Trường đại học sư phạm hà nội 2 Khoa hoỏ học
Chu thị thuý hằng
Cắt mạch chi(osan bằng h;o; và ảnh hưởng cua chitosan cat mach dộn qua trinh sinh
trưởng cõy lỳa trong thoi ky ma
Khúoỏ luận tốt nghiệp đại học
Chuyờn ngành : Hoỏ Cụng Nghệ Mụi Trường
Trang 2Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Lời cảm ơn
Khoỏ luận này được hoàn thành tại Viện Hoỏ Học cỏc hợp chất thiờn nhiờn, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam Với lũng biết ơn sõu sắc em
xin trõn thành cảm ơn sự giỳp đỡ quý bỏu và hướng dẫn tận tỡnh của TS Nguyễn Thị Đụng trong quỏ trỡnh hoàn thành khoỏ luận này
Em cũng xin được gửi lời cảm ơn tới cỏc thầy cụ trong khoa Húa học, Trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đó tạo điều kiện giỳp đỡ em trong quỏ
trỡnh học tập ở trường và hoàn thiện khoỏ luận này
Em xin gửi lời cảm ơn tới lónh đạo và cỏc cỏn bộ Viện Hoỏ học cỏc hợp
chất thiờn nhiờn , Viện Khoa học và cụng nghệ Việt Nam về những sự giỳp
đỡ trong quỏ trỡnh thực hiện khoỏ luận
Tuy đó hết sức cú gắng nhưng do bản thõn là sinh viờn lần đầu tiờn thực
hiện cụng tỏc nghiờn cứu khoa học nờn việc thực hiện khoỏ luận tốt nghiệp
khụng trỏnh khỏi sai sút Vỡ vậy rất mong nhận được sự gúp ý chỉ bảo của cỏc thõy cụ và cỏc bạn sinh viờn quan tõm
Hà nội, thỏng 5 nam 2008
Sinh viờn
Chu Thị Thuý Hằng
Trang 3
Lời cam đoan
Tụi xin cam đoan đõy là cụng trỡnh nghiờn cứu của riờng tụi Cỏc số liệu, kết quả nờu trong khoỏ luận là trung thực Cỏc kết quả khụng trựng với cỏc kết quả đó được cụng bố
Sinh viờn
Trang 4Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Mục lục
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Trang
Mộ đầu 1
Chuong 1: tong quan 3
1.1 Giới thiệu chung về chitin/chitosan 1.1.1 Nguồn gốc
1.1.2 Định nghĩa 3
1.1 3 Cấu trỳc của chitin/chitosan 1.1.3.1 Cõu trỳc mạch chitin
1.1.3.2 Cõu trỳc mạch chitosan
1.1.4 Tớnh chất lý hoỏ của chitin/chitosan
1.1.4.1 Tớnh chất lý học 1.1.4.2 Tớnh chất hoỏ học
1.1.5 Cỏc phương phỏp điều chế 1.1.5.1 Phương phỏp hoỏ học
1.1.5.2 Phương phỏp lờn men vi khuẩn axit lactic
1.1.6 Một số ứng dụng của chỉitin/chitosan và cỏc dẫn xuất 1.1.7 Cỏc phương phỏp nghiờn cứu
1.1.7.1 Một số phương phỏp xỏc định khối lượng phõn tử của chitin/chitosan
1.1.7.2 Phương phỏp phõn tớch cấu trỳc của chitin/chitosan và chitin/chitosan oligome
1.2 Chitosan khối lượng phõn tử thấp
Trang 5
1.2.1 Định nghĩa
1.2.2 Tớnh chất và khả năng ứng dụng
1.2.2.1 Hoạt tớnh khỏng khuẩn của chitin/chitosan khối lượng phõn tử
thấp 4
1.2.2.2 Khả năng kớch thớch sinh trưởng đối với cõy trồng của
chitin/chitosan khối lượng phõn tử thấp 1.2.3 Điều chế
1.2.3.1 Phương phỏp chiếu xạ
1.2.3.2 Phương phỏp thuỷ phõn bằng enzym 1.2.3.3 Phương phỏp hoỏ học
Chương 2 : thực nghiệm
2.1 Nguyờn liệu, hoỏ chất, dụng cụ 2.1.1 Nguyờn liệu
2.1.2 Thiết bị dụng cụ chớnh
2.2 Quy trỡnh cụng nghệ tỏch B-chitin 2.3 Quy trỡnh điều chế B-chitosan
2.3.1 Điều chế chitosan 2.3.2 Tinh chế chitosan
2.3.3 Khảo sỏt sản phẩm chitosan bằng phương phỏp hoỏ lý 2.4 Quy trỡnh điều chế B-chitosan khối lượng phõn tử thấp
2.5 Khảo sỏt tớnh chất của chỉitosan khối lượng phõn tử thấp (LMWC)
2.5.1 Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ H;O; đến khối lượng phõn tử
trung bỡnh của chitosan khối lượng phõn tử thấp (LMWC)
2.5.2 Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến khối lượng phõn tử
trung bỡnh của chitosan khối lượng phõn tử thấp (LMWC)
2.5.3 Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến khối lượng phõn tử
Trang 6Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
2.5.4 Khảo sỏt độ nhớt của dung dịch chitosan
Chương 3: Kết quả và thảo luận
3.1 Điều chế chitin/chitosan cú DA thớch hợp
3.1.1 Tỏch J-chitin từ mai mực ống
3.1.2 Điều chế B-chitosan cú DA thớch hợp
3.2 Hiệu suất thu hồi LMWC của quỏ trỡnh depolyme hoỏ 3.3 Khao sỏt phản ứng depolyme hoỏ -chitosan
3.3.1 Khao sỏt sản phẩm phản ứng depolyme hoỏ bằng phương phỏp
hoỏ lý
3.3.1.1 Xỏc định độ nhớt và khối lượng phõn tử của chitosan khối
lượng phõn tử thấp
3.3.1.2 Xỏc định cấu trỳc, tớnh chất cia chitosan khối lượng phõn tử
thấp
3.3.2 ảnh hưởng của cỏc điều kiện phản ứng đến khối lượng phõn tử
trung bỡnh sản phẩm phản ứng depolyme húa chitosan
3.3.3 Giải thớch cơ chế phản ứng depolyme hoỏ bằng HạO;
3.4 ảnh hưởng của chỉitosan khối lượng phõn tử thấp đến sự phỏt triển của cõy mạ trước khi cấy
Kết Luận
Tài liệu tham khảo
Trang 7
Mo dau
1 Lý do chọn đề tài
Chiữn là một polysacarit tự nhiờn cú trữ lượng lớn thứ hai sau xenlulo,
được tỏch ra từ vỏ của cỏc loại động vật giỏp xỏc như: vỏ tụm, vỏ cua, mai
mực và thành tế bào nắm Chitin là một polyme bao gồm cỏc mắt xớch N- acetyl-D-Glucosamine với nhau bằng cỏc liờn kết B(1- 4) glucosit Chitosan là một dẫn xuất của chitin thu được trong quỏ trỡnh deacetyl hoỏ
Chitin/chitosan là một biopolyme cú nhiều tớnh chất đặc biệt: Tớnh hoà hợp sinh học, phõn huỷ sinh học, cú tớnh khỏng khuẩn, khỏng nấm, khụng độc Do đú được sử dụng nhiều trong cỏc lĩnh vực y học, được phẩm, nụng nghiệp, mỹ phẩm, cụng nghệ mụi trường [18, 19, 22] Mặc dự vậy khả năng ứng dụng này cũn bị hạn chế bởi chitin rất ớt tan trong cỏc dung mụi hữu cơ và khụng tan trong nước do cấu trỳc tinh thể chặt chẽ (cú nhiều liờn kết hyđro ở trong mạch và giữa cỏc mạch) Vỡ vậy rất nhiều nghiờn cứu đó được tiến hành nhằm cải biến tớnh tan của chitin/chitosan như kỹ thuật biến tớnh hoỏ
học, tạo ra cỏc dẫn xuất trong nước với cỏc nhúm chức cú tớnh năng đặc biệt,
hay kỹ thuật depolyme hoỏ làm giảm đỏng kộ khối lượng phõn tử của
chitosan Cac tac nhõn hoỏ học như H:PO¿, O:, H;O;, cỏc tỏc nhõn sinh học
như enzylncellulase, lysosyme, papain, lipase và tỏc nhõn vat ly như bức xạ gamma đều cú khả năng giỏm cấp chitosan
Chitin/chitosan khối lượng phõn tử thấp là sản phẩm của quỏ trỡnh depolyme hoỏ Ngoài cỏc tớnh chất của chitin/chitosan thỡ chitin/chitosan khối
lượng phõn tử thấp cú những tớnh chất rất đặc biệt, cú hoạt tớnh sinh học rất
Trang 8Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
bằng cỏc chức năng của cỏc gen bảo vệ, vỡ thế làm tăng cỏc quỏ trỡnh sinh trưởng của thực vật bằng cỏc chức năng của cỏc gen bảo vệ, do đú làm tăng
cỏc quỏ trỡnh sinh trưởng và phỏt triển của thực vật, lại ngăn cản sự lõy nhiễm
và phỏt triển của nắm bệnh do đú làm tăng năng suất cõy trồng
Với những ứng dụng rộng rói của chitosan khối lượng phõn tử thấp cựng với nguồn nguyờn liệu thuỷ hải sản phong phỳ của Việt Nam, tụi chọn đề tài khúa luận là: “Cắt mạch chỉosan bằng H;O; và ỏnh hưởng của chitosan cắt mạch đến quỏ trỡnh sinh trưởng cõy lỳa trong thời kỳ mạ ”
2 Mục tiờu của đề tài
- Điều chế chitosan từ (vỏ phế thải) mai mực
- Điều chế chitosan khối lượng phõn tử thấp bằng phương phỏp cắt
mạch chitosan bằng H;O:
- Khảo sỏt tinh chất, cầu trỳc của chitosan khối lượng phõn tử thấp - Thăm đũ khả năng kớch thớch sinh trưởng của chitosan khối lượng phõn tử thấp đến sự sinh trưởng của cõy lỳa trong thời kỳ mạ
Trang 9
Chương 1: Tổng quan 1.1 Giới thiệu chung về chitin/chitosan
1.1.1 Nguồn gốc
Tờn gọi “chitin” xuất phỏt từ tiếng HiLạp “chiton” cú nghĩa là vỏ của cỏc loài giỏp xỏc như tụm, cua, mai mực được Bradconnot tỡm thấy năm 1811 [17, 24, 25] Hàm lượng chitin cú trong một số nguyờn liệu tự nhiờn được đưa ra ở bảng | nhw sau:
Bảng 1: Thành phần chớnh của một số nguyờn liệu chứa chitin
Loại nguyờn %sChitin (loại) % muối khoỏng | % Protein liệu
Vỏ tụm khụ 15-20 (œ) 40-50 30-40
Mai mực ụng 30-40 (B) rat it = 60
mai muc nang 1-2 (khong xac dinh) chủ yờu ớt
1.1.2 Định nghĩa:
Chitin 14 polysacarit mach thẳng gồm cỏc mắt xớch N-acetyl-D- glucosamin nối với nhau bằng liờn kết B (1—> 4) glycosit hay cũn cú tờn gọi 2-axetamido-2-deoxy-B-D-gluczamin
- Chitosan 1a san pham deaxetyl hoỏ của Chitin cú tờn gọi là 2-amido-2- deoxy-B-D-glucozoamin Trong thực tế chitin- chitosan cựng tổn tai trong một phan tử polyme Cú nghĩa là trong một chuỗi polyme vừa cú mắt xớch là B(1I—4)-N-axetyl-D-glucozamin lại vừa cú mắt xớch là (1> 4) D- glucozamin Vi vay khai niộm Chitin hay chitosan chi là tương đối Khi polyme cú tỷ lệ mắt xớch B(1—›>4) D-glucozamin nhiều hơn thỡ được gọi là
chitin, ngugc lai 1a chitosan Vi trong mắt xớch: B(—> 4) D-glucozamin cú
Trang 10Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
tan của chitin/chitosan trong dung dịch axit axetic loóng theo chiều tăng của tần suất xuất hiện nhúm amin trong mắt xớch phõn tử Người ta sử dụng đặc điểm này để phõn biệt chitin hay chitosan
- Nếu tan trong axit axetic loóng thỡ gọi là chitosan, nếu khụng tan thỡ gọi là chitin
- Ngoài ra cú thể phõn biệt bằng giỏ trị độ axetyl hoỏ (DA), hay độ đề
axetyl hod (DD), DA = (1- DD), nếu DA > 50% được gọi là chitin, nếu DA <
50% thỡ được gọi là chitosan
1.1 3 Cẫu trỳc của chitin/chitosan
1.1.3.1 Cau trtic mach chitin
Mach chitin tương tự như mạch polyme của xenlulo chỉ thay nhúm (-
OH) ở C2 của mỗi mắt xớch xenluolo bằng nhúm —-NHCOCH; Cấu trỳc mạch của chitin, chitosan và xenluolo được trỡnh bày ở sơ dộ 1
oh oh oh
ọ ọ ọ
No oO So OO So OC
ho oh ho nhcocha ho nhạ
n n n
Xenlulụ Chitin Chitosan
So do 1: Cụng thức cấu tao cua chitin, chitosan, xenlulo
Mach chitin là chuỗi cỏc mắt xớch N-axetyl-D-glucozamin được liờn kết với nhau bằng cỏc liờn kết B(1 —> 4) glucozit Bằng phương phỏp nhiễm
xạ tia X người ta xỏc định được chitin ton tại trong tự nhiờn với ba dạng œ-
chitin, B-chitin, y-chitin, được phõn biệt nhờ sự sắp xếp cỏc mạch trong tinh
thể
* œ- chiữn: cú cấu trỳc tinh thờ theo kiờu mạng ghộp đối song (1 mạng lờn, một mạng xuống liền nhau), œ- chitin thường được tỏch ra từ vỏ tụm, cua
Trang 11
* Ä- chitin: cỏc mạng ghộp song song cựng chiều, B- chitin chủ yếu cú trong mai mực ống mực nang sừng
* y- chitin: cỏc mạng ghộp trong tinh thể theo cỏch cứ hai mạng song song lai cú một mạch đối song y- chitin được tỏch ra từ sợi kộn của bọ cỏnh cứng, dạ dày của mực ống, cú trữ lượng ớt nhất
a-chitin B-chitin y-chitin
Trong 3 dang trờn, a- chitin cú cấu tric tinh thể bền vững nhất, chitin
tồn tại chủ yếu dưới dạng œ- chitin Khi ở điều kiện thớch hợp thỡ B- chitin ngõm trong dung dịch HCI đặc (>6N) chuyờn thành ơ- chitin [6, 10], y-chitin
chuyển thành ơ- chitin khi ngõm trong dung dịch LiSCN bóo hồ
1.1.3.2 Cõu trỳc mạch chitosan
Chitosan cũng cú cấu trỳc tỉnh thể và tớnh đa hỡnh phụ thuộc vào trạng
thỏi vật lý: dạng khan, dạng ngậm nước hay dạng muối Hiện tượng đa hỡnh của chitosan đó được nghiờn cứu tỉ mỉ, từ đú cỏc nhà khoa học đó đưa ra
những nhận định khỏc nhau đối với cỏc điều kiện nghiờn cứu khỏc nhau Huang và cỏc cộng sự [38,39] đó tỡm thấy trong cỏc màng protein- chitosan
được chế tạo từ cỏc loại protein và chitosan khỏc nhau cú cấu trỳc tinh thể
hỡnh kim và hỡnh bụng tuyết chứa cỏc liờn kết ngang do cú sự tương tỏc lẫn
nhau giữa protein và chitosan Belamie và cỏc cộng sự [38] đó nghiờn cứu cầu
tạo phõn tử chitosan khối lượng phõn tử thấp và đưa ra nhận định rằng cỏc
phõn tử này cú thể tỏi kết tinh ở nhiệt độ phũng
Trang 12Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
cỏc axit hữu co: axit formic, axit axetic, axit oxalic va axit lactic dO tan cua
chitosan phu thudc vao loai axit va nống độ axit trong dung dịch [38] 1.1.4 Tớnh chất 1ớ hoỏ của chitin/chitosan
1.1.4.1 Tớnh chắt li hoc
Loại œ-chitin ở thể rắn, xỐp, nhẹ, cú thể xay nhỏ thành bột mịn cú màu
trắng hoặc vàng, khụng mựi vị
Loại B-chitin cũng cú những tớnh chất trờn nhưng khỏ dai, ớt xốp hơn,
khú nghiền nhỏ hơn,
Tinh tan: chiin khụng tan trong nước và trong cỏc dung mụi thụng thường khỏc mà chỉ tan trong cỏc dung mụi chứa LICl như N,N- đimetylaxetamit (DMAc) chứa 5-10 % LiCl va N-metyl pirolidone (NMP), hỗn hợp DMAc và NMP cú chứa 5 -8 % LICI thường được sử dụng khi gia cụng mang chitin [19] Cac nhà khoa học đó tỡm ra hệ dung mụi hoa tan chitin
tricloaxetic (TCA) va alohidrocacbon nhu: clometan, 1,1,2- tricleta.TCA với
nồng độ 25- 75 % hoà tan hỗn hop 1 — 10% chitin 6 nhiột độ phũng
S.Tokura: [34] đó sử dụng hệ dung m6i 1a axit formic (FA) - dicloaxetic (DCA), diclopropyl ete làm hệ mụi hoà tan chitin
Chitin cú khả năng hấp thụ nước cao, nú cú thể được nghiền nhỏ rồi ngõm trong nước, nghiền tơi thành dạng huyền phự, sau đú đem gia cụng thành giấy chitin Do -chitin dai hơn nờn giấy B-chitin dộ sản xuất
Một hệ dung mụi khỏc cũng đó được dựng để hoà tan chitin như: axit formic, axit dicloaxetic, axit tricloaxtic- dicloetan Ngoai ra, chitosan con tan
trong axit axetic (nồng độ 1%); tớnh tan tăng khi nhiệt độ, nồng độ tăng
1.1.4.2 Tớnh chắt hoỏ học
Cụng thức tống quỏt của chitin/chitosan là (CạHĂĂNO¿) Ă
Trang 13
ho nhcocha ho nhạ
n n
Sơ đụ 2: Cụng thức cấu tạo của chitin/chilosan
Khi n = 1 14 N-axetyl-D-glucozamin thanh phan cơ bản trong mụ của da nờn cú khả năng tỏi tạo vết thương
Khi n= 4 đến 20 gọi là oligome
Khi n> 20 tạo thành polyme gọi là chitin
Trong mỗi mắt xớch của chitin/chitosan vừa cú nhúm chức (-OH) lại vừa cú
nhúm chức amin (-NHCOCH;) (-NH;) nờn chitin/chitosan cú ba trung tõm
phản ứng nú vừa cú tớnh chất của ancol lại cú tớnh chất của amit và của amin * Phản ứng ở nhụm —OH
Giống như cỏc ancol đa chức, tớnh axit của nhúm hydroxit khỏ mạnh, chitin phản ứng với Na, NaOH tạo thành cỏc hợp chất cú cấu trỳc ancolat
được gọi là chitin kiềm
[C2H;O;NHCOCH;(OH);]; + 2n NaOH >[C¿H;OsNHCOCH;(ONa);z]n
+2n HO
Chitin kiềm là sản phẩm trung gian khi sản xuất chitin ete nhu ankyl
chitin
[CsH7;O;NHCOCH;(ONa)2]n ‘ki hiộu 1a [Chit(ONa)], [Chit(ONa),], +2n RX > [Chit(OR),], + 2 NaX
Soi ankyl chitin được tạo ra bằng cỏch xử lý ankyl chitin trong dung dịch axit focmic và axit axetic rồi cho kộo sợi qua một ống cú đường kớnh nhỏ
cỡ mm
Trang 14Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Phản ứng với ankyl sunfat trong ankyl halogenua thu được cỏc este Phỏn ứng với cỏc hop chat vinyl tao este
Trong mỗi mắt xớch của chitin cộ nhom (-OH) 6 C; va Cg dộu co kha
năng tham gia phản ứng Do vậy cỏc phản ứng xảy ra ở hai vị trớ này được gọi là phản ứng thế O Độ thế của sản phẩm thế O được tớnh bằng tổng độ thế ở hai vị trớ này Cỏc phõn tớch thực nghiệm cho thấy: nhúm —OH ở vị trớ C3 kộm hoạt động hơn vị trớ Cú do cú sự cản trở về mặt khụng gian nờn độ thế O khú
đạt đến giỏ trị lý thuyết [6]
* Phan ung cua nhom axetamit:
Chitin cú khả năng tham gia phản ứng hoỏ học thờ hiện tinh chất của amin bậc 2 như phản ứng deaxetyl hoỏ tạo thành chitosan
NaOH
(CHgO„NHCOCH;) => (C¿H,O,NH;)n
Chitin M = 203n chitosan M = 161n
Phản ứng trờn thường được thực hiện với NaOH 40% ở 120°C tr 1 đến 3 giờ Hiệu suất của phản ứng deaxetyl thường chỉ đạt 70% Điều này cú nghĩa là chuỗi pụlime vẫn cú cả cỏc mắt xớch N-axetyl-D- glucozamin đan xen với (1 4)-D- glucozamin [I I]
Đề đỏnh giỏ mức độ deaxetyl hoỏ của chitin người ta đưa ra khỏi niệm độ deaxetyl hoỏ(DDA) được tớnh theo cụng thức:
_ 203 (100— A) 203 x 100 —42A
Voi A là tổng số % mắt xớch N-axetyl-D- glucozamin
DDA x100%
Muốn thu được chitosan deaxetyl hoỏ hoàn toàn DDA = 0, phải rửa sạch
mẫu rồi xử lý kiềm lặp đi lặp lại nhiều lần Phương phỏp mới đề thực hiện phản
ứng deaxefyl hoỏ cho hiệu suất cao được cỏc tỏc giả [26] thực hiện khi dựng
dung dịch NaOH 5% và NaBH¿ với tỉ lệ 0,1g/1g chitosan thỡ chitosan được bảo
Trang 15
vệ khụng bị cắt mạch và phỏ được cấu trỳc tinh thể Phản ứng được thực hiện
trong 3 giờ đạt hiệu suất cao, giảm tiờu tốn húa chất, giảm ụ nhiễm mụi trường
* Phản ứng ở nhúm -NH; [1]
Phan ứng xõy ra ở nhúm amin NH; và nhúm amit NHCOCH; hai nhúm này gắn ở vị trớ C› (hay vị trớ N) Tại đõy nhúm NH; của chitin/chitosan
cú đụi điện tử chưa chia, do đú về mắt hoỏ học chỳng cú khả năng phản ứng
cao với cỏc tỏc nhõn ỏi điện tử để tạo ra cỏc dẫn xuất tương ứng
Phản ứng gắn cỏc nhúm thường (-OH) vào vị trớ N (vị trớ C;) hay gắn poly-etylen-glycol vào nhúm -NH; thu được cỏc dẫn xuất cú cấu trỳc hoỏ học cồng kềnh nhằm cản trở khụng gian làm giảm cỏc liờn kết cầu hidro giữa cỏc mạch và trong mạch của phõn tử chitin/chitosan như lỳc ban đầu
Phản ứng của chitosan với cỏc anhydric axit để cho những sản phẩm tan hoàn toàn trong nước
Phản ứng của chitosan với cỏc axit cacboxylic (vào -NH;) cũng cho những sản phẩm tan hoàn toàn trong nước
* Phản ứng giảm mạch polyme
Độ dài mạch quyết định tớnh chất lý hoỏ và cỏc tớnh chất khỏc của
polyme Chitin/chitosan 1a polyme cú khối lượng phõn tử lớn (10.000->500.000 Da) tuỳ thuộc vào nguồn gốc và phương phỏp điều chế Mạch chitin/chitosan cú thờ bị thuỷ phõn tạo thành cỏc oligosacarit, disacarit (2 monome) hoặc phõn huỷ đến cựng cho ta cỏc mụnụme
Cú 3 phương phỏp chớnh để giảm mạch glucozit như sau:
Phương phỏp oxi hoỏ cắt mạch: cú thể bẻ góy trong chuỗi polyme của
Trang 16Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp oh oh 9 hcl@E, nóng p O ——————> o nhcoch3 nhcocha oh n oh m (n>>m)
Sơ đụ 3: thuỷ phõn trong HCI đặc núng
Cú thể thuỷ phõn hoàn toàn chitin thành monosacarit D- glucozamin khi dựng HCI núng Nếu dựng mụi trường axit yếu thu được N-axetyl-D-
glucozamin Trong điều kiện ờm dịu hơn người ta thu được hỗn hợp cỏc
oligomesaccarit trong đú cú cả cỏc N-axetyl-D-glucozamin va D- glucozamin
1.1.5 Cỏc phương phỏp điều chế:
1.1.5.1 Phương phỏp hoỏ học: (phương phỏp truyền
thụng)
Sau khi thu thập, nguyờn liệu được làm sạch, sấy khụ rồi nghiền
nhỏ.Sau đú tỏch loại muối khoỏng bằng dung dịch HCI.Tiến hành lọc, rửa sản phẩm bằng nước nhiều lần đến pH = 7 Tỏch loại protein cú trong nguyờn liệu
bằng NaOH, cuối cựng sấy khụ thu được chitin [6, 10, 21, 22, 30]
Chitin được hoà vào bỡnh cầu đó chứa dung dịch NaOH 50% và khuấy
liờn tục trong 24 giờ Lọc, rửa mẫu nhiều lần bằng nước đến pH = 7 thu được
chitosan mau trắng (deaxetyl hoa B - chitin) hoc mau trang nga (deaxetyl hoa
œ-chitin) Phản ứng này được tiến hành lặp lại để điều chế chitosan cú độ
axetyl hod (DDA — Degree of Deacetylation) lớn sau đú lọc, rửa nhiều lần bằng nước cất, chiết soxhlet với metanol (24 giờ), axeton (24 giờ), sấy khụ trong tủ sấy chõn khụng ở 60°C (48 giờ) thu được chitosan sạch, chitosan điều chế được khụng tan trong nước nhưng tan trong dung dịch axit axetic 1% Muốn thu được chitosan deaxetyl hoỏ hoàn toàn (DDA = 100%), phải rửa sạch mẫu rồi xử lý kiềm lặp lại nhiều lần Phương phỏp mới đề thực hiện phản
Trang 17
ứng deaxetyl hoỏ cú hiệu xuất cao được cỏc nhà khoa học thực hiện khi dựng
dụng dịch NaOH 5% và NaBH¿ với tỷ lệ 0,1g NaBH./1g chitosan thỡ chitosan
được bảo vệ khụng bị cắt mạch và phỏ được cấu trỳc tinh thể Phản ứng thực
hiện trong 3 giờ, đạt hiệu suất cao, giảm tiờu tốn hoỏ chất, giảm ụ nhiễm mụi
trường
Vỏ phế thải Thu thập bảo quản | Nghiền | Tỏch Protein làm sạch "|
Rửa
Rửa, Rửa, Ơ
Chitosan nghiền sấy Deaxetyl | Chitin | sỏy khụ| Tỏch khoỏng
hoỏ Vễ CƠ
Sơ đề 4: điều chế chitosan theo phương phỏp hoỏ học
1.1.5.2 Phương phỏp lờn men vi khuẩn axit lactic:
Nguyờn tắc của phương phỏp: Hỗn hợp lờn men gồm: vỏ phế thải, axit lactic, dung dich glucozo Trong qua trinh lộn men LAB (lactic Axit bacterial) san sinh ra axit lactic là giảm pH (pH < 4,8) của đung dịch tạo điều kiện cho cho quỏ trỡnh thuỷ phõn protein, thuỷ phõn khoỏng tạo ra cỏc lactat canxi, magie là những chất tan được trong nước Bằng cỏch ly tõm phần dung dịch
lỏng giầu và khoỏng đó hồ tan, tỏch được khỏi phần chitin khụng hoà tan Phần cũn lại là chitin thụ
Trang 18Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
1.1.6 Một số ứng dụng của chitin/chitosan và cỏc dẫn xuất
Chitin và cỏc dẫn xuất là polyme tự nhiờn cú nhiều đặc tớnh quý đúng
vai trũ quan trọng trong đời sống con người và bảo vệ mụi trường Cỏc ứng dụng của chitin/chitosan và dẫn xuất được nghiờn cứu từ nhiều thập niờn gần đõy trong cỏc lĩnh vực như:
- Trong cụng nghiệp giấy, mực in: chitosan được đựng làm chất phụ gia để tăng cường chất lượng sản phẩm
- Trong mỹ phẩm: Vỡ cú đặc tớnh khụng độc, khụng gõy kớch ứng da
nộn chitin dugc su dung lam thành phan kem dưỡng da, kem lột mặt, để làm
tăng độ bỏm dớnh, tăng tớnh phự hợp sinh học của da, chống tia cực tớm
- Đối với mụi trường: chitn/chitosan là chất điện ly trựng hợp và tạo vũng căng nờn được ứng dụng làm tỏc nhõn keo tụ và đụng tụ dộ xử lý nước thải, thu hồi protein, kim loại, đặc biệt là kim loại nặng và đồng vị phúng xạ trong nước thải biển
Ngoài ra chitin/chitosan cũn cú chức năng ngưng kết CO; trong thạch quyền, khớ quyển và thuỷ quyờn nờn chitin/chitosan cú ứng dụng tốt trong
việc ngăn chặn hiệu ứng nhà kớnh, được sử dụng để chế tạo vật liệu comporIt,
cú tớnh thõn thiện với mụi trường
- Đối với nụng nghiệp: Vỡ chitin/chitosan cú khả năng hoà hợp sinh
học cao, cú khả năng khỏng khuẩn nờn được sử dụng làm chất kớch thớch sự
phỏt triển của cõy trồng, xử lý ngõm hạt giống để tăng khả năng mọc mầm cú tỏc dụng chống nấm, bảo quản rau quả tươi, làm thức ăn cho cỏ và động vật nuụi
- Trong y học: Chitin/chitosan được dựng để làm màng sinh học trong chữa bỏng, chữa vết thương ở da, xử lý cỏc tốn thương về xương, giảm
cholesterol
Trang 19
- Trong cụng nghiệp: Chitin/chitosan là polyme khú tan, dễ đỳc và dộ khuụn lại cú khả năng tăng cường và duy trỡ chức năng tự bảo vệ sinh học nờn
nú được sử dụng trong cụng nghệ dệt vải, sợi giỳp tạo hạt, sợi vải khụng dệt, màng phim và vật liệu xốp Chitin/chitosan cũn được sử dụng như một hoỏ
chất cụng nghiệp như: gluco-N-axetic, olygosacarit 1.1.7 Cỏc phương phỏp nghiờn cứu:
1.1.7.1 Một số phương phỏp xỏc định khụi lượng phõn
tu cua chitin/chitosan
Dộ xac dinh Mw của một loại polyme, người ta cú thể dựng phương
phỏp trực tiếp như: tỏn xạ ỏnh sỏng, đo độ thõm thấu hoặc phương phỏp
giỏn tiếp như: đo độ nhớt, sắc ký khớ
Xỏc định khối lượng phõn tử trung bỡnh bằng phương phỏp đo thõm thấu là một trong những phương phỏp đề xỏc định khối lượng phõn tử số
+ Phương phỏp thấm thấu ỏp suất hơi: Tương tự như thõm thấu
màng, phương phỏp này được xỏc định bằng độ chờnh lệch thế hoỏ học giữa dung mụi nguyờn chất và dung mụi trong dung dịch polyme
+ Phương phỏp sắc kỹ lỏng cao ỏp: là phương phỏp sử dụng cột để
hấp thụ polyme, cỏc phõn tử polyme cú khối lượng nhỏ sẽ bị hấp thụ trước, do
đú chỳng ở sõu trong cỏc lỗ mao quản Cỏc polyme cú khối lượng phõn tử lớn sẽ bị hấp thụ sau, chỳng ở phớa ngoài của cỏc lỗ mao quản Sau đú sử dụng dung mụi thớch hợp ta sẽ tỏch được cỏc polyme cú khối lượng phõn tử lớn ra trước riờng rẽ với cỏc polyme cú khối lượng phõn tử nhỏ Trong phương phỏp
này việc chọn chất nhồi cột, dung mụi thớch hợp cú ảnh hưởng rất nhiều đến
kết quả phõn tớch
+ Phwong phap do độ nhớt
Đõy là phương phỏp phố biến nhất, để xỏc định khối lượng phõn tử
Trang 20Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
tương đối nhanh, với dụng cụ đơn giản, tuy nhiờn độ chớnh xỏc khụng cao,
mặt khỏc chỉ sử dụng phương phỏp này cho những polyme đó biết trước cỏc giỏ trị cỏc hằng số thực nghiệm
Nguyờn lý của phương phỏp [1, 2, 20]: Độ nhớt của dung dịch phụ thuộc vào khối lượng phõn tử, nồng độ và dung mụi Độ nhớt của đung dịch được tớnh gần đỳng theo phương trỡnh Mark-Howwink-Sakurada [20, 32,
33]
[u]=K.MZ (2)
Trong đú 4⁄7: Là khối lượng phõn tử trung bỡnh của polyme cần xỏc định
K, ơ: Là cỏc hằng số thực nghiệm đặc trưng của mỗi polyme [n]: Là độ nhớt riờng của dung dịch polyme
Voi chitosan DA ~ (0 + 40)%, cac gia trị hằng số K, ơ trong phương
trinh Mark-Howwin tim dugc là:
[;] = 1.81 x 10°.M””
Với hệ số dung mụi là CH:COOH 0,1M/NaC]1 0,2M [11]
ỏp dụng phương phỏp trờn với chitin bằng cỏch axetyl hoỏ chitin thành chitosan Sau đú xỏc định khối lượng phõn tử trung bỡnh của chitosan Tỡm ra khối lượng phõn tử trung bỡnh của chitin dựa vào hiệu suất phản ứng để axetyl hoỏ
Ngoài ra, một số phương phỏp vật lý hiện đại khỏc cũng được kết hợp để xỏc định khối lượng phõn tử như: IR, MS, NMR, Độ chớnh xỏc của cỏc phương trỡnh này phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố: nhúm chức đặc trưng, dung
mụi, độ phõn giải phố, điều kiện chuẩn bị mẫu, độ tinh khiết của mẫu
Trang 21
1.1.7.2 Phương phỏp phõn tớch cõu trỳc của chitin/chitosan va chitin/chitosan oligome
* Phộ hong ngoai IR ctia chitin/chitosan [3]
Dựa vào phụ hụng ngoại cú thờ suy ra độ đụng nhõt của cõu trỳc phõn
tử, độ tinh khiết của chất, thõm chớ dộ nghiờn cứu động học phản ứng Phương
phỏp phổ IR được sử dụng để nghiờn cứu cỏc đặc trưng của chitin/chitosan
như dải hấp thụ của cỏc nhúm đặc trưng
Phố IR của œ - chiữn cú cỏc pic chớnh 3450cm', đặc trưng cho dao động hoỏ trị nhúm -OH và -NH; (on va ywna); 3265, 3102, 2950, 2887 đặc trưng của nhúm CHĂ; (cw); 1654 cm! đặc trưng cho dao động hoỏ trị của amit bậc I(yc.o), 1620, 1548 cm’! dac trưng cho dao động của amit bac 2(yN.n) 1414 -1115 cm” (của ancol bậc 2 ở C;); 1072, 1026 cm” (của ancol bậc 1 ở Cạ) B chitin cú vạch sắc ở bước súng thấp đặc trưng tại 630-638 cm”, tại 3295 cm” tương ứng với vạch 3265 cm” của ơ- chitin Liờn kết CH ở 1430 cm”
và 972 cm” (của nhúm —Ch;) [25] Như vậy khi so sỏnh cường độ dải hấp thụ
của nhúm amit bậc 1 (ở 1655 cm) và nhúm -OH (ở 3450 cm' `) Tớnh được
độ acetyl hoỏ của chitin/chitosan [3, 9, 12, 15]
1.1.7.3 Cỏc phương phỏp xỏc định độ acetyl hoỏ của
chitin/chitosan và dẫn xuất
DA (degree of acetylation) la hàm lượng nhúm —NHCOCH;: hay nhúm — NH; trong chitin/chitosan Sự khỏc nhau về hàm lượng của nhúm này dẫn tới
sự khỏc biệt rừ rệt về tớnh chất của vật liệu polysacarit và đụi khi cú tớnh chất
quyết định đến khả năng sử dụng của chỳng trong cỏc lĩnh vực khỏc nhau như
y học, dược phẩm, mụi trường, nụng nghiệp Mặt khỏc, hầu hết cỏc dẫn
xuất với đặc tớnh quý giỏ: khả năng khỏng khuẩn, khỏng nắm, chống viờm,
Trang 22Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
hàm lượng nhúm —NH; cú trong phõn tử chitosan đúng vai trũ rất quan trọng và khụng thể thiếu được trong cỏc bước nghiờn cứu tiếp theo
Do đặc thự của chitin là trong phõn tử luụn cú lẫn cỏc mắt xớch chitosan Vỡ vậy, việc xỏc định độ thế, độ acetyl hoỏ của chitin giỳp ta xỏc định được tớnh chất của mẫu
Cú rất nhiều phương phỏp để xỏc định độ đề acetyl hoỏ của chitin/chitosan như: phưng phỏp phố NMR, phụ IR, nhiệt phõn sắc ký khớ với sự cú mặt của axit oxalic, phương phỏp chuẩn độ điện thế, phương phỏp phõn tớch nguyờn tố EA
* Tinh DA theo pho NMR
Mẫu dung dịch chitin/chitosan được do trộn may Avance 400MHz, dung mụi D;O/CD;COOD) tỷ lệ 95:5 V/V cho cỏc pic 5 (ppm) = 1,98 (tương ứng với nhúm CHC= O); 3,17 (ppm) của H; ở GleN; 3,53 — 3,94 (ppm) của HĂ ở
GlcN và 4.86- 4,88 H; của mắt xớch GlcAc DA của mẫu được xỏc định theo
cụng thức [28]
m+ Ae
DA=———3 _ 100%
IHL + TH 2+ TH+
Trong đú: I là cuong do cua cac pic H’1 la nguyộn tir H 6 nhom GlcNAc H1 1a nguyộn tt H 6 nhom GlcN
H2 là nguyờn tử thứ hai của mắt xớch GLcN
Ac la pic cua 3 nguyờn tử H tương dương trong nhúm CH:ạ của axetyl *- Xỏc định độ đề acetyl hoỏ bằng phương phỏp phổ IRỊ3]
Độ acetyl hoỏ DA được tớnh theo cụng thức của Dillon và Taylor [3] %N — acetyl- hoa = Avess x4 15
3450
Trang 23
(DA%) Trong do:
Aisss là diện tớch dải hấp thụ tại bước súng 1655 cm”, đặc trưng cho
dao động hoa tri y co
A3zaso la diộn tich dai hap thụ tại bước súng 3450 cm” đặc trưng cho dao
động hoỏ trị To.w
* Tớnh DD theo phương phỏp điện thộ (nam 1992) [37]
Cho 0,5 g chitosan (cõn chớnh xỏc) hoà tan trong 0,2 mol/lit axit HCI
Dung dịch được chuẩn với 0,1 mol/lit NaOH, độ đề acetyl hoỏ được tớnh như Sau:
NEM = 100°C%—CƠ)0016
CĂ: nồng độ của HCI mol/lit
Cr: nong do cua NaOH mol/lit
V1: Thộ tich cia HCl (ml) V;: thộ tich cia NaOH (ml)
G: Trọng lượng mẫu (g) W: phần trăm õm của mẫu (%)
0,016 là khối lượng —NH; cõn bằng với 0,2 ml đung dịch 0,1 mol/lit
HCI (g)
NH,%
9,9%
D6 dộ acetyl hod: DD = x100% trong đú 9,94 là % ly thuyết NH¿
* Xỏc định độ đề acetyl hoỏ bằng phương phỏp phõn tớch nguyờn tổ
(EA)[8]
Trang 24Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
â — s4
pp =|i—-* x100% trong đú: C/N- là tỷ lệ cacbon với nitơ
,
1.2 Chitosan khối lượng phõn tử thấp
1.2.1 Định nghĩa
Chitin/chitosan oligome là sản phẩm thu được trong quỏ trỡnh phõn huỷ hoặc thuỷ phõn chitin/chitosan Phõn tử chitin/chitosan cú độ trựng hợp n>20
(n = 20 + 40) được gọi là hợp chất khối lượng phõn tử thấp 1.2.2 Tớnh chất và khả năng ứng dụng
Ngoài những tớnh chất chung của chitin/chitosan hợp chất chitooligosacarit cũn cú tớnh chất đặc biệt là tan trong nước ở dải pH rộng (pH = 5+ 8)
Chitosan khối lượng phõn tử thấp (chitooligome) là vật liệu cú hoạt tớnh
sinh học cao Chỳng cú khỏ năng ngăn cản sự phỏt triển của khối u, kớch thớch hệ thống miễn dịch, tăng cường khả năng hoạt động của lysozym và cú khả năng khỏng khuẩn cao hơn chitosan Núi chung chitin/chitosan khối lượng phõn tử thấp điều hoà sự lớn lờn và phỏt triển của thực vật bằng chức năng của cỏc gen bảo vệ, vỡ thế làm tăng cỏc quỏ trỡnh sinh trưởng phỏt triển của cõy, đồng thời ngăn cản sự lõy nhiễm và phỏt triển của cỏc loại nắm bệnh, do đú làm tăng năng suất cõy trồng
Ngoài ra cỏc chitooligome cũn cú khả năng làm giảm stress trong cõy,
cú tỏc dụng vận chuyờn cỏc kim loại nặng (cỏc ion VỶ*, Ca”*, Mg””) trong quỏ trỡnh trao đụi chất của thực vật [13, 14, 18, 27, 28, 30]
1.2.2.1 Hoạt tớnh khỏng khuẩn của chitin/chitosan
khối lượng phõn tử thấp
Chitin/chitosan cú hoạt tớnh khỏng khuẩn cao, an toàn với cơ thể người Hoạt tớnh khỏng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ của chitin/chitosan và phụ
Trang 25
thuộc vào khối lượng phõn tử Đó cú những cụng bố về hoạt tớnh khỏng khuẩn của chitin/chitosan với những kết quả khỏc nhau.Guan, Fu, Zhu [14] (năm
1997), đó cho biết chitosan khối lượng phõn tử thấp cú hoạt tớnh khỏng khuẩn
cao, khi Mẹ = 1.5 kDa là tối ưu nhất cho hoạt tớnh khỏng khuẩn
Hai tỏc giả Jeon, và Kim [36] (năm 2001) cho rằng chitosan khối lượng phõn tử thấp cú nồng độ 0,5% cú thể ngăn cản hoàn toàn sự phỏt triển của vi khuẩn E.coli
Shin và cộng sự (năm 1997) đó chứng minh rằng chitin/chitosan cú khối lượng phõn tử 40kDa cú thể ngăn tới 90% sự phỏt triển của vi khuẩn S.aureus và E.coli ở nồng độ 0,5% Với chitosan khối lượng phõn tử 180 kDa cú thể ngăn cản hoàn toàn sự phỏt triển của vi khuẩn E.coli, S.aureus ở nồng
độ 0,05%
Hong kyoon và cộng sự [16] (năm 2002) cho biết chitosan 0,1% cú khả năng khỏng khuẩn gram dương (positive) mạnh hơn đối với vi khuẩn gram õm (negative) Vỡ vậy cú mối quan hệ chặt chẽ giữa hoạt tớnh khỏng khuẩn với nồng độ cũng như khối lượng phõn tử của chitin/chitosan
* ảnh hưởng của nỗng độ chỉtosan đến hoạt tớnh khỏng khuẩn
Với cỏc chitosan cú khối lượng phõn tử Mv < 305 kDa, khi nồng độ chitosan tăng lờn thỡ hệu quả khỏng khuẩn được tăng cường Khi nồng độ đạt đến 1.0% tốc độ ngăn cản đạt đến 100% cho cdc khudn S.aureus va E.coli
[36]
* ảnh hưởng của khối lượng phõn tử chiosan đến hoạt tớnh khỏng khuẩn
Với chủng S.aureus, khuõn gram dương: khi khối lượng của chitosan tăng lờn, hiệu quỏ khỏng khuẩn tăng lờn Nguyờn nhõn chớnh cú thộ do sy tao màng của chitosan khối lượng phõn tử cao đó ngăn cản sự hấp phụ dưỡng chất
Trang 26Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Với chủng E.coli khuẩn gram õm, khi khối lượng phõn tử chitosan giảm đi thỡ hiệu quả khỏng khuẩn tăng lờn Nguyờn nhõn chớnh là do chitosan cú khối lượng phõn tử thấp dễ dàng thõm nhập tế bào vi khuõn, làm cản trở quỏ trỡnh chuyờn húa của tế bao.[16]
* Giải thớch về cơ chế khỏng khuẩn
Hiệu quả cua chitin/chitosan là rất khỏc nhau với hai loại vi khuẩn, cú thể giải thớch cơ chế hoạt tớnh khỏng khuẩn của chitosan như sau:
+ Chitosan trờn bề mặt của tế bào cú thể tạo thành màng polyme và màng này cú tỏc đụng cản dưỡng chất đi vào tế bảo
+ Chitin/chitosan trọng lượng phõn tử thấp thõm nhập vào tế bào theo cỏch lan toả Khi đú, chitosan cú thể hấp thu những chất mang điện õm trong
tế bào và kết tụ lại thành cụm, điều đú làm cản trở hoạt động sinh lý của vi
khuẩn và giết chết chỳng Với khuan S.aureus co chộ tao mang cộ wu thộ hon
với khuẩn Ecoli cơ chế (b) thớch hợp hơn
Chụp ảnh kớnh hiển vi điện tử cho cỏc loại khuõn gram dương, gram õm cho thấy màng tế bào của khuẩn S.aureus bị suy yếu đi, thậm chớ bị phỏ vỡ, cũn ở khuẩn Ecoii cỏc tế bào được co cụm, tập chung lại và tạo thành cỏc khe rộng, điều đú ngăn cỏn sự hoạt động bỡnh thường của tế bào vi khuẩn
Túm lại, cơ chế hoạt động khỏng khuẩn của chitosan là khỏc nhau với
cỏc khuẩn gram õm và gram dương Hơn nữa, cơ chế khỏng khuẩn của chitosan cú thờ khỏc với cỏc loại polysacarit khỏc do cú điện tớch dương trờn
bề mặt chitosan
1.2.2.2 Khả năng kớch thớch sinh trưởng đỗi với cõy
trụng của chitin/chitosan khối lượng phõn thắp
* Chitosan oligome duoc str dụng như một chất kớch thớch tăng trưởng trong nuụi cấy mụ (cõy phong lan)
Trang 27
Cỏc nghiờn cứu cho thấy rằng, khi sử dụng chitosan oligome nồng độ tối ưu 15 ppm thỡ cú tỏc dụng làm tăng trưởng của mụ lấy từ cõy lan thành thực thể giống như mầm rễ Tốc độ hoạt hoỏ của chitosan oligome gấp bốn lần so với chitosan khối lượng phõn tử cao, kết quả cho thấy với một lượng nhỏ chitosan cú tỏc động mạnh đến sự tăng trưởng của cõy phong lan [30]
* Kha nang kớch thớch nẩy mõm của chitosan oligome
Khi sử dụng chitooligosacarit cú khối lượng phõn tử 19.000 Da, nồng độ 3.75 ppm thỡ tăng làm tốc độ nảy mầm của hạt lỳa mạch loại nẩy mầm chậm và trung bỡnh Chitooligosacarit (Mạ = 13.000Da) với nồng độ 3.75 ppm cho tốc độ tăng trưởng cao nhất hạt yến mạch Trung Quốc [14] Ngoài ra oligoglucosamin khi phun lờn hật đậu nành trong 30 phỳt làm tăng tốc độ nảy mam của hạt và làm tăng trưởng cõy trồng Đặc biệt lượng nitơ gắn kết (nốt
sần) cao gấp 2 lần so với đối chứng, tốc độ nhiễm sõu bệnh giảm đỏng kể,
năng suất vụ mựa cao hơn (20%- 30%) so với đối chứng * Khả năng kớch thớch sinh trưởng cõy trồng
Chitooligosacarit cú khả năng kớch thớch sự phỏt triển của cõy lỳa, hoặc lạc bằng cỏch tăng cường khả năng chống bệnh và quang hợp Hơn nữa, theo cụng bố mới đõy oligoglucosamin cú ảnh hưởng đến tăng trưởng, phỏt triển của bắp cải, năng suất cõy bắp cải tăng lờn 20 % [29]
Sau đõy là cỏc thành tựu ứng dụng của chitin/chitosan trong nụng nghiệp của một số quốc gia:
ở Thỏi Lan chitin/chitosan được dựng để cải tạo đất và nước, mục đớch giữ sinh thỏi canh tỏc Chitin/chitosan đúng vai trũ như là thành phần kớch thớch hoạt tớnh sinh học, làm tăng năng suất, sản lượng cõy trồng và vật nuụi Kết quả cho thấy, năng suất lỳa tăng lờn, lượng phõn bún giảm đi Chitin/chitosan tỏc
Trang 28Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
nam vàng là mầm bệnh ở ngụ [30] Hơn nữa chitosan oligome khi phun lờn
cõy làm xanh lỏ và làm tăng chiều cao của cõy lỳa
Kết quả thực tế ở Myanmar cho thấy năng suất lỳa vụ màu tăng từ
41.7% lõn 91.5% [28] Một bằng chứng khỏc là với nồng độ 40 ppm
oligoglucosamin làm tăng cường lượng điệp lục tố (chlorophyll) trong lỏ và lượng nốt sần chứa nitơ, năng suất cõy lạc tăng từ 19.34% đến
40.65%.[26.30]
1.2.3 Điều chế
Việc điều chế chitosan khối lượng phõn tử thấp là phương phỏp hiệu quả để mở rộng ứng đụng của chitin/chitosan
Một số phương phỏp điều chế chitin/chitosan khối lượng phõn tử thấp: phương phỏp thuỷ phõn hoỏ học, phương phỏp thuỷ phõn enzym, phương phỏp chiếu xạ
1.2.3.1 Phương phỏp chiờu xạ
Quy trỡnh chiộu xa dộ thuy phan chitosan:
Chitosan b6t đúng gúi bằng polyetylen, được chiếu xạ với nguồn tia
+Co'” (coban), tốc độ chiếu 1,4 kGy/h, liều chiếu xạ tir 10-500 kgy Chitosan
sau khi chiếu xạ được làm trương nở trong nước (100g chitosan/1 lớt H;O) trong 30 phỳt
Sau đú thờm axit axetic 1N, khuấy trong 4 giờ cho tan hoàn toàn
Tiến hành trung hoa bang natribicacbonat 0,5M, pH dung dich = 6
(Dựng H;O; để khử màu của sản phẩm và cỏc sản phẩm khỏc trong quỏ trỡnh chiếu xạ)
Tiến hành phõn tỏch: kết tủa bằng dung dịch etanol, sau đú lọc thu được
hai đạng sản phẩm: phần kết tủa và phần nước lọc Phần kết tủa:rửa bằng metanol và làm khụ
Trang 29
Phần nước trong được cụ đặc lại, kết tủa và đem lọc thu hồi sản phẩm
Tiến hành đo độ nhớt(n) đồng thời xỏc định khối lượng phõn tử trung bỡnh (My) cua sản phẩm [35]
Ershow và cỏc đồng sự đó đề xuất cơ của quỏ trỡnh chiếu xạ [36] R-H DR (C4 - C6) + H' (1)
R-H +H DR‘ (C1-C6) +H, (2) R' (C1 - C4) > Fl+F2 (3) R-NH; +H'>R' (C2) + NH; (4)
Trong đú R-H và R-NH; là cỏc phõn tử chitosan khối lượng phõn tử lớn R(Cn) là gốc chitosan khối lượng phõn tử lớn nằm trong nguyờn tử cacbon Cn và F1 và F2 là phần của chuối chớnh Sau khi bị bẻ gẫy, độ nhạy chiếu xạ của phõn tử polyme cho trước cú thể đựơc đỏnh giỏ từ hiệu suất depolyme chiếu xạ của nú
Phương trỡnh của Charlesby Pnner [4]
1 1 =Gd.1,04.107”.D
Mn Mno
Trong đú Mn là khối lượng phõn tử trung bỡnh cú số của chitosan ở liều
lượng hấp thụ được D và Ms là khối lượng phõn tử số của chitosan ban dau Kết quả chiếu xạ cho thấy chitosan 8B (DD = 99%) thi nhay cam hon vội phương trỡnh chiếu xa so với 10B (DD = 90%) [4]
Ưu điểm của phương phỏp là khụng cú dư lượng hoỏ chất nờn sản phẩm cú độ tỉnh khiết cao
Nhược điểm của phương phỏp là yờu cầu cú thiết bị đặc biệt, hiệu quả cắt mạch kộm hơn so với phương phỏp hoỏ học
Phương phỏp chiếu xạ phự hợp cho sự phõn huý cỏc loại polyme khỏc
Trang 30Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
1.2.3.2 Phương phỏp thuỷ phõn bằng enzym
oh oh 0 hel ọ ————*> 409C 0 o ho r r ho n m n>>m
Sơ đỗ5: tổng quỏt quỏ trỡnh thuỷ phõn bằng enzym
R=NHCOCH;; NH;
Cú tới hơn 30 loại enzym cú thể sử đụng để phõn huỷ chitin/chitosan: chitosanaza, aminaza, hemicellulaza, cellulaza, papain, lyoyme, pepsin
Trong d6 pepsin, papain, pectinaza cú tỏc nhõn lytic tốt hơn cỏc loại enzym khỏc và cú hiệu quả cắt mạch polyme cao nhất là sử dụng pecfinaza [7] Phương phỏp thuỷ phõn bằng enzym cho phộp thu được sản phẩm cú rất ớt dư lượng hoỏ chất, nờn rất phự hợp sử dụng trong y học Vấn đề mở rộng quy trỡnh sản xuất cũn cú nhiều khú khăn Trong số cỏc loại enzym được sử dụng loại hemicellulaza cú giỏ thành rẻ hơn cả
Quỏ trỡnh thuỷ phõn bằng enzym: Chitosan được hoà tan trong axit axetic 1% -2% khuấy trong 3giờ, điều chỉnh pH=5,5 Để qua đờm, sau đú đặt
vào bể ồn nhiệt (50°C với hemicellulaza) hay tủ 4m (37°C vội pectinaza) Cho
dung dịch enzym vào, lượng enzym được tớnh theo số gam chất tan (chitosan) Dừng phản ứng cắt mạch sau 3- 30 giờ (tuỳ từng loại enzym) bằng cỏch đun sụi dung dịch phản ứng trong 10 phỳt dộ tỏch bỏ enzym Tiến hành lọc, dung
dịch sau khi lọc được trung hoà bằng NaOH 10%, pH =9 Tiến hành ly tõm
phần kết tủa, rửa sản phẩm kết tủa bằng etanol nhiều lần Sản phẩm lại được tỏch bằng sắc kớ lỏng cao ỏp HPLC để phõn đoạn
Trang 31
Quỏ trỡnh thuỷ phõn khi cú mặt của pctinzana (chiết từ năm cỳc mầu nõu sẵm) pH=3, nhiệt độ 37°C làm cho độ nhớt của dung dịch giảm nhanh.Oligome thu được trong quỏ trỡnh này cú khối lượng phõn tử đao động
trong khoảng 20.000-50.000 Da [7] Chitosan khối lượng phõn tử thấp cú độ
kết tỉnh cao hơn và da hinh hon chitosan [16]
1.2.3.3 Phương phỏp hoỏ học
* Phương phỏp thuỷ phõn axit:
Chitosan đựoc hoà tan trong axit HCI loóng (0,5%) với nụng độ
pụlyme 1% - 1,5% khuấy ở 65 °C -100°C trong 3 giờ Sau đú đề nguội đến
nhiệt độ phũng Dựng NaOH để trung hoà (đến pH =8) Tiến hành lọc kết tủa thu được rửa nhiều lần bằng etanol, sau đú làm khụ bằng axeton Phần nước
trong được tỏch muối bằng metanol sau đú cụ đặc lại và kết tủa trong etanol
để thu được sản phẩm tan trong nước Cỏc nghiờn cứu cho thấy độ polyme hoỏ DP phụ thuộc nồng độ axit HCI Khi đựng axit HCI đặc núng thu được sản phõm cú DP=2-2,5, khi dựng axit HCI (0.5%) loóng thu được sản phõm
cú DP ~30
Cỏc loại axit vụ cơ được sử dụng như HCI, H;SO¿, H;PO¿, HNO:
Trong đú axit clohydric được nghiờn cứu nhiều hơn cả Do giỏ thành HCI và
khi trung hoà bằng NaOH, sản phẩm phụ là NaCl khụng độc, dễ tỏch
Trang 32Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
"=> đ^— WPS
Tec @ tii hin HạO
(Rate-limiting) wv
Se ori
+ +
HO Ho“
oO Ơ
Sơ@đọ minh ho! cơ chếph#fn ứng của thu ph@n axit liSn kẾ? glycosid của chỉtosan
Cơ ch ù c chẫD nhẩẫn của qui, trxnh thu ph IiSn k glyCosid (phn @ng Gy1)
HOHzC O HOHzC ` ơ>^ ˆ_—_ H H Ho a HạO_ H* HạO—D —OH DI Hạơằo OH
Ca chOthud ph@ li?n K@ N-acetyl (ph fn ang G2)
+ Thuy phan bang axit HNO,
HOH;C NHR OT REDO m7 Lf HOH;C H;* nois€ R=H, GIcN, GleNẹNAc R =H, Ac Chitosan NaNO, HOH,C HOMẸ O NHR HO —0⁄ NOL T—o NHR HOH;C
R=H, GIcN, GlcNAc ` R=H, GIcN, GleNAc
R =H, Ac R =H, Ac
Sơ đồ 6: Cơ chế của quy trỡnh cắt mach chitosan bang axit HONO
Trang 33
e_ Điều chế oligome N-acetyl hoỏ hoàn toàn
Chitosan c6 Fa = 0,59 [n] = 826 mL/g , 500mg HCl duoc hoa tan trong
30 ml 2,5% v/v AcOH Oxy hoà tan được chuyển nhờ cỏc bột khớ N; qua
dung dịch trong 5 phỳt Sau khi làm lạnh đến 4°C, dung dịch mới pha chế
NaNO; (1,5 mmol được cho thờm vào), và phản ứng được thực hiện trong 12
giờ ở 4°C trong búng tối và khụng cần khuấy trộn Sản phẩm được ly tõm (trong thời gian 10 phỳt tốc độ ly tõm khoảng 5000 v/phỳt) sau đú tiến hành lọc (8 ml) để tỏch phần oligome khụng tan trước khi làm đụng khụ
e_ Điều chế oligome N-deacetyl húa hoàn toàn
Chuan bi dung dich chitosan (F, < 0,001, [n] = 283 ml/g, 500 mg, HCI) Và quỏ trỡnh phõn huỷ hay cắt mạch bằng HNO; được tiến hành như với mẫu 1, chỉ khỏc là tỷ lệ của unit -D đối với NaNO, được giảm xuống đến 0,45 (1,13 mmol NaNO;) Toàn bộ oligome thu được đều tan trong nước ở giỏ trị pH thấp
+ Thu) phõn bằng axit H;PO,
Chitosan từ vỏ tụm cua hay mai mực cú độ acetyl hoỏ DA khoảng 25%
(xỏc định bằng phú 'H-NMR)
Quy trỡnh và cỏc điều kiện thuỷ phõn dựa trờn cơ sở như quy trỡnh thuỷ phõn xenlulụzơ Cho 5 gram mẫu chitosan vào bỡnh thuỷ tinh nỳt nhỏm cú thể tớch 300 ml với 100 gram dung dịch acid HạPO, 85% Khuấy giỏn đoạn và để kộo dài 1-2 ngày ở điều kiện nhiệt độ thường cho tan hoàn toàn chitosan và
thu được dung dịch nhớt màu nõu Dung dịch này lại được để ở nhiệt độ
thường trong vũng 1- 6 tuần Sau đú tiến hành tỏi sinh chitosan bằng cỏch kết tủa trong etanol dư Hỗn hợp này được khuấy trong | ngay Axit phosphoric tự do được tỏch khỏi etanol bằng cỏch chiết và axit phosphoric tạo dạng muối với nhúm aqmin sẽ được tỏch bằng cỏch lặp lại quy trỡnh xử lý với etanol cú
Trang 34Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
EtOH Phần khụng tan được tỏch khỏi phần kết tủa bằng cỏch chiết với 1000 ml nước ở nhiệt độ thường trong 2 ngày Phần khụng tan trong nước được xử lý với dung địch 1%NaOH để tỏch hoàn toàn cỏc ion phosphate và rồi lại tiến hành rửa nhiều lần bằng nước cho sạch Sau đú phần chitosan khụng tan này được thu hồi nhờ quy trỡnh lọc hỳt chõn khụng Mặt khỏc, phần tan trong nước được cụ đặc lại bằng thiết bị bốc bay, sau đú tiến hành kết tủa trong EtOH Phan kột tuả cũng được xử lý với Etanol cú bố sung 1% triethylamin Tiếp tục rửa sạch nhiều lần với EtOH bằng thiết bị ly tõm Phần chitosan tan trong nước cú DP thấp này được thu hồi lại sau khi sấy khụ trong tủ sấy chõn
khụng
Trang 35
5% Dung dich chitosan 5% trong 85% H3PO, Cho 1-6 tuần
EtOH
Kết tủa
Phần tan trong nước
ị
Phõn đoạn khụng tan Phõn đoạn tan trong nước
EtOH
Xu ly wee NaOH 1% SP
Rửa với nước Xử lý bằng amin EtOH
Say PP Rửa T EtOH
Phần chitosan khụng tan trong nước Đụng khụ
ị
Phần chitosan tan trong nước Sơ đề 7: điều chế chitosan khối lượng phõn tử thấp bằng cỏch thuỷ phõn
đồng thể trong acid phosphoric 85%
Cú nhiều loại axit vụ cơ được sử dụng như HCI, H;ạSO,, H;PO¿, HNO¿: Trong đú axit clohydric được nghiờn cứu nhiều hơn cả Do giỏ thành
HCI và khi trung hoà bằng NaOH, sản phẩm phụ là NaCl khụng độc, dễ tỏch
* Phương phỏp oxi hoỏ cắt mạch bằng tỏc nhõn HO; [8]
Fang, Sun, Salisbury, Fowler (1999) đưa ra cơ chế quỏ trỡnh cắt mạch
trong hệ chitosan và HO; như sau:
Trang 36Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp R-NH; + H' =R-NH;? (1) HO, = H* + HOO” (2) Tổng hợp hai phản ứng (1) (2) ta cú phản ứng (3): H;O;+ R-NH; + H* =R-NH; + HOO +H* (3)
HOO khụng bền đễ bị phõn huỷ tạo nhúm —OH hoạt động mạnh
HOƠ > OH +0" (4)
Xay ra phản ứng thứ 5
H;O; + HOO' > HO' + O; + H;O; (5)
HOlà gốc oxi hoỏ mạnh, phản ứng chủ yếu của HO'vội polysaccarrit
được chứng minh là mất bớt hydro Nú phản ứng với cacbonhydrat rất nhanh
và phản ứng như phương trỡnh:
(GlcN)m- (GIcN), + OH'> (GIcN)m— (GIcN)m + H2O (GlcN)m - (GICN)m + H20 >(GlcN) m+ (GICN)n
HO lấy một nguyờn tử H để tạo thành H;O Trong khi xử lý và điều chế R-NH; cú xu hướng phản ứng với H” để tạo thành R-NH; làm cho nồng độ
iụn H” giảm xuống tức là pH tăng lờn Thờm vào đú HOO' bị phõn huỷ nhanh
chúng thành HƠ Điều đú cú ý nghĩa là HạO; liờn tục bị phõn huỷ trong phương trỡnh (3) những gốc này cũn cú phản ứng nhanh hơn nữa để hỡnh thành sản phẩm oxi hoỏ tan trong nước cú khối lượng phõn tử thấp Nghiờn cứu phổ FT-IR cho thấy khụng cú sự thay đổi trong cấu trục của chuỗi
chitosan trong quỏ trỡnh cắt mach chitosan bang HOằ,
Trang 37
Chương 2: Thực nghiệm
2.1 Nguyờn liệu, hoỏ chất, dụng cụ
2.1.1 Nguyờn liệu
Mai mực ống thu mua ngoài thị trường hoặc từ cỏc cơ sở chế biến thuỷ
hải sản.Cỏc loại húa chất chớnh: NaOH, HCI, CH:COOH, H;O;, C;H:OH đặc
(96%), nước cất
2.1.2 Thiết bị dụng cụ chớnh
May đo phổ IR Impact 410 (Đức), mỏy phõn tớch nhiệt Shimadzu TGA
- 500H (Nhật) đo phụ TGA của Viện Hoỏ Học - Viện Khoa học và Cụng nghệ
Việt Nam, mỏy đo nhiễu xạ X-ray Simens D5000 của Viện Khoa học vật liệu
- Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam, mỏy khuấy từ, tủ hỳt, bỡnh cầu,
nhiệt kế, bỡnh tam giỏc, Ubbelote, pipột, bỡnh thủy tinh dung tớch 1000ml và một số dụng cụ thuỷ tinh thụng thường khỏc
2.2 Quy trỡnh cụng nghệ tỏch - chitin * Sơ đồ tỏch B - chitin từ nguyờn liệu mai mực ống
Mai mực thu về, rửa sạch, loại bỏ tạp chất, say khụ, làm nhỏ Thu được mai mực ống sạch cú kớch thước 0,5 - 1 cm, sau đú tiễn hành tỏch B -chitin theo so dộ:
Tach loai protein - Nguyờn liệu đó
(NaOH 8%, nhiệt Mai mực ụng sạch > ue : > loại bỏ protein độ phũng, 48 giờ) Vv
Rửa nhiều lần Nguyờn liệu Tỏch loại muối
bằngnước |#“——| đóloạbỏ | khoỏng (HCI 7%)
muối
Vv
Phơi khụ —— „| Sản phẩm f- chitin
Trang 38
Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
Sơ đồ 1: Quy trinh tach B - chitin
* Quy trinh tach B - chitin tt mai muc ống thực hiện như sau:
Cõn Ikg mai mực ống khụ đó làm sạch, ngõm trong dung dịch NaOH 8% voi tỷ lệ rắn: lỏng là 1:10 để ở nhiệt độ phũng trong 48 giờ Rửa mai mực bằng nước nhiều lần trờn mỏy giặt Sanyụ đến pH = 7 Sau đú ngõm axit HCI 7% với tỷ lệ rắn: lỏng là 1:10, Rửa mẫu bằng nước nhiều lần bằng nước đến pH =7 Lap lai quỏ trỡnh trờn 2 lần để loại bỏ hết muối khoỏng và protein
Phơi khụ sản phẩm ở nhiệt độ phũng, rồi sấy ở nhiệt độ 40°C đến khối lượng
khụng đổi thu được sản phẩm rắn, màu trắng, xốp, khụng tan trong nước
Xỏc định khối lượng sản phẩm để tớnh tỷ lệ chitin trong nguyờn liệu theo cụng thức: 8 chitin (Yo) = “““tm x 100%
m
Trong 46: 8 chitin 1a ham lugng chitin co trong mau nguyộn liộu (%) M chitin 1 khội lượng sản phẩm chitin thu duge (g)
m, 1a khội lượng nguyờn tử ban đầu (g)
2.3 Quy trỡnh điều chế - chitosan
Quỏ trỡnh deaxetyl hoa chitin thành chitosan dựa trờn nguyờn tắc dựng NaOH nụng độ cao kết hợp với nhiệt độ dộ cắt đứt liờn kết N-C trong nhúm axetamit (-NHCONH;) của chitin Phản ứng xảy ra theo sơ đồ:
Deaxetyl húa (NaOH 30%,
ngõm 2 ngày + 65 giờ (65°C)
— Tinh chộ (AcOH Chi
Chitosan sach |, 0,1M, lọc, kết tủa, itosan
Chitin sach Vv rửa)
Sơ đề 2: Quy trỡnh điều chế B- chitosan
Trang 39
2.3.1 Điều chế chitosan
Ngõm 350g 8 - chitosan cho vao dung dich NaOH 30% với tý lệ rắn: long 1a 1:5 trong khoảng 48 giờ ở nhiệt độ phũng Sau đú đem dun ở nhiệt độ 65°C trong khoảng 3 giờ, để nguội, rửa sản sạch phõm bằng nước cho đến khi
độ pH =7, phơi khụ hoặc say 6 nhiột d6 40°C 2.3.2 Tinh chộ chitosan
Quỏ trỡnh tỉnh chế chitosan được tiến hành theo cỏc bước sau:
*đ Bước l: Hoà tan chitosan trong dung dịch axit axetic CH;COOH 0,1M, khuấy đều hỗn hợp trờn mỏy khuấy từ cho đến khi dung dịch đồng nhất
* Bước 2: Lọc dung dịch chitosan để loại bỏ tạp chất Trước hết dung
dịch được lọc hỳt nước chõn khụng qua phộu loc xốp (cỡ 4 wm) Sau do loc qua màng xenlulo nitrate với lần lượt cỏc cỡ 8,0; 3,0; 1,2; 0,8 và 0,4 pum
ô Bước 3: Trung hoà dung dịch sau khi lọc dựng mỏy pH-met nối với mỏy khuấy từ Dựng dung dịch NaOH 10- 15% đề tăng dần pH của dung dịch chitosan Khi pH tăng lờn đến 6, chitosan bắt đầu bị kết tủa Điều chỉnh pH đến khoảng pH > 7,1
* Bước 4: Lọc tỏch kết tủa bằng lọc hỳt nước chõn khụng Rửa hỗn hợp
thu được bằng hỗn hợp cồn/nước với tỷ lệ lần lượt 70/30, 80/20, 90/10, 100/0
theo thộ tich Chitosan sạch được đề khụ chõn khụng ở nhiệt độ phũng
Sau khi tinh chế, làm khụ, cõn sản phẩm để tớnh hiệu suất phản ứng
deaxetyl hoỏ theo cụng thức:
G(%) = -” x100
mo
Với: m là khối lượng sản phẩm phản ứng đeaxetyl húa (g)
Trang 40Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2 Khoỏ luận tốt nghiệp
2.3.3 Khảo sỏt sản phẩm chitosan bằng phương phỏp
húa lý
Cõn mẫu chitosan với một lượng vừa đủ, đem say khụ ở 100°C đến
khối lượng khụng đối Đem mẫu đi chụp phổ IR, phổ nhiễu xạ X-ray, phố phõn tớch nhiệt TGA
2.4 Quy trỡnh điều chế - chitosan khối lượng phõn tử thấp
Quỏ trỡnh cat mach B - chitosan thanh B - chitosan khối lượng phõn tử
thấp dựa trờn nguyờn tắc dựng HO; kết hợp với nhiệt để cắt đứt liờn kết
8(1—>4) glucozit trong mạch chitosan Phản ứng xảy ra theo sơ đồ sau:
: Depolyme hoỏ Chitosan poly LMWC ằ (HCI 0.5%; "| 40°C; 6giờ
Sản phẩm _ề Lăng, lọc, rửa, |_ 7 ; Trung Tung hoa hoa
LMWC sạch làm khụ pH=8-9
Sơ đồ 3: Quy trỡnh điều chế chitosan khối lượng phõn tử thấp
Can 1g chitosan cho vao 100ml dung dich HCl 0,5% Dat lờn bộp
khuấy từ, khuấy cho tan hoàn toàn, tăng nhiệt độ của dung dich lộn 40°C, cho
HạO; vào để nồng độ H;O; đạt 2M, duy trỡ nhiờt độ đú trong vũng 6giờ Hết
thời gian trung hoà bằng NaOH đề pH dung dịch khoảng 8-9 Đề lắng và lọc lẫy phần kết tủa Rửa kết tủa bằng etanol 96% với tỷ lệ răn: lỏng là 1:3, kết tủa được lọc qua phễu chõn khụng (thao tỏc này lặp lại 3 lần) Sau cựng
chitosan khối lượng phõn tử thấp (LMWC) được làm khụ tương đối ở nhiệt độ phũng rồi sấy khụ ở nhiệt độ 60°C Cõn khối lượng sản phẩm thu được