứu mức độ kháng kháng sinh của P.aeruginosa dựa trên kết quả

kháng sinh đồ của các chủng P.aeruginosa phân lập được

CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Những nghiên cứu về Pseudomonas aeruginosa

1.1.1 Lược sử nghiên cứu P.aeruginosa

Năm 1872, P.aeruginosa được Schroeter mô tả lần đầu tiên với tên gọi là

Bacterium aeruginosa [8]

Ngay từ trước khi phân lập, đã có nhiều nhận xét cho rằng trong một số

trường hợp vết thương sinh ra một loại mủ đặc biệt có màu xanh như màu rỉ đồng

Hiện tượng này được giải thích theo nhiều ý kiến khác nhau, nhưng lời giải thích

thỏa đáng khi người ta phân lập được vi khuẩn từ ổ mủ thuần khiết

Năm 1882, nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu về Bacterium aeruginosa đó là

dược sĩ Carle Gessard Ông phân lập vi khuẩn này trên mủ vết thương và kết quả

nghiên cứu đã tìm thấy đặc trưng của Bacterium aeruginosa là sinh sắc tố có màu xanh,

tan trong nước Từ đó người ta còn gọi vi khuẩn này là trực khuẩn mủ xanh [32]

Năm 1900, Migula đã nghiên cứu và phân loại vi khuẩn này vào chi

Pseudomonas; từ đó vi khuẩn này mang tên P.aeruginosa [8]

Năm 2000, một nhóm các nhà khoa học đại học Washington và khoa sinh

của trường đại học California, San Diego đã nghiên cứu và giải được trình tự

genome của P.aeruginosa PA01 [33]

Năm năm sau đó, trình tự genome của PA14 cũng đã được tìm ra bởi các nhà

khoa học thuộc trường Đại học Y Harvard [33]

Trong những năm gần đây, P.aeruginosa là một trong những căn nguyên gây

bệnh rất phổ biến và kháng lại hầu hết các kháng sinh đang dùng Vì vậy, nó thu hút rất

nhiều đề tài nghiên cứu của các nhà khoa học và các y bác sĩ trong cũng như ngoài nước

Nghiên cứu nhiễm khuẩn huyết bỏng do P.aeruginosa gây ra tại Viện Bỏng

Quốc gia (6/1996 - 12/1998) đã cho thấy P.aeruginosa là vi khuẩn gây nhiễm khuẩn

huyết bỏng hàng đầu (chiếm khoảng 66,7%) [10]

Năm 2002, Chu Anh Tuấn, Nguyễn Văn Huệ, Lê Đức Mẫn nghiên cứu căn

nguyên gây nhiễm khuẩn huyết và yếu tố bệnh lý liên quan tại Viện Bỏng Quốc Gia

đã cho thấy P.aeruginosa là căn nguyên gây nhiễm hàng đầu (74,3%) [24]

Năm 2003, theo kết quả giám sát của Bộ y tế về các vi khuẩn gây bệnh

thường gặp ở Việt Nam thì P.aeruginosa là vi khuẩn đứng đầu trong số các vi

Lê Thu Hồng, Hoàng Ngọc Hiện (bộ môn vi sinh - Học viện quân y) đã

nghiên cứu chế tạo huyết thanh kháng P.aeruginosa đa giá, tinh chế và đánh giá

hiệu quả điều trị tại chỗ của chế phẩm trên động vật và bệnh nhân bỏng [12]

Theo một nguồn tin mới đây, một loại vaccine đường uống có thể bảo vệ cơ

thể người kháng lại P.aeruginosa mang tên Pseudostat - 1 đã được công bố bởi các

nhà khoa học Anh và Úc vào tháng 6/2006 Đây là một loại vaccine sử dụng

P.aeruginosa tinh chế đã bất hoạt [26]

Ngoài ra, còn rất nhiều nghiên cứu khác ở trong nước và trên thế giới đánh giá tình trạng nhiễm trùng và mức độ kháng thuốc của loài vi khuẩn này

1.1.2 Đặc điểm sinh vật học của P.aeruginosa

1.1.2.1 Hình thái, cấu tạo

Là trực khuẩn gram âm, hình que, thẳng hoặc hơi cong nhưng không xoắn, hai đầu tròn, chiều dài 1 - 1,5μm, rộng 0,5 - 1μm, đứng một mình hay thành đôi hoặc kết hợp thành chuỗi ngắn Trực khuẩn mủ xanh không sinh bào tử, có khả năng di động nhờ một tiêm mao đơn cực [32]

Hình 1.1: P.aeruginosa soi trên kính hiển vi quang học

1.1.2.2 Cấu trúc tế bào

 Vỏ polysaccaride:

P aeruginosa tiết ra chất nhầy có cấu tạo là polysaccharide gồm nhiều tiểu

phần mannuronic acid và glucuronic acid hay còn được gọi là alginate Các dạng

alginate này kết hợp với nhau tạo thành dạng cấu trúc biofilm giúp bảo vệ che chở

vi khuẩn tồn tại được trong môi trường tự nhiên cũng như tránh được hệ miễn dịch của cơ thể vật chủ [34]

 Màng sinh chất:

Hầu hết các chủng P.aeruginosa có khả năng tổng hợp một loại protein trên

bề mặt màng sinh chất (pr F) Protein F vận chuyển có chọn lọc các chất qua lại màng trong giới hạn khoảng 500Da Vì vậy, nó làm giảm tính thấm của màng, ngăn

không cho các chất có hại đi vào bên trong tế bào giúp cho P.aeruginosa có khả

năng đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh [30]

 Tiên mao:

P.aeruginosa có một tiên mao duy nhất ở một cực, tiên mao giúp cho vi

khuẩn di động Về cấu tạo hoá học, tiên mao được cấu tạo bởi các protein gọi là

Flagellin Các Flagellin mang tính chất kháng nguyên gọi là kháng nguyên lông H

Vật chất di truyền của P.aeruginosa là một phân tử DNA trần, dạng vòng tồn tại

trong nguyên sinh chất Kích thước DNA từ 5,2 - 7 triệu cặp base chứa khoảng 65% là

(Guanine + Cytosine) Ngoài ra, P.aeruginosa cũng có chứa vật chất di truyền ngoài

nhân đó là các plasmid Các plasmid chứa các đoạn gen như TEM, OXA, PSE mã hóa sinh ra enzyme betalactamase làm phá huỷ vòng betalactam của chất kháng sinh dẫn

tới P.aeruginosa kháng lại với hầu hết các kháng sinh thuộc nhóm này Do vậy mà rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị nhiễm khuẩn do P.aeruginosa gây ra [35]

1.1.2.3 Phân bố

Trực khuẩn mủ xanh được tìm thấy ở rất nhiều nơi trong môi trường sống như: trong đất, nước, các bể bơi, hồ tắm nước nóng…nhưng phổ biến nhất là những nơi ẩm thấp Ở người, chúng có thể sống ở vùng da ẩm như nách, háng và một số ít sống trong ruột Ngoài ra, vi khuẩn này còn được phát hiện sống bám bên ngoài của thực vật, động vật, kể cả trong bệnh viện [28]

Ít khi có nhiễm trùng do P.aeruginosa ở người khỏe mạnh Chúng là căn

nguyên quan trọng nhất trong các nhiễm khuẩn ở bệnh nhân bị bệnh nặng như bệnh tăng bạch cầu, u xơ bàng quang và bệnh nhân có bỏng rộng Trong điều kiện ướt, nước và nếu thêm yếu tố giàu chất khoáng, giàu dinh dưỡng thì rất thuận lợi cho sự

tồn tại và phát triển của trực khuẩn P.aeruginosa (như dụng cụ làm ẩm oxy, ống

hút, lavabo rửa tay, nước lưu cữu…) Vi khuẩn chứa trong các hạt khí dung khi được hít vào cơ thể thì có thể tránh được những cơ chế bảo vệ bình thường của

đường hô hấp để gây ra nhiễm khuẩn Có nhiễm khuẩn do P.aeruginosa sinh trưởng

ngay trong các thuốc dùng cho điều trị Thậm chí vi khuẩn này tồn tại được ngay cả trong một số chất tẩy uế Bồn và các dụng cụ làm thông khí có thể ô nhiễm nặng và

là nguồn gây nhiễm ra môt trường Tuy nhiên, nguy cơ chính bị nhiễm khuẩn do

P.aeruginosa là từ sự phơi nhiễm, tiếp xúc của các bộ phận mẫn cảm với những

dụng cụ, phương tiện… ô nhiễm vi khuẩn này [6]

Ở bênh viện, trực khuẩn mủ xanh thường tìm thấy ở đầu các ống thông, máy khí dung, máy hô hấp nhân tạo, máy hút ẩm, bình chứa nước, thậm chí ở trong cả một số dung dịch sát khuẩn dùng để rửa vết thương

1.1.2.4 Đặc điểm nuôi cấy

Trực khuẩn mủ xanh hiếu khí, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường như thạch dinh dưỡng, thạch máu, canh thang nhưng thích hợp nhất là môi trường SS Nhiệt độ thích hợp từ 30 - 370

C, PH = 4,5 - 9,0; tối ưu là 370C, pH

từ 7,2 - 7,5 [1]

Trên môi trường lỏng làm đục đều, trên bề mặt có váng Trên môi trường đặc

có hai loại khuẩn lạc: Khuẩn lạc S (tròn đều mặt nhẵn, trung tâm hơi lồi) Khuẩn lạc

R (nhỏ, xù xì hoặc nhầy, lồi) (hình 1.2 phụ lục ảnh)

Tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố (hình 1.3 phụ lục ảnh) và chất thơm Trên môi trường nuôi cấy có pepton, nó có thể tiết ra các loại sắc tố sau:

+ Pyocyanin: Là loại sắc tố phenazin có màu xanh lơ, tan trong nước và

chlorofoc, khuyếch tán ra môi trường nuôi cấy làm cho môi trường và khuẩn lạc có màu xanh Sắc tố này sinh ra thuận lợi trong môi trường tiếp xúc nhiều với không

khí Chỉ có trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố pyocyanin Đây là một đặc điểm quan trọng để phân biệt P.aeruginosa với các vi khuẩn khác

+ Pyoverdin: Là loại sắc tố huỳnh quang, phát màu xanh khi chiếu tia cực

tím có bước sóng 400nm, tan trong nước nhưng không tan trong chlorofoc Ngoài

trực khuẩn mủ xanh chỉ có một số loài Psedomonas tạo sắc tố này

+ Pyorubrin: Sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% trực khuẩn mủ xanh sinh sắc tố này

+ Pyomelanin: Sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng trực khuẩn mủ xanh

sinh sắc tố Pyomelanin

Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh không sinh sắc tố

1.1.3 Một số tính chất sinh hóa cơ bản

- Hiếu khí tuyệt đối, oxidase (+), lên men đường glucoza, không lên men đường lactose, xitrat simmons (+), mannit (+), idol (-), H2S (-), LDC (-), ODC (-), ADH (-)

1.1.4 Sức đề kháng

Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao với nhiều yếu tố ở ngoại cảnh, chúng có thể tồn tại được ngay cả trong một số chất tẩy uế Trong số các vi khuẩn, Trực khuẩn mủ xanh có sức kháng lại mạnh nhất với các thuốc kháng sinh Mức độ kháng thuốc này là do cấu trúc các lỗ porin của màng ngoài làm hạn chế các thuốc kháng sinh đi vào khoảng trống của màng bào tương hơn so với những vi khuẩn

Gram âm khác[6]

1.1.5 Cấu trúc kháng nguyên

Vi khuẩn có kháng nguyên H và kháng nguyên O chịu nhiệt

- Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của vi khuẩn Kháng nguyên có đặc điểm: Không chịu được nhiệt, bị cồn 50% và các men tiêu protein phá hủy, chịu được tác động của focmol 0,5%

- Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân, đã có đến 16 loại do đó dựa vào

kháng nguyên O để phân chia P.aeruginosa thành 16 typ huyết thanh ký hiệu từ P1

đến P16 Kháng nguyên O có đặc điểm: Chịu được nhiệt, rất độc, kháng cồn,

bị phá hủy bởi focmon 0,5%

1.1.6 Độc tố

Trong quá trình xâm nhập và gây bệnh P.aeruginosa tiết ra một số ngoại độc

tố sau: [31]

+ Exoenzyme S: Chủ yếu được sinh ra khi vi khuẩn có mặt trong những mô

bỏng, độc tố này tác động lên tế bào bạch cầu trung tính và gây độc cho tế bào vật chủ

+ Exotoxin A: Phần lớn P.aeruginosa sinh ra độc tố này, độc tố A không bền

nhiệt, chúng có vai trò làm kìm hãm sự tổng hợp protein và gây chết tế bào

- Heamolysin: P.aeruginosa sinh ra 2 heamolysins đó là phospholipit C và

rhamnolipit, chúng có vai trò phân hủy lecithin và lipit tạo ra các lỗ thủng trên

màng tế bào làm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn vào trong tế bào vật chủ

Ngoài ra, Paeruginosa tiết ra một số enzym ngoại bào có vai trò trong tính

độc của vi khuẩn trong quá trình xâm nhiễm là Elastase và Alkaline protease Các

protein enzyme này phá hủy các phân tử protein của vật chủ một cách đặc hiệu gây

nên những đặc tính lâm sàng riêng của bệnh

+ Các elastase (LasB elastase, LasA elastase): Phân cắt các protein của tế

bào nhân chuẩn như collagen, elatin và hủy hoại cấu trúc protein của các tế bào này

Đồng thời nó cũng phá vỡ hệ thống miễn dịch đặc hiệu của cơ thể (IgG, IgA, bổ

thể), các phân tử ngoại bào làm cho nhiễm trùng lan tỏa đến các khu vực xa hơn với

các biểu hiện lâm sàng như viêm màng keratin, hoại tử tổ chức trong bỏng và tạo

các xơ nang Ngoài ra, Elastase còn dung giải fibronectin giúp cho vi khuẩn dễ

dàng bám vào màng nhầy phổi Elastase phá vỡ biểu mô và cản trở chức năng của

các lông mao bên trong đường hô hấp [29]

+ Alkalinne protease: Can thiệp vào sự hình thành fibrin và phân giải fibrin

Đồng thời, elastase và alkaline protease phân hủy chất nền của giác mạc và những

cấu trúc bảo vệ khác cấu tạo nên fibrin và elastin Hai enzym này cũng được cho

rằng gây ra sự bất hoạt đối với hai yếu tố quan trọng của hệ miễn dịch là interferon

gamma (IFN) và TNF (Tumor Necrosis Factor) [32]

1.1.7 Khả năng gây bệnh của P.aeruginosa

Mặc dù P.aeruginosa là vi khuẩn gây bệnh cơ hội nhưng nó là vi khuẩn có

độc lực đặc biệt Khi tuyến phòng thủ đầu tiên (hàng rào bảo vệ không đặc hiệu ở

da, niêm mạc) bị phá vỡ (như khi bị vết thương) hoặc vi khuẩn được đưa vào cơ thể tắt qua hàng rào này (như theo dụng cụ nội soi hoặc ống thông khí quản…) thì gây

ra nhiễm khuẩn Đầu tiên vi khuẩn bám dính vào bề mặt tế bào biểu mô và giai đoạn

này cần đến vai trò của pili và polisaccharide ngoại bào Các chủng nhầy phân lập

từ bệnh nhân bị xơ phế nang tạo ra các polisaccharide chứa nhiều vi khuẩn làm tăng

sự kết dính của vi khuẩn với biểu mô đường hô hấp và giúp chúng kháng lại thực

bào Sau khi xâm nhập, sự bảo vệ dựa vào thực bào và vỏ nhầy do polisaccharide

có đủ khả năng và đủ thời gian để sản xuất collagenase, elastase, pyocyanin và các

sản phẩm khác để làm lan truyền và phá hủy tổ chức cục bộ Ngoại độc tố A có thể

là nhân tố góp phần quan trọng gây tổn thương tổ chức và tác dụng làm lan tỏa

nhiễm khuẩn Nghiên cứu in vitro gần đây đã cho thấy sắc tố pyocyanin ức chế sự sản sinh superoxide của bạch cầu đa nhân Có thể các nhân tố này rất quan trọng

làm thuận lợi cho việc hình thành, lan tỏa và kéo dài nhiễm khuẩn.[6]

Nhiễm trùng thường xảy ra ở những người mà cơ chế bảo vệ bị tổn thương như sử dụng corticoit hay kháng sinh dài ngày, bỏng nặng hoặc tiêm tĩnh mạch ma túy…Vị trí nhiễm trùng thông thường là đường tiểu và vết thương hở (nhất là vết bỏng) Tại chỗ xâm nhiễm chúng gây viêm có mủ màu xanh, ở những cơ thể suy giảm sức đề kháng chúng có thể xâm nhập vào sâu hơn bên trong cơ thể và gây viêm ở các phủ tạng như các nhiễm trùng nung mủ và những áp xe ở những phần khác nhau của cơ thể người Những trường hợp viêm màng trong tim, viêm phổi, viêm màng não tuy hiếm nhưng cũng xảy ra hoặc gây bệnh toàn thân như nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn ở trẻ mới sinh thường gây bệnh rất trầm trọng Nhiễm khuẩn huyết thường gây chết ở những cơ thể suy nhược [29]

P.aeruginosa là tác nhân gây viêm tai ngoài, thường là những người hay đi

bơi Loài vi khuẩn này có thể xâm nhập vào mắt (qua chấn thương hoặc do đưa thuốc bị nhiễm khuẩn vào) gây viêm màng kết mạc mắt, viêm giác mạc mắt hoặc

viêm nội nhãn cầu Viêm giác mạc có khi tiến triển nhanh và làm tổn thương giác

mạc sau 24 - 48 giờ[6] Ngoài ra P.aeruginosa còn là tác nhân chính gây nhiễm

trùng bệnh viện như nhiễm trùng sau mổ, bỏng nặng…

1.2 Kháng sinh

1.2.1 Khái niệm

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất

enzyme, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật), với đặc

tính là ngay ở nồng độ thấp hoặc rất thấp đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu

diệt được các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người và động vật

được điều trị [9]

1.2.2 Hiện tượng và bản chất kháng thuốc của vi sinh vật

Hiệu quả điều trị của chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào độ nhảy cảm

của vi sinh vật gây bệnh với chất kháng sinh Khi điều trị kháng sinh, mầm bệnh

bao giờ cũng có những “đáp ứng phản hồi lại” sự có mặt của chất kháng sinh trong

môi trường và kết quả là sẽ có hai khả năng xảy ra:

+ Vi sinh vật sẽ bị chết do kháng sinh

+ Vi sinh vật vẫn sống sót

Vi khuẩn được coi là kháng một loại kháng sinh nào đó nếu sự phát triển của

nó không bị ngừng lại khi kháng sinh đó đã được dùng ở nồng độ tối đa mà bệnh

nhân còn dung nạp thuốc [22]

Các kiểu kháng thuốc của vi sinh vật:

 Đề kháng tự nhiên:

Đề kháng tự nhiên là khả năng đã được hình thành ở mầm bệnh ngay khi

chúng chưa tiếp xúc với môi trường có kháng sinh

Nguyên nhân: Có thể do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể làm cho

quần thể vi sinh vật gây bệnh xuất hiện các chủng có khả năng kháng thuốc Khi

bệnh nhân được điều trị trong thời gian nhất định thì chỉ có các chủng bình thường

bị tiêu diệt, còn những chủng kháng thuốc sẽ sống sót, tiếp tục sinh trưởng, phát

triển Cuối cùng làm thay đổi hoàn toàn bản chất vi sinh của bệnh và vô hiệu hóa tác

dung điều trị của kháng sinh đó

* Đột biến gen: Biến cố này xảy ra trước hoặc sau khi vi khuẩn tiếp xúc với

kháng sinh

+ Đột biến một bước: mức độ đề kháng không phụ thuộc vào nồng độ kháng sinh được tiếp xúc; có thể chỉ sau một lần đột biến, vi khuẩn đã đề kháng rất cao Đột biến kháng streptomycin, lincomycin và isoniazid là những đột biến kiểu một bước

+ Đột biến nhiều bước: mức độ đề kháng có liên quan tới nồng độ kháng sinh Trong trường hợp này kháng sinh là nhân tố chọn lọc giữ lại những cá thể đột biến, cho nên ở lần đột biến sau thì nồng độ ức chế tối thiểu sẽ cao hơn lần trước Đột biến kháng penicillin, cephalosporin, tetracycline, chloramphenicol, aminoglycoside, sulfamide và colistin là những đột biến kiểu nhiều bước

Gen đề kháng xuất hiện do đột biến sẽ được lan truyền từ thế hệ này sang thế

hệ khác cùng với sự phân chia của tế bào vi khuẩn Xác suất xuất hiện một đột biến rất nhỏ (10-6 - 10-11)

* Nhận gen kháng thuốc:

Gen kháng thuốc có thể nằm trên nhiễm sắc thể, trên plasmid hay trên transposon

- Plasmid là những phân tử DNA xoắn kép dạng vòng khép kín, nằm ngoài nhiễm sắc thể vi khuẩn, có khả năng tự sao chép, chúng mang các gen quyết định cho sự xuất hiện một số tính chất mới của vi khuẩn Plasmid kháng thuốc (R-plasmid) là plasmid mang một hoặc nhiều gen mã hoá cho sự đề kháng với một hoặc nhiều kháng sinh khác nhau Vi khuẩn mang R-plasmid có thể cùng một lúc kháng lại nhiều thuốc kháng sinh khác nhau (do mang nhiều gen kháng thuốc) Các R-plasmid không chỉ có khả năng lan truyền dọc từ thế hệ trước sang thế hệ sau qua

sự phân chia của tế bào vi khuẩn, mà chúng còn có khả năng lan truyền ngang giữa các vi khuẩn cùng loài hay khác loài qua sự tiếp hợp

- Transposon (“gen nhảy”): là những đoạn DNA chứa một hoặc nhiều gen,

có thể “nhảy”từ plasmid vào nhiễm sắc thể và ngược lại hoặc từ plasmid này sang

plasmid khác

 Đề kháng chéo:

Kháng chéo là hiện tượng một chủng vi sinh vật có khả năng kháng lại chất kháng sinh nhất định thì cũng có khả năng kháng luôn một số chất kháng sinh khác cùng nhóm cấu trúc hay có đặc tính tương đồng với chất kháng sinh ấy

Nguyên nhân: Do cấu trúc hóa học của những kháng sinh đó tương tự nhau

và do chủng vi sinh vật đó có khả năng tiết ra độc tố làm mất tác dụng của một số kháng sinh

Đường truyền tính kháng thuốc ở vi khuẩn

Gen kháng thuốc có thể lan truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua các hình thức sau:

+ Phân bào: gen kháng thuốc được vi khuẩn truyền lại cho thế hệ sau qua sự

phân chia của tế bào vi khuẩn

+ Tiếp hợp: là hiện tượng hai vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với nhau và truyền

cho nhau đoạn DNA có mang gen đề kháng

+ Biến nạp: là hiện tượng xảy ra khi vi khuẩn đề kháng bị li giải, giải phóng

các đoạn DNA tự do và những đoạn này xâm nhập vào các tế bào vi khuẩn khác

+ Tải nạp: là hiện tượng phage mang gen đề kháng từ vi khuẩn này sang nạp

vào tế bào vi khuẩn khác

1.2.3 Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi khuẩn

 Ức chế tổng hợp thành tế bào: Kháng sinh ức chế thành tế bào thực chất là

ức chế một bước nào đó của tổng hợp peptidoglycan của vi khuẩn Khi mất thành phần peptidoglycan cứng xung quanh tế bào vi khuẩn, tế bào thường bị chết do trương nước, sưng lên hoặc bị nổ và khi không có thành tế bào chúng cũng dễ bị các

tế bào thực bào tiêu diệt

 Gây rối loạn chức năng thẩm thấu chọn lọc của màng nguyên tương: Làm cho các thành phần cần thiết bên trong tế bào thoát ra ngoài và nước đi vào trong khiến tế bào bị vỡ

 Ức chế tổng hợp protein: Bằng cách gắn vào ribosom 70S của vi khuẩn Kháng sinh gắn vào tiểu phần 30S (như Steptomycin) sẽ ngăn cản hoạt động của ARN thông tin hoặc ức chế chức năng của ARN vận chuyển (như Tetracyclin) Kháng sinh gắn vào tiểu phần 50S (như Erythromycin, chloramphenicol), làm cản trở sự liên kết, hình thành các chuỗi acid amin tạo phân tử protein cần thiết cho tế bào sống

 Ức chế sinh tổng hợp acid nucleic: Ngăn cản sự sao chép DNA (nhóm Quinon), ức chế sao mã RNA (Rifampicin) hay ức chế sinh tổng hợp các chất chuyển hóa cần thiết để ngăn cản hình thành nên các nucleotid như Sunfamid và Trimethorpim

1.2.4 Biện pháp hạn chế sự kháng thuốc

Để khắc phục hiện tượng kháng thuốc kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh, giải pháp trực quan và đơn giản là sử dụng các kháng sinh mới Tuy nhiên, việc tìm kiếm, phát hiện và sản xuất ra một kháng sinh mới là cả một khối lượng công việc khổng lồ, tiêu tốn nhiều thời gian, nhân lực và tiền bạc Đồng thời, để sự kháng thuốc xảy ra cũng đồng nghĩa với việc phải trả giá bằng sức khoẻ, tính mạng của bệnh nhân Chính vì vậy, mọi nỗ lực nhằm hạn chế xuất hiện khả năng kháng thuốc càng trở nên cần thiết và hiệu quả mà trước hết cần tôn trọng các nguyên tắc sau khi

 Dùng kháng sinh đủ liều lượng và thời gian (cho một đợt điều trị)

 Đề cao các biện pháp khử trùng và tiệt trùng, ngăn ngừa sự lan truyền vi khuẩn đề kháng

 Liên tục giám sát sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn để có chiến lược sử dụng kháng sinh hợp lý [27]

1.3 Phân loại vi sinh vật

1.3.1 Khái quát về các phương pháp phân loại vi sinh vật truyền thống

Trước đây công tác phân loại vi sinh vật vẫn dựa căn bản trên các đặc tính hình thái, sinh lý và hóa vi sinh vật: nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường cũng như sắc tố tạo thành v.v Các đặc trưng này đôi khi cũng bộc lộ những hạn chế do các đặc tính

được dùng cho nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý

nghĩa đối với nhóm khác (vi khuẩn gram âm - gram negative bacteria) Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số vi sinh vật Từ trước đến nay, đơn vị cơ bản của định tên vi sinh vật là loài, bao gồm nhóm các cơ thể có mức độ tương đồng cao về các đặc điểm hình thái

Các phương pháp dựa trên các phản ứng sinh hóa:

Từ những hạn chế của việc xác định các đặc tính hình thái dẫn đến nhiều nghiên cứu tập trung vào các phản ứng sinh hóa đặc trưng cho các vi sinh vật riêng biệt Sự khác biệt của các phản ứng có ý nghĩa cho phân loại các vi sinh vật

- API20E KIT

Nguyên tắc: Dựa vào 20 phản ứng khác nhau Nói chung hiện nay có nhiều nơi vẫn dùng kỹ thuật này nhưng nhìn chung kết quả cũng còn nhiều sai số do nhiều nguyên nhân khác nhau: cụ thể trong các trường hợp gen quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay thay đổi trong quá trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả

Phân biệt bằng thực khuẩn thể

Các vi khuẩn có độ mẫn cảm với thực khuẩn thể khác nhau Có thực khuẩn thể xâm nhiễm làm tan tế bào ngay lập tức để sau đó thực khuẩn thể nhân lên thành các hạt trong tế bào chủ, trong khi đó với một số vi khuẩn thì thực khuẩn thể xâm nhiễm nhưng lại không làm tan tế bào vi khuẩn và chúng cùng tồn tại với tế bào vật chủ Dựa vào sự khác biệt này mà người ta dùng các thực khuẩn thể khác nhau để phân biệt các đối tượng vi khuẩn nghiên cứu

Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ một số nhược điểm khó giải quyết

là các đặc tính mẫn cảm của vi khuẩn với thực khuẩn thể lại thay đổi do điều kiện ngoại cảnh hoặc là vi khuẩn lại có mức độ mẫn cảm khác nhau đối với các thực khuẩn thể khác nhau Mặt khác nữa, thực khuẩn thể rất dễ thay đổi các đặc tính do

đó cũng làm thay đổi cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ

- Phân biệt theo Typ huyết thanh

Đây là phương pháp được dùng khá lâu nhưng rất hiệu quả và hiện vẫn đang được sử dụng (ví dụ nhóm vi khuẩn Bt) Nguyên tắc là dựa vào nhóm quyết định kháng nguyên trên tế bào vi sinh vật (bề mặt tế bào tiên mao hoặc protein vỏ) Ưu thế của phương pháp này là các kháng huyết thanh được dùng để biệt hóa nhiều chi khác nhau, trong nhiều trường hợp đặc trưng cho loài Nói chung đây là phương pháp khá ổn định nhưng hạn chế chủ yếu của phương pháp này ở chỗ: yêu cầu kỹ thuật sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng kháng huyết thanh không đồng nhất tại các phòng thí nghiệm và tính ổn định giữa các lần lặp lại [13]

1.3.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới có độ chuẩn xác cao Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức

độ phân tử và quan hệ giữa các loài trong phạm vi loài

Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay

Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng Gen

mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vùa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen Và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài Đây là thuận lợi lớn chi các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA, [18][16]

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu: Các chủng P.aeruginosa phân lập được từ các

bệnh phẩm và môi trường bệnh viện

* Địa điểm nghiên cứu: Bệnh viện Đa Khoa Trung Ương Thái Nguyên 2.2 Vật liệu

2.2.1 Các mẫu nghiên cứu

- Các mẫu bệnh phẩm:

+ Mủ vết thương: 200 mẫu

+ Dịch mũi họng: 100 mẫu

+ Nước tiểu: 100 mẫu

- Các mẫu lấy từ môi trường bệnh viện:

+ Nước: 100 mẫu, lấy từ các nguồn nước đang sử dụng trong bệnh viện (nước rửa tay của bác sĩ, nước từ phòng mổ…)

+ Không khí: 100 mẫu, lấy từ các phòng mổ, phòng đẻ, phòng gây mê hồi sức cấp cứu…

+ Trên bề mặt các dụng cụ y tế đang được sử dụng tại các phòng khám và xét nghiệm trong bệnh viện: 200 mẫu

- Máy đặt khoanh giấy kháng sinh: Thụy Điển

- Box cấy vô trùng: Nhật

- Nồi hấp tiệt trùng: Hàn Quốc

- Thước đo vòng ức chế: Nhật Bản

Ngoài ra các dụng cụ vô khuẩn cần thiết cho việc lấy mẫu và nuôi cấy gồm:

- Dụng cụ lấy mẫu: Ống đựng bệnh phẩm, xi lanh, lọ thuỷ tinh có nút mài vô khuẩn

- Dụng cụ nuôi cấy: Đĩa petri, pipet, ống nghiệm, lam kính, la men, đèn cồn, que cấy, khay men hoặc sắt không rỉ, giá để ống nghiệm…

950.Thuốc thử kowaca (thử tính chất sinh indol)

- Thuốc thử phản ứng VP: Dung dịch A: α naphton 6% trong cồn 900, để tủ lạnh trước khi dùng Dung dịch B: NaOH 16% trong nước

- Nước muối NaCl 9‰

- Các hóa chất và thiết bị, máy móc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về Công nghệ gen - Viện Công nghệ Sinh học

Các khoanh giấy kháng sinh

- Các khoanh giấy kháng sinh được sử dụng của hãng Bio - Rad (Pháp) bao gồm:

Ampicillin (AM), Piperacine (PIP), Cefalexine (CN), Cefotaxime (CTX), Cephalothin (CF), Cefazoline (CZ), Ceftazidime (CAZ), Ceftriaxone (CRO), Gentamycine (GM), Amikacine (AN), Netromycine (NET), Tobramycine (TM), Co- trimoxazol (SXT), Ciprofloxacine (CIP), Norfloxacin (NOR), Pefloxacine (PEF),

Doxycylin (DO), Chloramphenicol (C), Rifamycine (RA), Nitrofurantoin (FT)

2.2.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa và làm kháng sinh đồ

Thành phần và cách pha chế các môi trường được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Môi trường nuôi cấy, phân lập, xác định tính chất sinh hóa

và làm kháng sinh đồ Môi trường Thành phần Số

lượng Cách pha chế

Thạch

thường

Cao thịt Pepton Bột NaCl tinh khiết Thạch sợi

Nước cất

5g 10g 5g 20g 1000ml

Cân đong đầy đủ các thành phần môi trường cho vào nồi nhôm, đun nóng cho tan Điều chỉnh pH (7,4 - 7,6) bằng NaOH 20% Hấp ở 1200C

trong 15 phút Đổ môi trường ra các

Đun nóng chảy 250 ml thạch thường đựng trong bình cầu, để nguội khoảng 550C - 660C Cho 15

ml máu thỏ vào bình thạch Lấy tay lắc xoay tròn cho máu tan đều Đổ

môi trường vào đĩa Petri

Chocolate

Thạch thường Máu thỏ đã loại tơ huyết

250ml 15ml

Làm như thạch máu rồi đun cách thuỷ 800C trong 10 phút Chú ý phải lắc đều bình thạch Để nguội 45 -

50oC đổ ra đĩa

Xitrat

simmon

NaCl Nước cất vừa đủ Natri xitrat (NH4)HPO4 Magie sunfat, K2HPO4 Thạch

Dung dịch xanh brommothymol 1,5%

trong cồn 900

5g 1000ml 2g 1g 0,2g 1g 20g 10ml

Đun sôi tất cả các thành phần môi trường cho đến khi tan hoàn toàn Điều chỉnh pH: 7,2 Thêm dung dịch xanh brommothymol, môi trường sẽ

có màu xanh lá cây Đổ môi trường

ra các ống nghiệm, hấp ở 1100C trong 30 phút sau đó đem ra để nghiêng cho môi trường đông lại

Thạch

mềm

Pepton Cao thịt Muối tinh khiết Cao men Thạch

10g 3g 5g 6g 6g

Đun sôi cho tan hoàn toàn các chất Điều chỉnh pH = 7,6 Hấp ở 1100

C trong 30 phút Đổ ra các ống nghiệm 12mm mỗi ống khoảng 3ml

Môi trường Thành phần Số

lượng Cách pha chế

Kligler

Cao thịt Cao men Pepton NaCl tinh khiết Lactoza

Glucoza Natri thyosulfat Feric xitrat Thạch Nước cất

3g 3g 20g 5g 10g 1000ml 0,5g 0,5g 12g 1000ml

Cho thạch vào nước, đun sôi cho

đến khi tan hoàn toàn Thêm các hoá chất còn lại vào để hoà tan Điều chỉnh pH: 7,4 Cho 6ml dung

dịch đỏ phenol 0,5%, khuấy đều rồi phân phối vào các ống nghiệm

12nm mỗi ống khoảng 3ml Hấp

1100C trong 30 phút, đem ra để ống môi trường nằm nghiêng, sao cho mặt nghiêng và mặt đứng dài khoảng 2 - 2,5cm

Mannitol

di động

Pepton Thạch Manitol Kalinitrat Dung dịch đỏ phenol 1%

trong nước

20g 4g 10g 1g

4 ml

Đun sôi, khuấy đều để hoà tan hoàn toàn các hoá chất Điều chỉnh pH: 7,6 Thêm dung dịch đỏ phenol, phân phối môi trường ra các ống nghiệm Hấp 1100C trong 30 phút

Clarklubs

Pepton Bipotasic photphat (K2HPO4) Glucoza

Nước cất

5g 5g

5g 1000ml

Đun sôi để hoà tan các hoá chất Điều chỉnh pH 7,5; lọc trong Phân phối vào các ống nghiệm Hấp ở

1100C trong 30 phút

Urê indol

L.Tryptophan Natri clorua

Photphat dipotasic Urê

Nước cất Dung dịch đỏ phenol trong cồn

3g 5g 1g 20g 1000ml 2ml

Đun nóng 50 - 600C để hoà tan các

chất Điều chỉnh pH 7,2 Phân phối

vào các ống nghiệm mỗi ống 1 -

2ml Hấp ở 1100C trong 30 phút

Muller -

Hinton

Muller - Hinton Nước cất

pH 7,0 - 7,2

15g 0,3l

Đun cách thủy môi trường cho tan

thạch Hấp ở 1210C trong 15 phút

Để nguội 450

C - 500C, đổ ra đĩa

Petri (độ dày môi trường ± 4mm)

trong box vô trùng

2.3 Phương pháp và kỹ thuật nghiên cứu

Tiến hành lấy mẫu từ môi trường bệnh viện (nước, dụng cụ y tế, không khí…), từ bệnh nhân (dịch khí phế quản, mủ vết thương…) nuôi cấy, phân lập, xác

định tỷ lệ nhiễm trùng P.aeruginosa trên bệnh nhân và tỷ lệ ô nhiễm P.aeruginosa ở

môi trường bệnh viện Làm kháng sinh đồ để đánh giá mức độ kháng kháng sinh

2.3.1 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu mô tả

2.3.2 Các kỹ thuật nghiên cứu

- Nuôi cấy, phân lập, định danh vi khuẩn theo quy trình của Bộ y tế

- Xác định tính nhạy cảm kháng sinh của vi khuẩn theo KIRBY - BAUR

- Quan sát, mô tả, phân tích các chỉ số nghiên cứu

- Phân nhóm Trực khuẩn mủ xanh dựa vào typ kháng huyết thanh

- Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA

- Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê sinh học

2.3.2.1 Kỹ thuật lấy bệnh phẩm

Tùy vào từng loại bệnh phẩm mà ta có kỹ thuật lấy khác nhau:

+ Bệnh phẩm mủ: Dùng tăm bông vô trùng lấy bệnh phẩm tại nơi ranh giới tiếp giáp tổ chức vết thương với tổ chức lành, lấy mủ mới

+ Bệnh phẩm dịch mũi họng: Đặt bệnh nhân ngồi (2 tay đặt lên đùi, mặt ngửa một góc 30o) Cầm tăm bông vô trùng đưa vào mũi của bệnh nhân đến vùng tỵ

hầu, xoay nhẹ, lấy ra Làm tương tự với lỗ mũi bên kia

+ Bệnh phẩm nước tiểu: Dùng sonde vô trùng đưa vào đường tiết niệu của bệnh nhân hoặc có thể lấy trực tiếp bằng cách bỏ nước tiểu đầu, lấy nước tiểu giữa dòng cho vào ống vô trùng

Đối với mẫu lấy từ môi trường:

- Mẫu nước: (lấy mẫu nước máy chưa sử dụng): Lấy vào lọ thuỷ tinh nút mài

vô khuẩn, trước khi lấy mẫu phải đốt vòi bằng ngọn lửa đèn cồn, vặn cho vòi nước chảy 3 - 5 phút Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy nút ngay

2.3.2.2 Kỹ thuật phân lập

Nhuộm soi sơ bộ

Sau khi lấy được bệnh phẩm, đem nhuộm soi để quan sát hình thể, tính chất bắt màu, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn Thông qua kết quả nhuộm soi sơ

bộ có thể định hướng cho việc nuôi cấy

Phương pháp nhuộm: Sử dụng kỹ thuật nhuộm Gram

+ Soi dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu với độ phóng đại 100 + Nhận định kết quả:

 Cầu khuẩn Gram dương bắt màu tím

 Trực khuẩn Gram âm bắt màu đỏ, hình que

Kỹ thuật nuôi cấy

- Sau khi lấy bệnh phẩm, tùy theo từng loại bệnh phẩm mà tiến hành nuôi cấy trên các môi trường thích hợp Tất cả các kỹ thuật nuôi cấy phải được thực hiện trong box cấy vô trùng

+ Bệnh phẩm là nước tiểu, mủ, mẫu nước, mẫu lấy từ mặt phẳng các dụng cụ

y tế: Nuôi cấy trên môi trường thạch máu

+ Bệnh phẩm là dịch mũi họng: Nuôi cấy trên môi trường thạch máu và thạch chocolate sau đó để tủ ấm CO2 (5 - 7%)

* Tiến hành nuôi cấy:

- Đối với bệnh phẩm mủ, dịch mũi họng, mẫu lấy từ mặt phẳng các dụng cụ

y tế ta có quy trình nuôi cấy như sau:

+ Đánh dấu bệnh phẩm và số mẫu vào mặt sau hộp thạch những thông tin trùng khớp nhau

+ Tay trái cầm đĩa môi trường, khử khuẩn nơi định mở trên ngọn lửa đèn cồn, dùng ngón cái và ngón giữa tay trái đẩy nắp hộp lồng lên

+ Tay phải cầm que cấy lấy một một quai bệnh phẩm, ria cấy trên bề mặt môi trường theo kỹ thuật cấy 3 vùng

+ Đậy nắp hộp lồng, khử trùng que cấy

+ Nuôi cấy trong tủ ấm trong 18 - 24 giờ, nhiệt độ 370C

- Đối với bệnh phẩm nước tiểu, trước khi nuôi cấy phải tiến hành pha loãng

100 lần trong nước muối sinh lý, cách làm như sau:

+ Lấy pipet vạch chuẩn hút ra 0,5ml nước tiểu cho vào ống nghiệm 1 (chứa 4,5ml nước muối sinh lý) tạo thành nước tiểu pha loãng 10-1

, tiếp tục dùng pipet hút

ra 0,5ml dung dịch ở ống nghiệm 1 vừa pha cho vào ống nghiệm 2 (chứa 4,5ml nước muối sinh lý) sẽ thu được nước tiểu pha loãng 10-2

- Cách cấy nước tiểu:

+ Lấy pipet Pasteur hơ trên ngọn lửa đèn cồn, bẻ cong đầu que cấy tạo thành góc 900C

+ Dùng pipet vạch chuẩn lấy ra một giọt bệnh phẩm đã pha loãng 10-2 cho vào môi trường nuôi cấy

+ Dùng phần đầu của pipet Pasteur, dàn bệnh phẩm trên bề mặt môi trường + Nuôi cấy trong tủ ấm 370C từ 18 - 24 giờ

- Cách cấy mẫu nước:

+ Nhỏ một giọt nước vào môi trường nuôi cấy

+ Dùng tăm bông vô trùng dàn đều trên bề mặt môi trường

+ Nuôi cấy trong tủ ấm 370C trong 18 - 24 giờ

Kỹ thuật cấy chuyển

Bệnh phẩm sau khi nuôi cấy ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, dựa vào đặc

điểm hình thái khuẩn lạc của P.aeruginosa, ta chọn những khuẩn lạc có dạng R,

mùi thơm để cấy chuyển sang môi trường thạch thường nhằm mục đích thuần khiết

vi khuẩn Cách cấy chuyển như sau:

+ Dùng que cấy lấy một khuẩn lạc nghi ngờ, ria cấy trên môi trường thạch thường

+ Nuôi cấy trong tủ ấm 370C trong 18 - 24 giờ

Sau khi khuẩn lạc đã được thuần nhất trên môi trường thạch thường ta đem nhuộm vi khuẩn theo kỹ thuật nhuộm Gram nhằm kiểm tra hình thể và so sánh với kết quả khi nhuộm soi sơ bộ, tiếp tục tiến hành xác định tính chất hóa sinh của vi khuẩn này

Kỹ thuật xác định tính chất hóa sinh của P.aeruginosa

- Bộ kít chạy tính chất sinh vật hoá học của P.aeruginosa bao gồm có 10 ống

chứa các loại môi trường (hình 2.1 phụ lục ảnh):

+ Ống 6 và 7: Môi trường Clarklubs + Ống 8: Môi trường LDC

* Cách thử phản ứng oxidase:

+ Nhỏ vài giọt thuốc thử lên miếng giấy lọc, dùng que cấy gỗ hoặc tre lấy khuẩn lạc và miết lên vùng giấy lọc vừa nhỏ thuốc thử Kết quả oxidase dương tính nếu vùng phết vi khuẩn chuyển màu tím sẫm trên giấy lọc sau vài giây, nếu không

có hiện tượng là phản ứng âm tính

* Cách cấy vi khuẩn vào các ống:

- Đối với ống 1 và 2 chứa môi trường thạch nghiêng ta có cách cấy như sau: + Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc trong đĩa thạch cho vào ống thạch nghiêng, kéo từ đáy ống lên phần trên của mặt thạch nghiêng, vừa kéo vừa đưa que cấy sang ngang theo những vạch chữ chi và tránh ria sát vào thành ống Ở ống 2, phần thạch đứng ta dùng que cấy lấy khuẩn lạc chọc thẳng xuống rồi rút que cấy lên sau đó ria cấy trên bề mặt môi trường thạch nghiêng

- Đối với ống nghiệm chứa môi trường Mannitol:

+ Dùng que cấy lấy khuẩn lạc, sau đó chọc sâu xuống môi trường rồi rút thẳng que cấy lên

Riêng với ống nghiệm có chứa môi trường thạch mềm, ta dùng que cấy lấy khuẩn lạc rồi cấy vào môi trường theo phương pháp chọc sâu

- Các ống nghiệm khác đều có môi trường lỏng, cách cấy vi khuẩn cũng tương

tự như trên Nhưng đến khi que cấy chạm vào môi trường thì để vi khuẩn ở thành ống, dùng que cấy hoà tan rồi lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn hoà tan vào môi trường

- Tất cả các ống nghiệm để trong tủ ấm từ 18 - 24 giờ sau đó đọc tính chất hoá sinh

* Đọc kết quả tính chất hoá sinh (hình 2.2 phụ lục ảnh):

- Ống 1: Môi trường chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển là phản ứng dương tính (vi khuẩn có khả năng chuyển hoá Xitrat) Môi trường vẫn giữ nguyên màu là phản ứng âm tính (vi khuẩn không có khả năng chuyển hoá Xitrat)

- Ống 2: Nếu ở phần thạch đứng chuyển màu vàng là vi khuẩn lên men đường glucoza Nếu ở phần thạch nghiêng chuyển màu vàng là vi khuẩn lên men đường lactoza Nếu cả phần thạch đứng và thạch nghiêng đều chuyển sang màu vàng chứng tỏ vi khuẩn lên men cả hai loại đường nói trên Trong môi trường ở phần chân thạch thấy có màu đen là vi khuẩn đã sinh ra H2S; nếu còn thấy có xuất hiện những khoảng trống nhỏ đẩy thạch lên, kết luận vi khuẩn đã sinh hơi

- Ống 3: Nếu vi khuẩn chuyển sang màu vàng là vi khuẩn đã lên men đường Mannit Nếu môi trường không đổi màu là phản ứng âm tính

- Ống 4: Nếu vi khuẩn mọc lan xung quanh đường cấy, có thể làm đục môi trường thì chứng tỏ vi khuẩn có tính chất di động Nếu vi khuẩn không mọc lan xung quanh đường cấy thì kết luận vi khuẩn không có tính chất di động

- Ống 5: Môi trường chuyển từ màu đỏ tươi sang màu đỏ cánh sen chứng tỏ là

vi khuẩn phân giải urê Nếu không có hiện tượng gì thì kết luận phản ứng âm tính

Sau khi kiểm tra xong sự phân giải urê của vi khuẩn ta nhỏ 3 - 5 giọt thuốc thử Kowaca vào ống nghiệm, quan sát hiện tượng: Nếu thấy có vòng đỏ nổi trên

mặt môi trường thì kết luận vi khuẩn có khả năng sinh Indol Nếu không xuất hiện vòng đỏ nổi trên bề mặt môi trường là phản ứng âm tính

- Ống 6: Nhỏ vài giọt thuốc thử đỏ methyl vào, quan sát ống nghiệm: Nếu màu đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (có phản ứng RM) Nếu màu vàng xuất hiện là phản ứng âm tính

- Ống 7: Nhỏ vào môi trường thuốc thử (5 giọt dung dịch A và 5 giọt dung dịch B) để trong tủ ấm 15 phút, lấy ra, quan sát hiện tượng: Nếu môi trường có màu hồng nhạt là phản ứng dương tính Nếu môi trường không đổi màu là phản ứng âm tính

- Ống 8, 9 và 10: Nếu môi trường chuyển sang màu vàng là phản ứng dương tính Nếu môi trường giữ nguyên màu tím là phản ứng âm tính

* Tính chất hoá sinh của P.aeruginosa:

Sau khi phân lập được các chủng P.aeruginosa, ta tiến hành làm kháng sinh

đồ bằng kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trong thạch (kỹ thuật Kirby - Bauer) Kỹ

thuật này cho phép xác định mức độ nhạy cảm của P.aeruginosa với kháng sinh, từ

đó có thể lựa chọn được kháng sinh có hiệu quả cho điều trị bệnh

- Tiến hành:

+ Đĩa thạch trước khi sử dụng phải để trong tủ ấm 20 phút cho khô mặt thạch

+ Đặt khoanh giấy kháng sinh ra ngoài môi trường trước khi sử dụng 30 phút + Pha canh khuẩn: Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn đã thuần nhất, nghiền vào một ống nước muối NaCl 9‰ Khi độ đục của ống ngang bằng với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5 thì ống đã đạt được tiêu chuẩn 108

tế bào vi khuẩn/1ml

+ Dùng tăm bông vô khuẩn nhúng vào canh vi khuẩn, ria tăm bông đều trên khắp mặt đĩa thạch theo kiểu vuông góc rồi quay đĩa thạch 1800 và ria lại

+ Dùng máy đặt khoanh giấy kháng sinh để đặt khoanh giấy lên mặt thạch (đối với đĩa thạch nhỏ thì đặt khoảng 6 khoanh giấy cách đều nhau)

+ Để ở nhiệt độ phòng 20 phút rồi cho vào tủ ấm 370

C từ 18 - 20 giờ

- Nhận định kết quả:

+ Đo đường kính vùng ức chế vi khuẩn bằng thước đo tính ra mm

+ So sánh đường kính vùng ức chế của mỗi loại kháng sinh với Bảng “Giới hạn đường kính vùng ức chế” để xác định mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh

đó thành 3 mức độ: nhạy cảm (S), trung gian (I), kháng (R) (hình 2.4 phụ lục ảnh)

* Các yếu tố ảnh hưởng đến đường kính vòng ức chế: Thành phần của thạch, chất lượng thạch, độ pH của môi trường, độ dày của thạch, độ khô của mặt thạch, lượng vi khuẩn cấy vào môi trường, khoanh giấy kháng sinh

2.3.2.4 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA

 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật

Màng tế bào được phá bằng enzim lyzozym Enzim protease K được dùng để loại bỏ protein Việc bổ sung thêm các hóa chất như phenol, chloroform, isoamylalcohol nhằm loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa DNA Thu hồi DNA bằng cách tủa trong cồn hay isopropannol và ly tâm Các bước được tiến hành theo thứ thự như sau:

Bước 1: Thu sinh khối tế bào vào eppendorf 1,5ml bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 10 phút

Bước 2: Hòa tan mẫu trong 400µl dịch đệm lysis Thành phần đệm: 20 mM Tris-Cl (pH8), 50 mM NaCl, 10 mM EDTA

Bước 3: Bổ sung lyzozyme, ủ ở 37o

Bước 7: Hút dịch phía trên chuyển sang eppendorf mới Tủa DNA bằng ethanol 100% giữ ở -20oC trong 2-3 giờ

Bước 8: Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút để thu kết tủa DNA

Bước 9: Rửa DNA bằng cồn 70%

Bước 10: Làm khô, hòa tan trong nước khử ion vô trùng

Bước 11: Loại RNA bằng Rnase (10mg/ml), ủ 37o

C trong 2 giờ

 Nhân đoạn gen 16S r RNA bằng phương pháp PCR

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Cho đến nay kỹ thuật PCR được coi là một trong những kỹ thuật nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại

C để qua đêm

30 giây

Trình tự cặp mồi

 Điện di kiểm tra trên gel agarose

Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic Axit nucleic là những đại phân tử luôn tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện một chiều chúng

sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương Trong các thí nghiệm này tôi sử dụng gel agarose 1 %, nhuộm bằng Ethidium Bromide và tiến hành soi DNA dưới ánh sáng tia tử ngoại

 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA

Sản phẩm PCR đặc hiệu được gắn vào vector pBT (2,7 kb) nhờ T4 DNA ligase Phản ứng thực hiện ở 14o trong 18 giờ Thành phần phản ứng như sau;

 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli

Bước 1: Cho 1,5 µl dịch vector pBT đã gắn sản phẩm PCR vào ống chứa 50

µl tế bào khả biến Escherichi coli DH5α, ủ trong đá 30 phút

Bước 2: Sốc nhiệt ở 42o

C trong 30 giây

Bước 3: Bổ sung 250 µl môi trường SOC, nuôi lắc 200 vòng/ phút ở 37o

C trong 1 giờ

Bước 4: Cấy gạt dịch sản phẩm trên lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/ml và X-Gal 50mg/ml)

Bước 5: Nuôi ở 37o

C trong 18 giờ

Bước 6: Bảo quản ở 4o

C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

Trên môi trường LB có bổ sung X- gal, những khuẩn lạc có mầu trắng là những dòng có thể được đính đoạn DNA ngoại lai, còn những khuẩn lạc màu xanh

có thể là những cá thể không được đính đoạn DNA ngoại lai

 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony- PCR)

Sau khi nuôi cấy khuẩn lạc đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, khuẩn lạc tròn màu trắng đã được chọn ra để chạy phản ứng colony- PCR với cặp mồi 341F-907R Nhằm xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen quan tâm hay không Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn

Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR, nhưng chỉ khác

là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc

Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR

 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas

Bước1: Cho 1,5 ml dịch nuôi cấy của dồng vi khuẩn chọn vào eppendorf, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút

Bước 2: Đổ dịch, úp eppendorf trên giấy thấm Bổ sung 250µl đệm P1 vortex cho đến khi sinh khối tan hết

Bước 3: Bổ sung 250 µl đệm P2 và đảo nhẹ 15 lần cho tới khi dịch trở nên trong Bước 4: Bổ sung 350 µl đệm N3 và đảo nhẹ 15 lần

Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 p hút

Bước 6: Chuyển dịch sang cột QIAprep, cột đặt trên eppendof 2ml

Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang eppendorf mới Bước 8: Bổ sung 500 µl đệm PB và ly tâm 12000 vòng/ phút trong 1 phút Chuyển cột sang eppendorf mới

Bước 9: Bổ sung 750 µl ph đệm PE, để trong phút

Bước 10: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút Chuyển cột sang eppendorf mới Bước 11: Ly tâm lại một lần nữa 12000 vòng/phút trong 1 phút

Bước 12: Chuyển cột sang eppendorf mới, bổ sung 60 µl nước deion Để trong 1 phút

Bước 13: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Bỏ cột và giữ lại eppendorf chứa DNA plasmid

 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA

Đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA theo phương pháp của Sanger sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Analyzer Trình tự nucleotid được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis

 Xây dựng cây phát sinh chủng loại

So sánh trình tự đoạn gên 16S rRNA thu được với đoạn gen có kích thước và

vị trí tương tự ở các vi sinh vật khác thuộc nhóm prokaryota đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen thế giới EMBL (European Molecular Biology Laboratory) và

sử dụng phần mềm tin sinh học Clustal để xây dựng cây phát sinh chủng loại

2.3.2.5 Phân tích xử lý số liệu bằng Excel (dùng chỉ định test Khi bình phương χ 2 )

Các bước kiểm định với test Khi bình phương:

Xây dựng giả thuyết nghiên cứu

- Ho: Không có sự khác biệt giữa các tỷ lệ đang so sánh (P1 = P2 = P3 =…)

- H1: Có sự khác biệt giữa các tỷ lệ đang so sánh (P1 ≠ P2 ≠ P3 …)

Biểu thị các số liệu thu được vào bảng

Đây là loại bảng 2 chiều (đa biến) chứa đựng nhiều dòng và cột Số cột và dòng tùy thuộc cách phân loại biến số đang khảo sát Con số trong bảng biểu thị tần

số quan sát được thuộc mỗi ô

Tính toán giá trị χ2

- Tính toán tần số mong đợi (flt) cho mỗi ô của bảng theo công thức:

Tổng dòng  Tổng cột Tổng chung

- Tính giá trị (fi - flt)2/ flt tại mỗi ô của bảng (với fi là tần số quan sát)

- Tính giá trị χ2 theo công thức χ2 = (fi - flt)2/ flt

- Đối với một bảng 2 x 2, ta sẽ có 4 ô, khi đó giá trị χ2 phân số của 4 ô cộng lại

Tra bảng tìm giá trị χ2 lý thuyết

- Xác định mức độ tin cậy α Giá trị này thường được chọn là 0,05:0,01 hoặc 0,1

- Xác định bậc tự do k = (số cột - 1) x (số dòng - 1)

Giải thích kết quả

Nếu χ2 tính được > χ2 tra bảng, tức giá trị p < α, bác bỏ giả thuyết Ho Trong trường hợp ngược lại ta chấp nhận giả thuyết Ho

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả nhuộm soi, nuôi cấy và phân lập

3.1.1 Kết quả nhuộm soi

Sau khi lấy được bệnh phẩm, tiến hành nhuộm soi để quan sát hình thể, tính chất bắt màu, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn thu được kết quả như bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả nhuộm soi các bệnh phẩm (n = 400)

n Tỷ lệ

Qua bảng 3.1 ta thấy: Trong tổng số 400 bệnh phẩm khi nhuộm soi sơ bộ, cầu khuẩn Gram dương chiếm tỷ lệ 33,25%, trực khuẩn Gram âm chiếm tỷ lệ 20,00% và các nguyên nhân khác chiếm 46,75%

Hình 3.1: Biểu đồ kết quả nhuộm soi các bệnh phẩm

Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ trực khuẩn gram âm thấp hơn so với các căn nguyên là cầu khuẩn Gram dương, nấm, song cầu, vi khuẩn kị khí…(hình 3.1) Kết quả này định hướng cho nuôi cấy và để so sánh với kết quả nuôi cấy

3.1.2 Kết quả nuôi cấy

Nuôi cấy các bệnh phẩm mủ (200 mẫu từ bệnh nhân bị nhiễm trùng vết mổ, vết thương…); dịch mũi họng (100 mẫu từ bệnh nhân viêm phế quản phổi, sinh non, suy hô hấp…); nước tiểu (100 mẫu từ bệnh nhân viêm đường tiết niệu, viêm bàng quang, viêm bể thận…) được kết quả trong bảng 3.2

Kết quả nuôi cấy các bệnh phẩm

Bảng 3.2 Kết quả nuôi cấy các bệnh phẩm (n = 400)

59

56

31

0102030405060

Kết quả trên cho thấy tỷ lệ vi khuẩn gây ra nhiễm trùng trong các bệnh phẩm

từ 31% - 59% (hình 3.2) Trong tổng số 400 bệnh phẩm đã nghiên cứu có đến hơn một nửa số bệnh phẩm nuôi cấy cho kết quả dương tính (205 bệnh phẩm) chiếm tỷ

lệ 51,25% Không tìm thấy căn nguyên gây nhiễm trùng là nấm, virus, vi khuẩn kị khí… trong giới hạn của đề tài chỉ nuôi cấy phân lập trên môi trường thích hợp với

vi khuẩn hiếu khí nên các trường hợp nhiễm trùng do các căn nguyên khác không phát hiện được

Với giá trị λ 2 = 22.12383> λ 2 2 tra bảng = 9.210; α = 0,01 chứng tỏ căn nguyên do vi khuẩn gây nhiễm trùng ở các mẫu bệnh phẩm nghiên cứu khác nhau

có ý nghĩa thống kê, với độ tin cậy 99% Phụ lục 1

Ngoài ra còn phải kể đến những nguyên nhân chủ quan, những kết luận nuôi cấy âm tính cũng có thể do kỹ thuật lấy bệnh phẩm không tốt, thời gian để bệnh phẩm làm xét nghiệm quá lâu nên trong nhiều trường hợp khi nhuộm soi tìm thấy vi khuẩn nhưng khi nuôi cấy vi khuẩn lại không mọc Do vậy để nuôi cấy đảm bảo phát hiện chính xác vi khuẩn gây bệnh cần phải lấy bệnh phẩm ở đúng tổ chức bệnh

và nên vận chuyển bệnh phẩm đến làm xét nghiệm càng sớm càng tốt

Kết quả nuôi cấy mẫu lấy từ môi trường (nước, không khí, dụng cụ y tế)

Nuôi cấy các mẫu nước (100 mẫu từ nhà mổ, nhà đẻ, labo rửa tay…); không khí (100 mẫu từ phòng làm thủ thuật, phòng chạy thận…); dụng cụ y tế (200 mẫu đầu panh gắp dụng cụ, sonde ăn của bệnh nhân…) Kết quả bảng 3.3:

Bảng 3.3: Kết quả nuôi cấy các môi trường (n = 400)

Qua kết quả ở bảng 3.3 cho ta thấy: Nuôi cấy tìm thấy vi khuẩn chiếm tỷ lệ cao nhất trong môi trường không khí (42%), trên các dụng cụ y tế đang sử dụng 21%; tỷ lệ nuôi cấy tìm thấy vi khuẩn thấp nhất là ở môi trường nước (20%)

20

42

21

051015202530354045

Hình 3.3: Tỷ lệ nuôi cấy dương tính các môi trường

Với 400 mẫu môi trường đem nuôi cấy, kết quả nuôi cấy tìm thấy vi khuẩn trong 104 mẫu Tỷ lệ vi khuẩn gây ô nhiễm trung bình trong các mẫu là 26%

Với giá trị λ 2 = 17.77547> λ 2 2 tra bảng = 9.210, α = 0,01, chứng tỏ vi khuẩn gây ô nhiễm môi trường ở các loại mẫu là khác nhau, với độ tin cậy 99% Phụ lục 2

Trong các môi trường nuôi cấy dương tính thì không khí là môi trường có vi khuẩn cao hơn cả (42%), các vi khuẩn này có thể do hoạt động của con người thải

ra (hơi thở, giao tiếp…) Tuy nhiên không phát hiện thấy vi khuẩn trong không khí tại phòng mổ Đối với môi trường nước và các dụng cụ y tế đang được sử dụng tỷ lệ

vi khuẩn gây ô nhiễm thấp hơn (20%-21%)

Để tránh ô nhiễm môi trường bệnh viện phải khử khuẩn tốt môi trường và kiểm tra vô trùng bệnh viện thường xuyên